Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح من المجلس الدنماركي للبحوث المستقلة - العلوم الطبية (FSS8020-00288B) ومؤسسة نوفو نورديسك (NNF160C0023046). تم دعم هذا العمل أيضا من خلال منحة بحثية إلى راسموس كيوبستيد من الأكاديمية الدنماركية للسكري ، والتي تمولها مؤسسة نوفو نورديسك ، رقم المنحة NNF17SA0031406. يود المؤلفون أن يشكروا كارينا أولسن وبيتينا بولمغرين وإيرين بيش نيلسن (قسم التغذية والتمارين الرياضية والرياضة ، كلية العلوم ، جامعة كوبنهاغن) على مساعدتهم التقنية الماهرة.

وينبغي تنفيذ الإجراءات المتعلقة بحيوانات البحث وفقا للمبادئ التوجيهية ذات الصلة والتشريعات المحلية. وتمتثل جميع التجارب على الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة للاتفاقية الأوروبية لحماية الحيوانات الفقارية المستخدمة لأغراض تجريبية وأغراض علمية أخرى، ووافقت عليها مفتشية التجارب الحيو...

التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية مهم للحفاظ على الصحة العامة1. وبالتالي ، فإن التحقيق في امتصاص الجلوكوز في العضلات غالبا ما يكون بمثابة قراءة أولية عند تقييم مختلف التدخلات التي تغير الصحة. هنا نصف طريقة خارج الجسم الحي لقياس امتصاص الجلوكوز في النعل المع...

تمتلك العضلات الهيكلية القدرة على استخراج كميات كبيرة من الجلوكوز من الفضاء خارج الخلية استجابة للأنسولين وممارسة الرياضة. هذا يساعد على الحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله ويؤمن إمدادات الجلوكوز خلال أوقات ارتفاع الطلب على الطاقة. نظرا لأن التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية قد ثبت أنه مهم للصحة العامة والأداء البدني 1,2 ، فقد حظيت قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات خلال ظروف مختلفة بالكثير من الاهتمام. في البشر والحيوانات ، تم استخدام المشبك مفرط الأنسولين وسكر الدم كتقنية قياسية ذهبية لتقييم حساسية الأنسولين في الجسم الحي 3,4. على النقيض من النتائج التي تم الحصول عليها من اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم ، فإن تقنية المشبك المفرط في الأنسولين وسكر الدم لا تتطلب وظيفة الجهاز الهضمي سليمة أو إفراز الأنسولين من البنكرياس ، وبالتالي تسمح بمقارنة استجابات الأنسولين بين الأشخاص الذين يظهرون اختلافات في وظيفة المعدة والأمعاء و / أو البنكرياس. تم إجراء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي أثناء التمرين في البشر بشكل متكرر منذ 1960s5. أولا باستخدام تقنيات التوازن الشرياني الوريدي6 وبعد ذلك باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) بالاشتراك مع البوزيترون الذي ينبعث منه الجلوكوز التناظري على سبيل المثال 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. في القوارض ، عادة ما يتم امتصاص الجلوكوز في العضلات المحفزة للتمرين في الجسم الحي عن طريق استخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من الجلوكوز المسمى بالنظائر8،9،10.
طريقة مكملة لقياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات في الجسم الحي ، هي عزل واحتضان العضلات الصغيرة من القوارض وبالتالي قياس امتصاص الجلوكوز باستخدام نظائرها المشعة أو المستقرة من نظائر الجلوكوز11،12،13. تسمح هذه الطريقة بتحديد كمي دقيق وموثوق به لمعدلات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة ويمكن إجراؤها في وجود تركيزات الأنسولين المختلفة وأثناء الانقباض الناجم عن التحفيز الكهربائي. الأهم من ذلك ، أن قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة ذات أهمية عند التحقيق في النمط الظاهري الأيضي للعضلات للفئران التي خضعت لتدخلات مختلفة (مثل التغذية والنشاط البدني والعدوى والعلاجات). نموذج العضلات الهيكلية المعزولة هو أيضا أداة مناسبة لاختبار المركبات الدوائية التي قد تؤثر على امتصاص الجلوكوز في حد ذاته و / أو تعديل حساسية الأنسولين12,14. وبهذه الطريقة ، يمكن اختبار وتقييم فعالية المركبات المصممة لتنظيم استقلاب الجلوكوز في العضلات في بيئة عالية التحكم قبل الاختبار اللاحق في الجسم الحي في النماذج الحيوانية قبل السريرية.
في ظل بعض الظروف ، قد تشكل الجدوى الأيضية تحديا في نظام نموذج العضلات الهيكلية المعزولة والمحتضنة. في الواقع ، فإن عدم وجود نظام الدورة الدموية في العضلات المحتضنة يستلزم أن تسليم الركائز (مثل الأكسجين والمواد المغذية) يعتمد بشكل كامل على الانتشار البسيط بين ألياف العضلات والبيئة المحيطة. فيما يتعلق بذلك ، من المهم أن تكون العضلات المحتضنة صغيرة ورقيقة ، وبالتالي ، تمثل حاجزا أقل أمام انتشار الأكسجين أثناء الحضانة15. خاصة أثناء الحضانة المطولة لعدة ساعات ، قد تتطور حالات نقص الأكسجين بسبب عدم كفاية إمدادات الأكسجين مما يؤدي إلى استنفاد طاقة العضلات15. على الرغم من أنه تم الإبلاغ سابقا عن علامات مختلفة للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران المحتضنة إلى جانب تحديد المتغيرات المهمة التي تساعد على الحفاظ على صلاحية عضلات الفئران15 ، إلا أنه لا يزال هناك ما يبرر إجراء تقييم شامل للصلاحية الأيضية في عضلات الفئران الصغيرة المحتضنة. وبالتالي ، في الوقت الحاضر ، تم استخدام محتوى الجليكوجين بشكل رئيسي كعلامة على الجدوى الأيضية في العضلات الهيكلية للفأر المحتضن16,17.
هنا نصف بروتوكولا مفصلا لقياس امتصاص الجلوكوز القاعدي والأنسولين والانكماش في النعل المعزول والمحتضن وعضلات EDL من الفئران باستخدام [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. في هذه الدراسة ، تم قياس امتصاص الجلوكوز خلال فترة 10 دقائق ويتم تقديم الطريقة باستخدام تركيزات الأنسولين دون الحد الأقصى والحد الأقصى من الفعالية بالإضافة إلى بروتوكول انكماش واحد. ومع ذلك ، يمكن بسهولة تعديل البروتوكولات الموضحة هنا فيما يتعلق بوقت الحضانة وجرعة الأنسولين وبروتوكول التحفيز الكهربائي. علاوة على ذلك ، نقدم توصيفا شاملا لعلامات مختلفة من الجدوى الأيضية في النعل المحتضن وعضلة الفأر EDL. تشير النتائج إلى أن مكملات الجلوكوز في مخزن الحضانة العازل ضرورية للحفاظ على الجدوى الأيضية للعضلات المحتضنة لمدة 1 ساعة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

العضلات الهيكلية هي نسيج مستجيب للأنسولين وعادة ما تستهلك معظم الجلوكوز الذي يدخل الدم بعد الوجبة. علاوة على ذلك ، فقد أفيد أن العضلات الهيكلية قد تزيد من استخراج الجلوكوز من الدم بنسبة تصل إلى 50 ضعفا أثناء التمرين مقارنة بظروف الراحة. تعتمد الزيادة في امتصاص الجلوكوز في العضلات أثناء التمرين وتحفيز الأنسولين على نقل ناقل الجلوكوز 4 (GLUT4) من المقصورات داخل الخلايا إلى غشاء سطح الخلية العضلية ، وكذلك فسفرة الجلوكوز إلى الجلوكوز 6-فوسفات بواسطة هيكسوكيناز II. عزل وحضانة عضلات الفئران مثل m. soleus و m . extensor digitorum longus (EDL) هو نموذج مناسب خارج الجسم الحي لدراسة آثار الأنسولين والانكماش الناجم عن الكهرباء (نموذج للممارسة) على امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة. وبالتالي ، فإن نموذج خارج الجسم الحي يسمح بتقييم حساسية الأنسولين العضلية ويجعل من الممكن مطابقة إنتاج قوة العضلات أثناء الانقباض مما يضمن التوظيف الموحد لألياف العضلات أثناء قياسات امتصاص الجلوكوز في العضلات. علاوة على ذلك ، فإن النموذج الموصوف مناسب لاختبار المركبات الدوائية التي قد يكون لها تأثير على حساسية الأنسولين في العضلات أو قد تكون مفيدة عند محاولة تحديد التعقيد التنظيمي لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية.
هنا نصف ونقدم بروتوكولا مفصلا حول كيفية قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في المستحضرات المعزولة والمحتضنة للعضلات EDL من الفئران باستخدام الملصقات الإشعاعية [3H] 2-deoxy-D-glucose و [14C] مانيتول كعلامة خارج الخلية. هذا يسمح بإجراء تقييم دقيق لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية الناضجة في غياب العوامل المربكة التي قد تتداخل مع النموذج الحيواني السليم. بالإضافة إلى ذلك ، نقدم معلومات حول الجدوى الأيضية للعضلات الهيكلية للفئران المحتضنة مما يشير إلى أن الطريقة المطبقة تمتلك بعض المحاذير في ظل ظروف معينة عند دراسة استقلاب طاقة العضلات.

كما هو موضح في الشكل 2 ، كانت معدلات امتصاص الجلوكوز القاعدي متشابهة بين النعل المعزول وعضلة EDL من الفئران الإناث. وقد تم الإبلاغ عن هذا أيضا عدة مرات قبل12،13،19،20. زاد امتصاص الجلوكوز بم?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

التنظيم السليم لامتصاص الجلوكوز في العضلات مهم للحفاظ على توازن الجلوكوز في الجسم كله. يقدم هذا البروتوكول تقييما لامتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة عند تحديد تأثير التدخلات الفسيولوجية المختلفة على استقلاب الجلوكوز في الجسم كله.

قياس امتصاص الجلوكوز المحفز بالأنسولين والانكماش في العضلات الهيكلية الناضجة المعزولة والمحتضنة من الفئران

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

نموذج خارج الجسم الحي هو طريقة مفيدة لتقييم تأثير التدخلات الفسيولوجية المختلفة والمركبات الدوائية وامتصاص الجلوكوز في العضلات. تسمح هذه التقنية بإجراء تقييم دقيق لامتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية للفأر المعزول في حالة عدم وجود عوامل مربكة قد تتداخل في نموذج حيواني سليم. قبل البدء في التجربة ، قم بتشغيل نظام السيرة الذاتية المتكامل لشريط العضلات وقم بتسخين الغرف إلى 30 درجة مئوية.افتح برنامج جمع البيانات وقم بمعايرة محولات الطاقة القسرية لضمان إمكانية المقارنة بين مجموعات البيانات. أضف أربعة ملليلترات من وسط الحضانة القاعدية 30 درجة مئوية الذي تم تسخينه مسبقا إلى كل غرفة حضانة وتأكد من أن الوسط مؤكسج باستمرار بنسبة 95٪ أكسجين و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. ضع الماوس في وضع الانبطاح على صينية تشريح وتأكد من عدم الاستجابة لرد فعل الدواسة.ثم قم بتثبيت مخلب أمامي واحد بإبرة. استخدم المقص لإزالة الجلد من أسفل الساق حتى يصبح كل من وتر العرقوب ومفصل الركبة مرئيين. لتشريح العضلة الوحيدة، قم بتوصيل حلقة خياطة واحدة قطرها 0.4 سم محضرة من قطعة خياطة نايلون جراحية غير قابلة للامتصاص بطول 16 سم إلى وتر العرقوب وقم بتأمين ملقط العرقوب على وتر العرقوب بشكل بعيد إلى الحلقة.قطع لتحرير العضلات النعل و gastrocnemius من مخلب وتحريك ملقط peen بعناية عبر الماوس لفضح العضلات الوحيدة. ثبت ملقط البينات وضع حلقة خياطة ثانية حول الوتر القريب للعضلة الوحيدة. قطع الوتر القريب وتشريح النعل بما في ذلك حلقتي خياطة المرفقتين خالية من عضلة المعدة والأوعية الدموية.عند الجمع ، استخدم الحلقات لربط عضلة النعل بسرعة بالخطافات المعنية في إحدى غرف الحضانة. استخدم الملقط لإزالة اللفافة التي تغطي العضلة الأمامية للظنبوب. يجب أن تكون الأوتار البعيدة للعضلات الأمامية أو EDL بيضاء صافية ومرئية ومنفصلة عن بعضها البعض.قطع وتر تقطير العضلة الأمامية الظنبوب وتشريح العضلات. استخدم الملقط لتحرير عضلة EDL بلطف من الأنسجة المحيطة بها ، مع ترك العضلات سليمة دون قطع الأوتار. ضع حلقات خياطة فردية حول أوتار التقطير وأوتار EDL القريبة.عندما يتم وضع الحلقات ، قم بقطع الأوتار لتحرير عضلة EDL مع حلقات الخياطة المرفقة وقم بتوصيل الحلقات بسرعة بالخطافات في غرفة الحضانة الثانية. ثم اضبط توتر الراحة لكل عضلة على ما يقرب من خمسة مللي نيوتن واسمح للعضلات بالتوازن في الوسط لمدة 10 دقائق على الأقل قبل بدء التجربة. لقياس امتصاص الجلوكوز المحفز للأنسولين ، استبدل وسط الحضانة القاعدي في الغرف بوسط الحضانة بدون الأنسولين ، أو تركيز الأنسولين الفعال دون الحد الأقصى ، أو تركيز الأنسولين الفعال إلى أقصى حد لمدة 20 دقيقة.في نهاية فترة التحفيز ، استبدل وسط الحضانة بوسط حضانة امتصاص الجلوكوز الذي يحتوي على تركيز مماثل من الأنسولين لمدة 10 دقائق. في نهاية حضانة امتصاص الجلوكوز ، قم بإزالة العضلات بعناية من غرف الحضانة واغسل العينات في وسط حضانة القاعدية الباردة الثلجية. بعد الغسيل ، جفف العضلات بسرعة على ورق الترشيح وقم بتجميد الأنسجة دون حلقات خياطة في النيتروجين السائل.ثم جمع 100 ميكرولتر من وسط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة لتخزين 20 درجة مئوية وتحليل امتصاص الجلوكوز في العضلات. لقياس امتصاص الجلوكوز المحفز للانقباض ، ضع أقطاب البلاتين مركزيا وعلى جانبي العضلات داخل غرف الحضانة ، وابدأ تقلص العضلات مباشرة بعد استبدال وسط الحضانة القاعدية بوسط حضانة امتصاص الجلوكوز. سجل الإنتاج القسري من كل عضلة محتضنة.بعد 10 دقائق ، قم بجمع العضلات وتجميدها بلطف كما هو موضح ، وتخزين 100 ميكرولتر من وسيط حضانة امتصاص الجلوكوز من كل غرفة لتحليل امتصاص الجلوكوز في العضلات كما هو موضح. لتحديد إشارات الخلايا العضلية عن طريق تحليل النشاف الغربي في نفس المجموعة من عينات العضلات ، قم بتجانس كل عينة عضلية مجمدة في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتجانس البارد على الجليد وقم بتدوير نهاية العينة على نهايتها لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية. ثم جمع الليسات عن طريق الطرد المركزي وقياس كمية البروتين ذات الأهمية داخل كل عينة البليت وفقا لبروتوكولات تحليل اللطخة الغربية القياسية.لقياس امتصاص الجلوكوز في كل عينة، أضف 150 ميكرولتر من الفائق من كل عينة و 25 ميكرولتر من وسط حضانة امتصاص الجلوكوز من غرف الحضانة المقابلة لفصل قوارير عد التلألؤ السائل التي تحتوي على ثلاثة ملليلترات من سائل التلألؤ السائل لكل قارورة. ثم قم بتحميل القوارير على عداد تلألؤ سائل وقياس النشاط الإشعاعي لاثنين من ديوكسي جلوكوز ومانيتول وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. في هذا التحليل التمثيلي ، كانت معدلات امتصاص الجلوكوز القاعدي متشابهة بين عضلات النعل و EDL المعزولة من الفئران الإناث.زاد امتصاص الجلوكوز في عضلات النعل و EDL استجابة لتركيزات الأنسولين الفعالة إلى أقصى حد وأقصى حد. علاوة على ذلك ، كان كل من الأنسولين دون الحد الأقصى والحد الأقصى لامتصاص الجلوكوز المحفز أعلى بكثير في العضلات الوحيدة. في المقابل، كان امتصاص الجلوكوز الناجم عن الانكماش أعلى بكثير في EDL مقارنة بالعضلات الوحيدة.هنا ، يمكن ملاحظة القوة العضلية القصوى المنتجة في عضلات النعل و EDL خلال فترة التحفيز التي تبلغ 10 دقائق. وكما هو متوقع، ولدت عضلة EDL المزيد من القوة خلال الجزء الأول من فترة التحفيز، تليها انخفاض سريع في وقت لاحق من فترة التحفيز. أدت تركيزات الأنسولين دون القصوى والقصوى إلى زيادة في فسفرة Akt threonine 308 و TBC1D4 Serine 588 ، في حين أدى الانكماش إلى زيادة في فسفرة AMPK Alpha threonine 172 و ACC serine 212.لم يؤد الأنسولين ولا الانكماش إلى تغيير في محتوى البروتين الكلي. قبل محاولة قياس امتصاص الجلوكوز في عضلات الفئران المعزولة ، من الضروري ممارسة تشريح عضلات النعل و EDL بدقة. بعد تقييم امتصاص الجلوكوز في العضلات ، يمكن استخدام تحلل بروتين العضلات المتبقي لإجراء تحليل كيميائي حيوي إضافي قد يوضح التغيرات الملحوظة في معدلات امتصاص الجلوكوز.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

في القياس الصغير تداول المجراة في الهيكل العظمي والعضلات التي البينية الحيوية الميكروسكوب

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

الميتوكوندريا من عزل العضلات والهيكل العظمي

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

تنقية الأسلاف من الهيكل العظمي والعضلات

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

مضان القائم على القياس من دخول الكالسيوم المتجر الذي يعمل في الخلايا الحية: من خلية السرطان مثقف على عضلة

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

فيفو السابقين تقييم من تعب، وانقباض في عضلات الهيكل العظمي تناوب متفرقة

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

تقييم الكالسيوم سباركس السليمة في ألياف العضلات الهيكلية

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

العزلة من الدم والأوعية المشتقة متعددة القدرات السلائف من العضلات الهيكلية البشرية

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

قياس السلس وظيفة العضلات في الأنسجة المعزولة حمام تطبيقات لأبحاث الصيدلة

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...