Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

这项工作得到了丹麦医学科学独立研究委员会（FSS8020-00288B）和诺和诺德基金会（NNF160C0023046）的资助。这项工作还得到了丹麦糖尿病学院向Rasmus Kjøbsted提供的研究资助，该基金由诺和诺德基金会资助，拨款编号为NNF17SA0031406。作者要感谢Karina Olsen，Betina Bolmgren和Irene Bech Nielsen（哥本哈根大学理学院营养，运动和运动系）提供熟练的技术援助。

涉及研究动物的程序应根据相关准则和当地立法进行。用于本研究的所有动物实验均符合《欧洲保护脊椎动物公约》，用于实验和其他科学目的，并得到丹麦动物实验监察局的批准。
1.实验装置和缝合环的制备
注意：对于本研究，使用带有定制孵育钩的集成肌肉条肌图系统来孵育孤立的小鼠骨骼肌（图1）。该系统允许肌肉在具有连?...

骨骼肌葡萄糖摄取的完全调节对于保持整体健康很重要1.因此，在评估各种改变健康的干预措施时，对肌肉葡萄糖摄取的研究通常作为主要读数。在这里，我们描述了一种离体方法，用于测量小鼠分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉中葡萄糖摄取，以响应胰岛素和电诱导的收缩。该方法快速可靠，可以精确控制孵化肌肉的周围环境，从而可以准确研究从血液中可以找到的激素和底物的?...

骨骼肌具有从细胞外空间提取大量葡萄糖的能力，以响应胰岛素和运动。这有助于维持全身葡萄糖稳态，并在高能量需求期间确保葡萄糖供应。由于骨骼肌葡萄糖摄取的完整调节已被证明对整体健康和身体表现很重要1，2，因此在各种条件下测量肌肉葡萄糖摄取受到了很多关注。在人类和动物中，高胰岛素 -正血糖钳夹已被用作评估体内胰岛素敏感性的金标准技术3，4.与口服葡萄糖耐量试验的结果相反，高胰岛素-正血糖钳夹技术不需要完整的胃肠功能或胰腺分泌胰岛素，因此可以在胃肠和/或胰腺功能变化的受试者之间比较胰岛素反应。自20世纪60年代以来，人类运动期间体内肌肉葡萄糖摄取的测量一直很频繁5。首先通过使用动静脉平衡技术6 ，后来通过使用正电子发射断层扫描（PET）成像结合发射葡萄糖类似物，例如18F-氟脱氧葡萄糖7。在啮齿动物中，运动刺激的肌肉在体内葡萄糖摄取通常通过使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物8，9，10进行。
测量体内肌肉葡萄糖摄取的补充方法是从啮齿动物中分离和孵育小肌肉，然后使用放射性或稳定同位素标记的葡萄糖类似物11，12，13测量葡萄糖摄取。该方法可以准确可靠地量化成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取率，并且可以在存在各种胰岛素浓度和通过电刺激引起的收缩期间进行。更重要的是，在研究经过各种干预（例如营养，身体活动，感染，治疗）的小鼠的肌肉代谢表型时，分离和孵育骨骼肌中葡萄糖摄取的测量具有相关性。分离的骨骼肌模型也是可能影响葡萄糖摄取本身和/或改变胰岛素敏感性的药理学化合物测试 的 合适工具12，14。通过这种方式，设计用于调节肌肉葡萄糖代谢的化合物的功效可以在高度受控的环境中进行测试和评估，然后再在临床前动物模型中进行后续的体内测试。
在某些条件下，代谢活力可能对孤立和孵育的骨骼肌模型系统构成挑战。事实上，在孵化的肌肉中缺乏循环系统意味着基质（例如氧气和营养物质）的输送完全取决于肌肉纤维与周围环境之间的简单扩散。关于这一点，重要的是，孵化的肌肉小而薄，因此，在孵育过程中代表较少的氧扩散屏障15。特别是在长时间孵育数小时期间，缺氧状态可能由于氧气供应不足导致肌肉能量消耗而发展15。尽管先前已经报道了孵化大鼠肌肉中代谢活力的各种标志物以及有助于维持大鼠肌肉活力的重要变量的鉴定15，但仍然需要对小孵化小鼠肌肉中的代谢活力进行全面评估。因此，目前，糖原含量已主要被用作培养小鼠骨骼肌16，17中代谢活力的标志物。
在这里，我们描述了一个详细的方案，以测量使用放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇作为细胞外标志物的小鼠分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉中的基础，胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。在本研究中，在10分钟内测量葡萄糖摄取，并且该方法使用亚最大和最大有效胰岛素浓度以及单一收缩方案。然而，本文中描述的方案可以很容易地在孵育时间、胰岛素剂量和电刺激方案方面进行修改。此外，我们还对孵育的比目鱼和EDL小鼠肌肉中的代谢活力的各种标志物进行了彻底的表征。结果表明，向孵育缓冲液补充葡萄糖对于保持孵育肌肉1小时的代谢活力至关重要。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

骨骼肌是一种胰岛素反应组织，通常占据饭后进入血液的大部分葡萄糖。此外，据报道，与静息条件相比，骨骼肌在运动期间可能使血液中葡萄糖的提取增加多达50倍。运动和胰岛素刺激期间肌肉葡萄糖摄取的增加取决于葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）从细胞内隔室到肌肉细胞表面膜的易位，以及葡萄糖通过己糖激酶II磷酸化为葡萄糖-6-磷酸。小鼠肌肉（如 米氏 支原肌和 长指伸 肌（EDL））的分离和孵育是研究胰岛素和电诱导收缩（运动模型）对成熟骨骼肌葡萄糖摄取的影响的适当离体模型。因此，离体模型允许评估肌肉胰岛素敏感性，并使得在收缩期间匹配肌肉力量的产生成为可能，从而确保在测量肌肉葡萄糖摄取期间肌肉纤维的均匀募集。此外，所描述的模型适用于可能对肌肉胰岛素敏感性产生影响的药理学化合物测试，或者在试图描绘骨骼肌葡萄糖摄取的调节复杂性时可能有所帮助。
在这里，我们描述并提供有关如何使用放射性标记的[3H]2-脱氧-D-葡萄糖和[14C]甘露醇作为细胞外标志物来测量小鼠的分离和孵育的比目鱼和EDL肌肉制剂中胰岛素和收缩刺激葡萄糖摄取的详细方案。这可以准确评估成熟骨骼肌中的葡萄糖摄取，而没有可能干扰完整动物模型的混杂因素。此外，我们提供有关孵化小鼠骨骼肌代谢活力的信息，表明在研究肌肉能量代谢时，所应用的方法在某些条件下具有一些警告。

如图2所示，从雌性小鼠分离出的比目鱼和EDL肌之间的基础葡萄糖摄取率相似。在12，13，19，20之前也曾多次报告。在比目鱼和EDL肌肉中，葡萄糖摄取增加约0.8和〜0.6倍，分别达到12和9μmol / g蛋白质/ h，以响应低于最大有效胰岛素浓度（100μU / mL）。当肌?...

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Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

肌肉葡萄糖摄取的完全调节对于维持全身葡萄糖稳态非常重要。该方案在描述各种生理干预对全身葡萄糖代谢的影响时，评估孤立和孵育成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取。

测量小鼠分离和孵育成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

离体模型是评估各种生理干预和药理学化合物以及肌肉葡萄糖摄取的影响的有用方法。该技术允许在没有可能干扰完整动物模型的混杂因素的情况下准确评估孤立的小鼠骨骼肌中的葡萄糖摄取。在开始实验之前，打开集成的肌肉带传记系统并将腔室加热到30摄氏度。打开数据收集软件并校准强制传感器，以确保数据集之间的可比性。向每个孵育室中加入4毫升预热的30摄氏度基础培养基，并确保培养基用95%氧气和5%二氧化碳连续氧化。将鼠标置于解剖托盘上的俯卧位置，并确认对踏板反射缺乏反应。然后用针固定一个前爪。用剪刀从小腿上取下皮肤，直到跟腱和膝关节都可见。对于皮底肌的解剖，将一个直径为0.4厘米的缝合环连接到跟腱，该缝合线由16厘米不可吸收的手术尼龙缝合线片制成，并将固定的镊子连接到袢远端的跟腱肌腱上。切开以从爪子上释放比目鱼和腓肠肌，并小心地将镊子滑过小鼠以暴露比目鱼肌肉。固定下镊子，并在比目鱼肌近端肌腱周围放置第二个缝合环。切除近端肌腱并解剖比目骨，包括两个连接的缝合环，没有腓肠肌。收集后，使用环将比目鱼肌快速连接到其中一个孵育室中的相应钩子上。使用镊子去除覆盖胫骨前肌的筋膜。胫骨前肌或EDL肌的远端肌腱应为透明白色，可见且彼此分开。切除胫骨前肌的蒸馏肌腱，切除肌肉。使用镊子轻轻地将EDL肌肉从周围组织中解放出来，使肌肉完好无损，而不会切断肌腱。将单独的缝合线环在蒸馏和近端EDL肌腱周围。放置环后，切割肌腱以释放连接缝合环的EDL肌肉，并快速将环连接到第二个孵育室中的钩子上。然后将每块肌肉的静息张力调整到大约五毫牛顿，并在开始实验之前让肌肉在培养基中平衡至少10分钟。为了测量胰岛素刺激的葡萄糖摄取，用不含胰岛素，次最大有效胰岛素浓度或最大有效胰岛素浓度的孵育培养基替换腔室中的基础孵育培养基，以进行20分钟的孵育。在刺激期结束时，用含有相同浓度胰岛素的葡萄糖摄取培养基替换孵育培养基，以进行10分钟的孵育。在葡萄糖摄取孵育结束时，小心地从孵育室中取出肌肉，并在冰冷的基础孵育培养基中洗涤样品。洗涤后，在滤纸上快速干燥肌肉，并在液氮中冻结没有缝合环的组织。然后从每个腔室收集100微升葡萄糖摄取培养基进行20摄氏度的储存和肌肉葡萄糖摄取分析。为了测量收缩刺激的葡萄糖摄取，将铂电极放在孵育室内肌肉的中央和两侧，并在用葡萄糖摄取孵育培养基替换基础孵育培养基后立即启动肌肉收缩。记录每个孵化肌肉的强制生产。10分钟后，按照所示轻轻收集并冷冻肌肉，从每个腔室中储存100微升等分试样的葡萄糖摄取培养基，用于肌肉葡萄糖摄取分析，如图所示。为了在同一组肌肉样品中通过蛋白质印迹分析来确定肌细胞信号传导，在400微升冰冷的均质缓冲液中均质化每个冷冻肌肉样品，并在4摄氏度下将样品末端旋转一小时。然后通过离心收集切片液，并根据标准的蛋白质印迹分析方案测量每个样品托盘中感兴趣的蛋白质量。为了测量每个样品中的葡萄糖摄取量，从每个样品中加入150微升上清液，从相应的孵育室中加入25微升葡萄糖摄取培养基，以分离液体闪烁计数瓶，每个小瓶含有三毫升液体闪烁液。然后将小瓶装入液体闪烁计数器上，并根据制造商的指南测量两种脱氧葡萄糖和甘露醇的放射性。在该代表性分析中，从雌性小鼠中分离出的比目鱼和EDL肌肉之间的基础葡萄糖摄取率相似。比目鱼和EDL肌肉的葡萄糖摄取增加，以响应亚最大和最大有效胰岛素浓度。此外，在比目鱼肌中，亚最大和最大胰岛素刺激的葡萄糖摄取均显着较高。相比之下，与比目鱼肌相比，EDL中收缩诱导的葡萄糖摄取显着更高。在这里，可以观察到在10分钟刺激期间比目鱼和EDL肌肉产生的最大肌肉力量。正如预期的那样，EDL肌肉在刺激期的初始阶段产生了更大的力，随后在刺激期后期迅速下降。亚最大和最大胰岛素浓度诱导Akt苏氨酸308和TBC1D4丝氨酸588的磷酸化增加，而收缩诱导AMPKα苏氨酸172和ACC丝氨酸212的磷酸化增加。胰岛素和收缩都没有导致总蛋白质含量的变化。在尝试测量孤立的小鼠肌肉中的葡萄糖摄取之前，彻底练习比目鱼和EDL肌肉的解剖至关重要。在评估肌肉葡萄糖摄取后，剩余的肌肉蛋白裂解物可用于额外的生化分析，以阐明观察到的葡萄糖摄取率的变化。

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

在体内微循环在骨骼肌内重要的显微镜测量

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

科研

生物学

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成人和胚胎骨骼的肌肉Microexplant文化和骨骼肌肉干细胞的分离

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

骨骼肌的线粒体分离

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

纯化的骨骼肌的先觉者

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

基于荧光测定活细胞中的钙进入商店经营：从培养的肿瘤细胞，骨骼肌纤维

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体外评估对离体骨骼肌的收缩，疲劳性和交替“

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

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单个肌纤维和成人骨骼肌卫星细胞的分离和培养

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

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平滑肌功能中分离出来的组织浴，应用药理学研究测量

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...