Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
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Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil danois pour la recherche indépendante - Sciences médicales (FSS8020-00288B) et de la Fondation Novo Nordisk (NNF160C0023046). Ce travail a également été soutenu par une subvention de recherche à Rasmus Kjøbsted de l’Académie danoise du diabète, qui est financée par la Fondation Novo Nordisk, numéro de subvention NNF17SA0031406. Les auteurs tiennent à remercier Karina Olsen, Betina Bolmgren et Irene Bech Nielsen (Département de nutrition, d’exercice et de sport, Faculté des sciences, Université de Copenhague) pour leur assistance technique qualifiée.

Les procédures impliquant des animaux de recherche doivent être effectuées conformément aux lignes directrices pertinentes et à la législation locale. Toutes les expériences sur les animaux utilisées pour cette étude étaient conformes à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et à d’autres fins scientifiques et ont été approuvées par l’Inspection danoise de l’expérimentation animale.
1. Préparation de l’a...

Une régulation intacte de l’absorption du glucose dans le muscle squelettique est importante pour préserver la santé globale1. Ainsi, l’étude de l’absorption du glucose musculaire sert souvent de lecture primaire lors de l’évaluation de diverses interventions altérant la santé. Nous décrivons ici une méthode ex vivo pour mesurer l’absorption du glucose dans le soléus isolé et incubé et le muscle EDL de souris en réponse à l’insuline et aux contractions induites électriqu...

Le muscle squelettique possède la capacité d’extraire de grandes quantités de glucose de l’espace extracellulaire en réponse à l’insuline et à l’exercice. Cela aide à maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps et sécurise l’approvisionnement en glucose pendant les périodes de forte demande d’énergie. Étant donné qu’une régulation intacte de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques s’est avérée importante pour la santé globale et la performance physique 1,2, les mesures de l’absorption du glucose musculaire dans diverses conditions ont reçu beaucoup d’attention. Chez l’homme et l’animal, la pince hyperinsulinémique-euglycémique a été utilisée comme technique de référence pour évaluer la sensibilité à l’insuline in vivo 3,4. Contrairement aux résultats obtenus lors d’un test de tolérance au glucose par voie orale, la technique de la pince hyperinsulinémique-euglycémique ne nécessite pas de fonction gastro-intestinale intacte ou de sécrétion d’insuline par le pancréas et permet donc de comparer les réponses à l’insuline entre les sujets présentant des variations de la fonction gastro-intestinale et / ou pancréatique. Des mesures de l’absorption du glucose musculaire in vivo pendant l’exercice chez l’homme ont été effectuées fréquemment depuis les années 19605. D’abord par l’utilisation de techniques d’équilibre artérioveineux6 et plus tard par l’utilisation de l’imagerie par émission de positons (TEP) en combinaison avec un analogue du glucose émettant des positons, par exemple 18F-Fluoro-désoxy-glucose7. Chez les rongeurs, l’absorption de glucose musculaire stimulée par l’exercice in vivo est généralement réalisée par l’utilisation d’analogues du glucose marqués par des isotopes radioactifs ou stables 8,9,10.
Une méthode complémentaire aux mesures de l’absorption du glucose musculaire in vivo consiste à isoler et à incuber de petits muscles de rongeurs, puis à mesurer l’absorption de glucose à l’aide d’analogues du glucose marqués par des isotopes radioactifs ou stables 11,12,13. Cette méthode permet une quantification précise et fiable des taux d’absorption du glucose dans le muscle squelettique mature et peut être réalisée en présence de diverses concentrations d’insuline et lors de la contraction provoquée par stimulation électrique. Plus important encore, les mesures de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques isolés et incubés sont pertinentes lors de l’étude du phénotype métabolique musculaire de souris ayant subi diverses interventions (par exemple, nutrition, activité physique, infection, thérapeutique). Le modèle de muscle squelettique isolé est également un outil approprié pour les tests de composés pharmacologiques qui peuvent affecter l’absorption du glucose en soi et / ou modifier la sensibilité à l’insuline12,14. De cette façon, l’efficacité des composés conçus pour réguler le métabolisme du glucose musculaire peut être testée et évaluée dans un milieu hautement contrôlé avant des tests in vivo ultérieurs sur des modèles animaux précliniques.
Dans certaines conditions, la viabilité métabolique peut poser un défi dans le système de modèle musculaire squelettique isolé et incubé. En effet, l’absence de système circulatoire dans les muscles incubés implique que la livraison de substrats (par exemple l’oxygène et les nutriments) dépend entièrement de la simple diffusion entre les fibres musculaires et l’environnement environnant. À cet égard, il est important que les muscles incubés soient petits et minces et représentent donc moins une barrière pour la diffusion de l’oxygène pendant l’incubation15. Surtout pendant les incubations prolongées pendant plusieurs heures, des états hypoxiques peuvent se développer en raison d’un apport insuffisant en oxygène entraînant un épuisement de l’énergie musculaire15. Bien que divers marqueurs de la viabilité métabolique dans le muscle du rat incubé aient été rapportés précédemment parallèlement à l’identification de variables importantes qui aident à maintenir la viabilité du muscle du rat15, une évaluation complète de la viabilité métabolique dans les petits muscles de souris incubés est toujours justifiée. Par conséquent, à l’heure actuelle, la teneur en glycogène a principalement été utilisée comme marqueur de la viabilité métabolique dans le muscle squelettique de souris incubé16,17.
Nous décrivons ici un protocole détaillé pour mesurer l’absorption basale, insulinique et stimulée par la contraction du glucose dans le soléus isolé et incubé et le muscle EDL de souris en utilisant le [3H]2-désoxy-D-glucose radiomarqué et le [14C]mannitol comme marqueur extracellulaire. Dans la présente étude, l’absorption de glucose a été mesurée pendant une période de 10 minutes et la méthode est présentée avec l’utilisation de concentrations d’insuline sous-maximales et maximalement efficaces ainsi que d’un seul protocole de contraction. Cependant, les protocoles décrits ici peuvent facilement être modifiés en ce qui concerne le temps d’incubation, le dosage de l’insuline et le protocole de stimulation électrique. En outre, nous fournissons une caractérisation approfondie de divers marqueurs de la viabilité métabolique dans le soléaire incubé et le muscle de la souris EDL. Les résultats indiquent que la supplémentation en glucose du tampon d’incubation est essentielle pour préserver la viabilité métabolique du muscle incubé pendant 1 heure.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

Le muscle squelettique est un tissu sensible à l’insuline et absorbe généralement la majeure partie du glucose qui pénètre dans le sang après un repas. De plus, il a été rapporté que le muscle squelettique peut augmenter l’extraction du glucose du sang jusqu’à 50 fois pendant l’exercice par rapport aux conditions de repos. L’augmentation de l’absorption de glucose musculaire pendant l’exercice et la stimulation de l’insuline dépend de la translocation du transporteur de glucose 4 (GLUT4) des compartiments intracellulaires vers la membrane de surface des cellules musculaires, ainsi que de la phosphorylation du glucose en glucose-6-phosphate par l’hexokinase II. L’isolement et l’incubation des muscles de souris tels que m. soleus et m. extensor digitorum longus (EDL) est un modèle ex vivo approprié pour étudier les effets de l’insuline et de la contraction induite électriquement (un modèle pour l’exercice) sur l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques matures. Ainsi, le modèle ex vivo permet d’évaluer la sensibilité musculaire à l’insuline et permet d’adapter la production de force musculaire pendant la contraction assurant un recrutement uniforme des fibres musculaires lors des mesures de l’absorption de glucose musculaire. De plus, le modèle décrit convient aux tests de composés pharmacologiques qui peuvent avoir un impact sur la sensibilité musculaire à l’insuline ou peuvent être utiles pour tenter de délimiter la complexité régulatrice de l’absorption du glucose dans les muscles squelettiques.
Ici, nous décrivons et fournissons un protocole détaillé sur la façon de mesurer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les préparations musculaires isolées et incubées de soleus et d’EDL de souris utilisant le [3H]2-désoxy-D-glucose radiomarqué et le [14C]mannitol comme marqueur extracellulaire. Cela permet une évaluation précise de l’absorption du glucose dans le muscle squelettique mature en l’absence de facteurs de confusion pouvant interférer dans le modèle animal intact. En outre, nous fournissons des informations sur la viabilité métabolique du muscle squelettique de souris incubé, suggérant que la méthode appliquée possède certaines mises en garde dans certaines conditions lors de l’étude du métabolisme énergétique musculaire.

Comme le montre la figure 2, les taux d’absorption du glucose basal étaient similaires entre le soléaire isolé et le muscle EDL de souris femelles. Cela a également été signalé plusieurs fois avant 12,13,19,20. L’absorption de glucose a augmenté d’environ 0,8 et ~0,6 fois, atteignant 12 et 9 μmol / g de protéines / h...

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Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Une régulation intacte de l’absorption du glucose musculaire est importante pour maintenir l’homéostasie du glucose dans tout le corps. Ce protocole présente une évaluation de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans les muscles squelettiques matures isolés et incubés lors de la délimitation de l’impact de diverses interventions physiologiques sur le métabolisme du glucose dans tout le corps.

Mesure de l’absorption de glucose stimulée par l’insuline et la contraction dans le muscle squelettique mature isolé et incubé de souris

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Le modèle ex vivo est une méthode utile pour évaluer l’impact de diverses interventions physiologiques et de composés pharmacologiques et de l’absorption musculaire du glucose. Cette technique permet d’évaluer avec précision l’absorption du glucose dans le muscle squelettique isolé de la souris en l’absence de facteurs de confusion pouvant interférer dans un modèle animal intact. Avant de commencer une expérience, allumez le système biographique de bande musculaire intégré et réchauffez les chambres à 30 degrés Celsius.Ouvrez le logiciel de collecte de données et calibrez les transducteurs forcés pour assurer la comparabilité entre les ensembles de données. Ajoutez quatre millilitres de milieu d’incubation basal préchauffé de 30 degrés Celsius à chaque chambre d’incubation et assurez-vous que le milieu est continuellement oxygéné avec 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone. Placez la souris en position couchée sur un plateau de dissection et confirmez un manque de réponse au réflexe de pédale.Ensuite, épinglez une seule patte avant avec une aiguille. Utilisez des ciseaux pour retirer la peau de la jambe inférieure jusqu’à ce que le tendon d’Achille et l’articulation du genou soient visibles. Pour la dissection du muscle soléaire, attachez une seule boucle de suture de 0,4 centimètre de diamètre préparée à partir d’un morceau de suture en nylon chirurgical non résorbable de 16 centimètres au tendon d’Achille et fixez la pince peen au tendon d’Achille distalement à la boucle.Coupez pour libérer les muscles soléaire et gastrocnémien de la patte et faites glisser soigneusement la pince peen sur la souris pour exposer le muscle soléaire. Épinglez les pinces peen et placez une deuxième boucle de suture autour du tendon proximal du muscle soléaire. Coupez le tendon proximal et disséquez le soléaire, y compris les deux boucles de suture attachées, exemptes du muscle gastrocnémien.Lors de la collecte, utilisez les boucles pour attacher rapidement le muscle soléaire aux crochets respectifs dans l’une des chambres d’incubation. Utilisez une pince pour enlever le fascia recouvrant le muscle antérieur du tibialis. Les tendons distaux des muscles tibialis antérieurs ou EDL doivent être blancs clairs, visibles et séparés les uns des autres.Coupez le tendon de distillation du muscle antérieur tibialis et disséquez le muscle. Utilisez des pinces pour libérer doucement le muscle EDL des tissus environnants, laissant le muscle intact sans couper les tendons. Placez des boucles de suture individuelles autour des tendons de distillation et de l’EDL proximal.Lorsque les boucles ont été placées, coupez les tendons pour libérer le muscle EDL avec les boucles de suture attachées et attachez rapidement les boucles aux crochets dans la deuxième chambre d’incubation. Ensuite, ajustez la tension au repos de chaque muscle à environ cinq millinewtons et laissez les muscles s’équilibrer dans le milieu pendant au moins 10 minutes avant de commencer l’expérience. Pour mesurer l’absorption de glucose stimulée par l’insuline, remplacez le milieu d’incubation basal dans les chambres par le milieu d’incubation sans insuline, une concentration d’insuline sous-maximale efficace ou une concentration d’insuline maximalement efficace pour une incubation de 20 minutes.À la fin de la période de stimulation, remplacer le milieu d’incubation par un milieu d’incubation absorbant le glucose contenant une concentration identique d’insuline pour une incubation de 10 minutes. À la fin de l’incubation de l’absorption du glucose, retirez soigneusement les muscles des chambres d’incubation et lavez les échantillons dans un milieu d’incubation basal glacé. Après le lavage, séchez rapidement les muscles sur du papier filtre et congelez le tissu sans les boucles de suture dans l’azote liquide.Ensuite, collectez 100 microlitres du milieu d’incubation d’absorption du glucose de chaque chambre pour un stockage de 20 degrés Celsius et une analyse de l’absorption du glucose musculaire. Pour mesurer l’absorption de glucose stimulée par la contraction, placez des électrodes de platine au centre et des deux côtés des muscles dans les chambres d’incubation, et initiez la contraction musculaire immédiatement après avoir remplacé le milieu d’incubation basal par un milieu d’incubation absorbant le glucose. Enregistrez la production forcée de chaque muscle incubé.Après 10 minutes, recueillir et congeler doucement les muscles comme démontré, en stockant 100 microlitres d’aliquotes du milieu d’incubation de l’absorption du glucose de chaque chambre pour l’analyse de l’absorption du glucose musculaire comme démontré. Pour déterminer la signalisation myocellulaire par analyse western blotting dans le même ensemble d’échantillons musculaires, homogénéiser chaque échantillon musculaire congelé dans 400 microlitres de tampon d’homogénéisation glacé et faire pivoter l’échantillon bout à bout pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, collectez le licate par centrifugeur et mesurez la quantité de protéines d’intérêt dans chaque palette d’échantillons selon les protocoles d’analyse par transfert Western standard.Pour mesurer l’absorption de glucose dans chaque échantillon, ajouter 150 microlitres de surnageant de chaque échantillon et 25 microlitres de milieu d’incubation d’absorption de glucose des chambres d’incubation correspondantes pour séparer les flacons de comptage de scintillation liquide contenant trois millilitres de liquide de scintillation liquide par flacon. Ensuite, chargez les flacons sur un compteur de scintillation liquide et mesurez la radioactivité de deux désoxyglucoses et mannitol conformément aux directives du fabricant. Dans cette analyse représentative, les taux d’absorption du glucose basal étaient similaires entre les muscles soléaires et EDL isolés chez des souris femelles.L’absorption de glucose a augmenté dans les muscles soléaires et EDL en réponse à des concentrations d’insuline sous-maximales et maximales efficaces. De plus, les absorptions de glucose sous-maximales et maximales stimulées par l’insuline étaient significativement plus élevées dans le muscle soléaire. En revanche, l’absorption de glucose induite par la contraction était significativement plus élevée dans l’EDL que dans le muscle soléaire.Ici, la force musculaire maximale produite dans les muscles soléaire et EDL pendant la période de stimulation de 10 minutes peut être observée. Comme prévu, le muscle EDL a généré plus de force pendant la première partie de la période de stimulation, suivie d’un déclin rapide plus tard dans la période de stimulation. Les concentrations sous-maximales et maximales d’insuline ont induit une augmentation de la phosphorylation de la thréonine 308 et de la sérine 588 TBC1D4, tandis que la contraction a induit une augmentation de la phosphorylation de l’AMPK Alpha thréonine 172 et de l’ACC sérine 212.Ni l’insuline ni la contraction n’ont entraîné de modification de la teneur totale en protéines. Avant d’essayer de mesurer l’absorption du glucose dans les muscles isolés de la souris, il est essentiel de bien pratiquer la dissection des muscles soléaire et EDL. Après l’évaluation de l’absorption du glucose musculaire, le lysat de protéine musculaire restant peut être utilisé pour une analyse biochimique supplémentaire qui peut élucider les changements observés dans les taux d’absorption du glucose.

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