Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Danish Council for Independent Research - Medical Sciences (FSS8020-00288B) und der Novo Nordisk Foundation (NNF160C0023046) unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Forschungsstipendium an Rasmus Kjøbsted von der Danish Diabetes Academy unterstützt, das von der Novo Nordisk Foundation mit der Fördernummer NNF17SA0031406 finanziert wird. Die Autoren danken Karina Olsen, Betina Bolmgren und Irene Bech Nielsen (Department of Nutrition, Exercise and Sports, Faculty of Science, University of Copenhagen) für ihre kompetente technische Unterstützung.

Verfahren mit Versuchstieren sollten in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien und den lokalen Rechtsvorschriften durchgeführt werden. Alle für diese Studie verwendeten Tierversuche entsprachen der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, und wurden von der dänischen Tierversuchsinspektion genehmigt.
1. Vorbereitung der Versuchsapparatur und der Nahtschlaufen
HIN...

Eine intakte Regulierung der Glukoseaufnahme in der Skelettmuskulatur ist wichtig für die Erhaltung der allgemeinen Gesundheit1. Daher dient die Untersuchung der Muskelglukoseaufnahme oft als primäre Anzeige bei der Bewertung verschiedener gesundheitsverändernder Interventionen. Hier beschreiben wir eine Ex-vivo-Methode zur Messung der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen als Reaktion auf Insulin und elektrisch induzierte Kontraktionen. Die Methode i...

Die Skelettmuskulatur besitzt die Fähigkeit, große Mengen Glukose aus dem extrazellulären Raum als Reaktion auf Insulin und Bewegung zu extrahieren. Dies trägt zur Aufrechterhaltung der Ganzkörper-Glukosehomöostase bei und sichert die Glukoseversorgung in Zeiten hohen Energiebedarfs. Da sich eine intakte Regulation der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur als wichtig für die allgemeine Gesundheit und körperliche Leistungsfähigkeiterwiesen hat 1,2, haben Messungen der Muskelglukoseaufnahme unter verschiedenen Bedingungen viel Aufmerksamkeit erhalten. Bei Menschen und Tieren wurde die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemme als Goldstandardtechnik zur Beurteilung der Insulinsensitivität in vivo 3,4 verwendet. Im Gegensatz zu den Erkenntnissen aus einem oralen Glukosetoleranztest erfordert die hyperinsulinämisch-euglykämische Klemmtechnik keine intakte gastrointestinale Funktion oder Insulinsekretion aus der Bauchspeicheldrüse und ermöglicht somit den Vergleich der Insulinreaktionen zwischen Probanden, die Variationen in der Magen-Darm- und/oder Pankreasfunktion aufweisen. Messungen der Muskelglukoseaufnahme in vivo während des Trainings beim Menschen werden seit den 1960er Jahren häufig durchgeführt5. Zunächst durch den Einsatz von arteriovenösen Gleichgewichtstechniken6 und später durch den Einsatz der Positronen-Emissions-Tomographie (PET)-Bildgebung in Kombination mit einem positronenemittierenden Glukoseanalogon, z.B. 18F-Fluor-Desoxy-Glucose7. Bei Nagetieren wird die trainingsstimulierte Muskelglukoseaufnahme in vivo typischerweise durch die Verwendung von radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga 8,9,10 durchgeführt.
Eine ergänzende Methode zur Messung der Muskelglukoseaufnahme in vivo besteht darin, kleine Muskeln von Nagetieren zu isolieren und zu inkubieren und anschließend die Glukoseaufnahme mit radioaktiven oder stabilen isotopenmarkierten Glukoseanaloga11,12,13 zu messen. Diese Methode ermöglicht eine genaue und zuverlässige Quantifizierung der Glukoseaufnahmeraten in reifen Skelettmuskeln und kann in Gegenwart verschiedener Insulinkonzentrationen und während der durch elektrische Stimulation ausgelösten Kontraktion durchgeführt werden. Noch wichtiger ist, dass Messungen der Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Skelettmuskeln von Bedeutung sind, wenn der metabolische Phänotyp der Muskeln untersucht wird, die verschiedenen Interventionen unterzogen wurden (z. B. Ernährung, körperliche Aktivität, Infektion, Therapeutika). Das isolierte Skelettmuskelmodell ist auch ein geeignetes Werkzeug für pharmakologische Verbindungstests, die die Glukoseaufnahme per se beeinflussen und/oder die Insulinsensitivität modifizieren können12,14. Auf diese Weise kann die Wirksamkeit von Verbindungen zur Regulierung des Muskelglukosestoffwechsels in einem hochkontrollierten Milieu getestet und bewertet werden, bevor anschließend in vivo in präklinischen Tiermodellen getestet wird.
Unter bestimmten Bedingungen kann die metabolische Lebensfähigkeit eine Herausforderung im isolierten und inkubierten Skelettmuskelmodellsystem darstellen. In der Tat bedeutet das Fehlen eines Kreislaufsystems in den inkubierten Muskeln, dass die Zufuhr von Substraten (z. B. Sauerstoff und Nährstoffen) vollständig von einer einfachen Diffusion zwischen den Muskelfasern und der Umgebung abhängt. In diesem Zusammenhang ist es von Bedeutung, dass die inkubierten Muskeln klein und dünn sind und daher weniger eine Barriere für die Sauerstoffdiffusion während der Inkubationdarstellen 15. Insbesondere bei längerer Inkubation über mehrere Stunden können sich aufgrund unzureichender Sauerstoffversorgung hypoxische Zustände entwickeln, die zu einem Erschöpfung der Muskelenergie führen15. Obwohl verschiedene Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubierten Rattenmuskeln bereits berichtet wurden, zusammen mit der Identifizierung wichtiger Variablen, die zur Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Rattenmuskeln beitragen15, ist eine umfassende Bewertung der metabolischen Lebensfähigkeit in kleinen inkubierten Mausmuskeln immer noch gerechtfertigt. Daher wird der Glykogengehalt derzeit hauptsächlich als Marker für die metabolische Lebensfähigkeit in inkubierten Mausskelettmuskelnverwendet 16,17.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der basalen, insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskeln von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. In der vorliegenden Studie wurde die Glukoseaufnahme während eines Zeitraums von 10 Minuten gemessen und die Methode wird unter Verwendung submaximaler und maximal wirksamer Insulinkonzentrationen sowie eines einzigen Kontraktionsprotokolls vorgestellt. Die hierin beschriebenen Protokolle können jedoch leicht in Bezug auf Inkubationszeit, Insulindosierung und elektrisches Stimulationsprotokoll modifiziert werden. Darüber hinaus bieten wir eine gründliche Charakterisierung verschiedener Marker der metabolischen Lebensfähigkeit in inkubiertem Soleus- und EDL-Mausmuskel. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Glukoseergänzung zum Inkubationspuffer unerlässlich ist, um die metabolische Lebensfähigkeit des für 1 Stunde inkubierten Muskels zu erhalten.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

Die Skelettmuskulatur ist ein insulinansprechendes Gewebe und nimmt typischerweise den größten Teil der Glukose auf, die nach einer Mahlzeit in das Blut gelangt. Darüber hinaus wurde berichtet, dass die Skelettmuskulatur die Extraktion von Glukose aus dem Blut während des Trainings im Vergleich zu Ruhebedingungen um das bis zu 50-fache erhöhen kann. Die Erhöhung der Muskelglukoseaufnahme während des Trainings und der Insulinstimulation hängt von der Translokation des Glukosetransporters 4 (GLUT4) von intrazellulären Kompartimenten zur Muskelzelloberflächenmembran sowie der Phosphorylierung von Glukose zu Glucose-6-phosphat durch Hexokinase II ab. Die Isolierung und Inkubation von Mausmuskeln wie M. soleus und M . extensor digitorum longus (EDL) ist ein geeignetes Ex-vivo-Modell, um die Auswirkungen von Insulin und elektrisch induzierter Kontraktion (ein Modell für Bewegung) auf die Glukoseaufnahme in reifen Skelettmuskeln zu untersuchen. So ermöglicht das Ex-vivo-Modell die Bewertung der Muskelinsulinsensitivität und ermöglicht es, die Muskelkraftproduktion während der Kontraktion anzupassen, um eine gleichmäßige Rekrutierung von Muskelfasern während der Messung der Muskelglukoseaufnahme zu gewährleisten. Darüber hinaus eignet sich das beschriebene Modell für pharmakologische Wirkstofftests, die sich auf die Insulinsensitivität der Muskeln auswirken oder hilfreich sein können, wenn es darum geht, die regulatorische Komplexität der Glukoseaufnahme der Skelettmuskulatur abzugrenzen.
Hier beschreiben und liefern wir ein detailliertes Protokoll zur Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten Soleus- und EDL-Muskelpräparaten von Mäusen unter Verwendung von radioaktiv markierter [3H]2-Desoxy-D-Glucose und [14C]Mannitol als extrazellulärem Marker. Dies ermöglicht eine genaue Beurteilung der Glukoseaufnahme in reifer Skelettmuskulatur in Abwesenheit von Störfaktoren, die das intakte Tiermodell stören können. Darüber hinaus liefern wir Informationen über die metabolische Lebensfähigkeit der inkubierten Mausskelettmuskulatur, was darauf hindeutet, dass die angewandte Methode unter bestimmten Bedingungen bei der Untersuchung des Muskelenergiestoffwechsels einige Vorbehalte aufweist.

Wie in Abbildung 2 gezeigt, waren die basalen Glukoseaufnahmeraten zwischen isoliertem Soleus- und EDL-Muskel von weiblichen Mäusen ähnlich. Dies wurde auch mehrmals vor12,13,19,20 berichtet. Die Glukoseaufnahme stieg um das ~0,8- und ~0,6-fache und erreichte 12 bzw. 9 μmol/g Protein/h im Soleus- bzw. EDL-Muskel als Reaktion auf ...

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Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Eine intakte Regulierung der Muskelglukoseaufnahme ist wichtig für die Aufrechterhaltung der Ganzkörperglukose-Homöostase. Dieses Protokoll stellt die Bewertung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln dar, wenn die Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen auf den Glukosestoffwechsel des ganzen Körpers beschrieben werden.

Messung der insulin- und kontraktionsstimulierten Glukoseaufnahme in isolierten und inkubierten reifen Skelettmuskeln von Mäusen

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Das Ex-vivo-Modell ist eine nützliche Methode zur Bewertung der Auswirkungen verschiedener physiologischer Interventionen und pharmakologischer Verbindungen sowie der Aufnahme von Muskelglukose. Diese Technik ermöglicht die genaue Beurteilung der Glukoseaufnahme in isolierten Mausskelettmuskeln in Abwesenheit von Störfaktoren, die in einem intakten Tiermodell stören können. Schalten Sie vor Beginn eines Experiments das integrierte Muskelstreifen-Biographensystem ein und erwärmen Sie die Kammern auf 30 Grad Celsius.Öffnen Sie die Datenerfassungssoftware und kalibrieren Sie die erzwungenen Wandler, um die Vergleichbarkeit zwischen den Datensätzen sicherzustellen. Geben Sie vier Milliliter vorerwärmtes 30 Grad Celsius basales Inkubationsmedium in jede Inkubationskammer und stellen Sie sicher, dass das Medium kontinuierlich mit 95% Sauerstoff und 5% Kohlendioxid angereichert ist. Legen Sie die Maus in die Bauchlage auf einem Dissektionsfach und bestätigen Sie eine fehlende Reaktion auf den Pedalreflex.Stecken Sie dann eine einzelne Vorderpfote mit einer Nadel fest. Verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Unterschenkel zu entfernen, bis sowohl die Achillessehne als auch das Kniegelenk sichtbar sind. Zur Dissektion des Soleusmuskels befestigen Sie eine einzelne Nahtschelle mit einem Durchmesser von 0,4 Zentimetern, die aus einem 16 Zentimeter großen, nicht resorbierbaren chirurgischen Nylonstück hergestellt wurde, an der Achillessehne und befestigen Sie die Stiftzange an der Achillessehne distal an der Schlaufe.Schneiden Sie, um die Muskeln Soleus und Gastrocnemius von der Pfote zu lösen, und schieben Sie die Pinzette vorsichtig über die Maus, um den Soleusmuskel freizulegen. Stecken Sie die Pinzette ab und legen Sie eine zweite Nahtschaufe um die proximale Sehne des Musculus soleus. Schneiden Sie die proximale Sehne ab und sezieren Sie den Soleus einschließlich der beiden angebrachten Nahtschlaufen frei vom Musculus gastrocnemius.Verwenden Sie nach dem Sammeln die Schlaufen, um den Soleusmuskel schnell an den jeweiligen Haken in einer der Inkubationskammern zu befestigen. Verwenden Sie eine Pinzette, um die Faszie zu entfernen, die den vorderen Musculus tibialis bedeckt. Die distalen Sehnen der vorderen oder EDL-Muskeln von Tibialis sollten klar weiß, sichtbar und voneinander getrennt sein.Schneiden Sie die Destillessehne des vorderen Musculus tibialis ab und sezieren Sie den Muskel aus. Verwenden Sie eine Pinzette, um den EDL-Muskel sanft aus dem umgebenden Gewebe zu befreien und den Muskel intakt zu lassen, ohne die Sehnen zu schneiden. Platzieren Sie einzelne Nahtschlaufen um die Destillations- und proximalen EDL-Sehnen.Wenn die Schlaufen platziert wurden, schneiden Sie die Sehnen ab, um den EDL-Muskel mit den befestigten Nahtschlaufen zu lösen, und befestigen Sie die Schlaufen schnell an den Haken in der zweiten Inkubationskammer. Passen Sie dann die Ruhespannung jedes Muskels auf etwa fünf Millinewton an und lassen Sie die Muskeln mindestens 10 Minuten lang im Medium ausgleichen, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Um die insulinstimulierte Glukoseaufnahme zu messen, ersetzen Sie das basale Inkubationsmedium in den Kammern durch das Inkubationsmedium ohne Insulin, eine submaximal wirksame Insulinkonzentration oder eine maximal wirksame Insulinkonzentration für eine 20-minütige Inkubation.Ersetzen Sie am Ende der Stimulationsperiode das Inkubationsmedium durch ein Glukoseaufnahmeinkubationsmedium, das eine identische Insulinkonzentration für eine 10-minütige Inkubation enthält. Entfernen Sie am Ende der Glukoseaufnahmeinkubation vorsichtig die Muskeln aus den Inkubationskammern und waschen Sie die Proben in eiskaltem Basalinkubationsmedium. Nach dem Waschen trocknen Sie die Muskeln schnell auf Filterpapier und frieren Sie das Gewebe ohne die Nahtschlaufen in flüssigem Stickstoff ein.Dann sammeln Sie 100 Mikroliter des Glukoseaufnahme-Inkubationsmediums aus jeder Kammer für die 20-Grad-Celsius-Speicherung und Muskelglukoseaufnahmeanalyse. Um die kontraktionsstimulierte Glukoseaufnahme zu messen, platzieren Sie Platinelektroden zentral und auf beiden Seiten der Muskeln in den Inkubationskammern und leiten Sie die Muskelkontraktion unmittelbar nach dem Ersetzen des basalen Inkubationsmediums durch Glukoseaufnahme-Inkubationsmedium ein. Zeichnen Sie die erzwungene Produktion aus jedem inkubierten Muskel auf.Sammeln und frieren Sie die Muskeln nach 10 Minuten vorsichtig ein und frieren Sie sie wie gezeigt ein, wobei 100 Mikroliter Aliquots des Glukoseaufnahmemediums aus jeder Kammer für die Muskelglukoseaufnahmeanalyse gespeichert werden, wie gezeigt. Um die myozelluläre Signalgebung durch Western-Blotting-Analyse im selben Satz von Muskelproben zu bestimmen, homogenisieren Sie jede gefrorene Muskelprobe in 400 Mikroliter Eiskalt-Homogenisierungspuffer und drehen Sie die Probe Ende über Ende für eine Stunde bei vier Grad Celsius. Sammeln Sie dann das Likat durch Zentrifugalisierung und messen Sie die Menge an interessantem Protein in jeder Probenpalette gemäß den Standardprotokollen für westliche Blot-Analysen.Um die Glukoseaufnahme in jeder Probe zu messen, fügen Sie 150 Mikroliter Überstand aus jeder Probe und 25 Mikroliter Glukoseaufnahmeinkubationsmedium aus den entsprechenden Inkubationskammern hinzu, um flüssige Szintillationszählfläschchen mit drei Millilitern flüssiger Szintillationsflüssigkeit pro Durchstechflasche zu trennen. Laden Sie dann die Fläschchen auf einen flüssigen Szintillationszähler und messen Sie die Radioaktivität von zwei Desoxyglucose und Mannit gemäß den Richtlinien des Herstellers. In dieser repräsentativen Analyse waren die basale Glukoseaufnahmeraten zwischen Soleus- und EDL-Muskeln, die von weiblichen Mäusen isoliert wurden, ähnlich.Die Glukoseaufnahme erhöhte sich in den Soleus- und EDL-Muskeln als Reaktion auf sowohl submaximal- als auch maximal wirksame Insulinkonzentrationen. Darüber hinaus waren sowohl submaximale als auch maximale insulinstimulierte Glukoseaufnahmen im Soleusmuskel signifikant höher. Im Gegensatz dazu war die kontraktionsbedingte Glukoseaufnahme im EDL im Vergleich zum Soleusmuskel signifikant höher.Hier kann die maximale Muskelkraft beobachtet werden, die in Soleus- und EDL-Muskeln während der 10-minütigen Stimulationsphase erzeugt wird. Wie erwartet, erzeugte der EDL-Muskel im ersten Teil der Stimulationsperiode mehr Kraft, gefolgt von einem schnellen Rückgang später in der Stimulationsperiode. Submaximale und maximale Insulinkonzentrationen induzierten einen Anstieg der Phosphorylierung von Akt Threonin 308 und TBC1D4 Serin 588, während die Kontraktion eine Erhöhung der Phosphorylierung von AMPK Alpha Threonin 172 und ACC Serin 212 induzierte.Weder Insulin noch Kontraktion führten zu einer Veränderung des Gesamtproteingehalts. Bevor Sie versuchen, die Glukoseaufnahme in isolierten Mausmuskeln zu messen, ist es wichtig, die Dissektion der Soleus- und EDL-Muskeln gründlich zu üben. Nach der Beurteilung der Muskelglukoseaufnahme kann das verbleibende Muskelproteinlysat für zusätzliche biochemische Analysen verwendet werden, die die beobachteten Veränderungen der Glukoseaufnahmeraten aufklären können.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

In-vivo-Mikro-Zirkulation Measurement im Skelettmuskel von Intra-vital-Mikroskopie

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Forschung

Biologie

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondriale Isolation von der Skelettmuskulatur

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Reinigung von Vorläufern aus Skelettmuskeln

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Beurteilung der Kontraktilität, Müdigkeit und Alternans in isolierten Skelettmuskulatur

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Isolierung von Blutgefäß abgeleiteten multi Vorläufer von menschlichen Skelettmuskel

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...