Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמועצה הדנית למחקר עצמאי - מדעי הרפואה (FSS8020-00288B) ומקרן נובו נורדיסק (NNF160C0023046). עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק מחקר לרסמוס Kjøbsted מהאקדמיה הדנית לסוכרת, הממומנת על ידי קרן נובו נורדיסק, מענק מספר NNF17SA0031406. המחברים רוצים להודות לקרינה אולסן, בטינה בולמגרן ואיירין בק נילסן (המחלקה לתזונה, התעמלות וספורט, הפקולטה למדעים, אוניברסיטת קופנהגן) על הסיוע הטכני המיומן שלהן.

הליכים הכוללים חיות מחקר צריכים להתבצע בהתאם להנחיות הרלוונטיות ולחקיקה המקומית. כל הניסויים בבעלי חיים ששימשו למחקר זה עמדו באמנה האירופית להגנה על בעלי חוליות המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות אחרות ואושרו על ידי הפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים.
1. הכנת המנגנון הניסיוני ?...

ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לשמירה על הבריאות הכללית1. לפיכך, חקר ספיגת הגלוקוז בשרירים משמש לעתים קרובות כקריאה ראשונית בעת הערכת התערבויות שונות המשנות את הבריאות. כאן אנו מתארים שיטת ex vivo למדידת ספיגת גלוקוז בסולאוס מבודד ודגירה ושרירי EDL מעכברים בתגובה לאי...

שרירי השלד הם בעלי יכולת לחלץ כמויות גדולות של גלוקוז מהחלל החוץ-תאי בתגובה לאינסולין ולפעילות גופנית. זה עוזר לשמור על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף ומבטיח אספקת גלוקוז בזמנים של ביקוש גבוה לאנרגיה. מאחר שהוכח כי ויסות שלם של ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד חשוב לבריאות הכללית ולביצועים הגופניים 1,2, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים במהלך מצבים שונים זכו לתשומת לב רבה. בבני אדם ובבעלי חיים, המהדק ההיפר-אינסולינמי-אוגליקמי שימש כטכניקת תקן הזהב להערכת הרגישות לאינסולין in vivo 3,4. בניגוד לממצאים שהתקבלו מבדיקת סבילות לגלוקוז דרך הפה, טכניקת המהדק ההיפר-אינסולינמי-יוגליקמי אינה דורשת תפקוד שלם של מערכת העיכול או הפרשת אינסולין מהלבלב ובכך מאפשרת להשוות את תגובות האינסולין בין נבדקים המפגינים שינויים בתפקוד מערכת העיכול ו/או הלבלב. מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo במהלך פעילות גופנית בבני אדם בוצעו לעתים קרובות מאז שנות ה-60של המאה ה-20 5. תחילה על ידי שימוש בטכניקות איזון עורקים6 ומאוחר יותר על ידי שימוש בהדמיית טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) בשילוב עם אנלוגי פולט גלוקוז פולט פוזיטרון, למשל 18F-Fluoro-deoxy-glucose7. במכרסמים, ספיגת גלוקוז בשריר מגורה פעילות גופנית in vivo מבוצעת בדרך כלל על ידי שימוש באנלוגי גלוקוז רדיואקטיביים או יציבים המסומנים באיזוטופים 8,9,10.
שיטה משלימה למדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים in vivo, היא לבודד ולדגום שרירים קטנים ממכרסמים ולאחר מכן למדוד את ספיגת הגלוקוז באמצעות אנלוגים רדיואקטיביים או יציבים בעלי תווית איזוטופית של גלוקוז 11,12,13. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק ואמין של שיעורי ספיגת הגלוקוז בשרירי השלד הבוגרים וניתן לבצע אותה בנוכחות ריכוזי אינסולין שונים ובמהלך ההתכווצות המתעוררת על ידי גירוי חשמלי. חשוב מכך, מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירי שלד מבודדים ודגירה הן רלוונטיות כאשר חוקרים את הפנוטיפ המטבולי של השריר של עכברים שעברו התערבויות שונות (למשל תזונה, פעילות גופנית, זיהום, טיפולים). מודל שרירי השלד המבודדים הוא גם כלי מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על ספיגת הגלוקוז כשלעצמה ו/או לשנות את הרגישות לאינסולין 12,14. בדרך זו, ניתן לבחון ולהעריך את היעילות של תרכובות שנועדו לווסת את חילוף החומרים של הגלוקוז בשרירים בסביבה מבוקרת מאוד לפני ניסויי in vivo הבאים במודלים פרה-קליניים של בעלי חיים.
בתנאים מסוימים, כדאיות מטבולית עשויה להוות אתגר במערכת מודל שרירי השלד המבודדת והדגירה. ואכן, היעדר מערכת הדם בשרירים המדגרים כרוך בכך שאספקת מצעים (למשל חמצן וחומרים מזינים) תלויה באופן מלא בדיפוזיה פשוטה בין סיבי השריר לסביבה. בהקשר זה, יש חשיבות לכך שהשרירים הדגירה הם קטנים ודקים ולכן, מהווים פחות מחסום לפיזור חמצן במהלך הדגירה15. במיוחד במהלך דגירה ממושכת במשך מספר שעות, מצבים היפוקסיים עלולים להתפתח עקב אספקת חמצן לא מספקת וכתוצאה מכך דלדול אנרגיית השרירים15. למרות שסמנים שונים של כדאיות מטבולית בשרירי חולדה דגירה דווחו בעבר לצד זיהוי משתנים חשובים המסייעים בשמירה על כדאיות שרירי החולדה15, הערכה מקיפה של הכדאיות המטבולית בשרירי עכברים דגירה קטנים עדיין מוצדקת. לפיכך, כיום, תכולת הגליקוגן שימשה בעיקר כסמן של כדאיות מטבולית בשרירי שלד עכבר דגירה16,17.
כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט למדידת ספיגת גלוקוז מגורה בזאלי, אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ומדגר ושרירי EDL מעכברים באמצעות סימון רדיו-תאי [3H]2-דאוקסי-D-גלוקוז ומניטול [14C] כסמן חוץ-תאי. במחקר הנוכחי, ספיגת הגלוקוז נמדדה בפרק זמן של 10 דקות והשיטה מוצגת עם שימוש בריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ויעילים ביותר, כמו גם פרוטוקול התכווצות יחיד. עם זאת, ניתן לשנות בקלות את הפרוטוקולים המתוארים כאן ביחס לזמן הדגירה, מינון האינסולין ופרוטוקול הגירוי החשמלי. יתר על כן, אנו מספקים אפיון יסודי של סמנים שונים של כדאיות מטבולית בסולאוס דגירה ושריר עכבר EDL. התוצאות מצביעות על כך שתוספת גלוקוז למאגר הדגירה חיונית כדי לשמור על הכדאיות המטבולית של השריר המדגר במשך שעה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

שרירי השלד הם רקמה המגיבה לאינסולין ובדרך כלל תופסים את רוב הגלוקוז שנכנס לדם לאחר הארוחה. יתר על כן, דווח כי שרירי השלד עשויים להגביר את מיצוי הגלוקוז מהדם עד פי 50 במהלך פעילות גופנית בהשוואה לתנאי מנוחה. העלייה בספיגת הגלוקוז בשרירים במהלך פעילות גופנית וגירוי אינסולין תלויה בטרנסלוקציה של טרנספורטר גלוקוז 4 (GLUT4) מתאים תוך תאיים לקרום פני השטח של תאי השריר, כמו גם זרחון של גלוקוז לגלוקוז-6-פוספט על ידי הקסוקינאז II. בידוד ודגירה של שרירי עכבר כגון m. soleus ו- m. extensor digitorum longus (EDL) הוא מודל ex vivo מתאים לחקר ההשפעות של אינסולין והתכווצות חשמלית המושרה (מודל לפעילות גופנית) על ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים. לפיכך, מודל ה- ex vivo מאפשר הערכה של רגישות לאינסולין בשרירים ומאפשר להתאים את ייצור כוח השריר במהלך ההתכווצות ומבטיח גיוס אחיד של סיבי שריר במהלך מדידות של ספיגת גלוקוז בשרירים. יתר על כן, המודל המתואר מתאים לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות שעשויות להשפיע על הרגישות לאינסולין בשרירים או עשויות להועיל כאשר מנסים להגדיר את המורכבות הרגולטורית של ספיגת גלוקוז בשריר השלד.
כאן אנו מתארים ומספקים פרוטוקול מפורט כיצד למדוד ספיגת גלוקוז מגורה של אינסולין והתכווצות בסולאוס מבודד ודגירה ותכשירי שרירי EDL מעכברים באמצעות רדיו-תווית [3H]2-deoxy-D-glucose ו-[14C] מניטול כסמן חוץ-תאי. זה מאפשר הערכה מדויקת של ספיגת גלוקוז בשרירי השלד הבוגרים בהיעדר גורמים מבלבלים שעלולים להפריע למודל החייתי השלם. בנוסף, אנו מספקים מידע על הכדאיות המטבולית של שרירי שלד עכברים מדוגרים, מה שמרמז על כך שהשיטה המיושמת כוללת כמה אזהרות בתנאים מסוימים בעת לימוד חילוף החומרים של אנרגיית השרירים.

כפי שניתן לראות באיור 2, שיעורי ספיגת הגלוקוז הבסיסיים היו דומים בין סולאוס מבודד לבין שרירי EDL מנקבות עכברים. זה דווח גם כמה פעמים לפני 12,13,19,20. ספיגת הגלוקוז עלתה בכ-0.8 ופי 0.6 בקירוב והגי...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

ויסות שלם של ספיגת גלוקוז בשרירים חשוב לשמירה על הומאוסטזיס של גלוקוז בכל הגוף. פרוטוקול זה מציג הערכה של ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ודגירה כאשר הם מתארים את ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות על חילוף החומרים של גלוקוז בכל הגוף.

מדידת ספיגת גלוקוז מגורה באינסולין ובהתכווצות בשרירי שלד בוגרים מבודדים ומדגרים מעכברים

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

מודל ex vivo הוא שיטה שימושית להערכת ההשפעה של התערבויות פיזיולוגיות שונות ותרכובות פרמקולוגיות וספיגת גלוקוז בשרירים. טכניקה זו מאפשרת הערכה מדויקת של ספיגת גלוקוז בשרירי שלד עכברים מבודדים בהיעדר גורמים מבלבלים שעלולים להפריע למודל של בעלי חיים שלמים. לפני תחילת הניסוי, הפעילו את מערכת הביוגרפיה של רצועת השרירים המשולבת וחממו את התאים ל-30 מעלות צלזיוס.פתח את תוכנת איסוף הנתונים וכייל את המתמרים הכפויים כדי להבטיח יכולת השוואה בין מערכי נתונים. מוסיפים ארבעה מיליליטרים של מדיום דגירה בסיסי של 30 מעלות צלזיוס שחומם מראש לכל תא דגירה ומוודאים שהתווך מחומצן באופן רציף עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו-חמצני. מניחים את העכבר במצב נוטה על מגש דיסקציה ומאשרים חוסר תגובה לרפלקס הדוושה.לאחר מכן הצמידו כף קדמית אחת עם מחט. השתמש במספריים כדי להסיר את העור מהרגל התחתונה עד שגם גיד האכילס וגם מפרק הברך נראים לעין. לצורך כריתה של שריר הסולאוס, חברו לולאת תפר אחת בקוטר 0.4 ס"מ שהוכנה מחתיכת תפר ניילון כירורגית בלתי נספגת באורך 16 ס"מ לגיד האכילס והגיד האכילס באופן דיסטלי לגיד האכילס באופן דיסטלי ללולאה.חותכים כדי לשחרר את שרירי הסולאוס והגסטרוקנמיוס מהכף ומחליקים בזהירות את מלקחיים הפין על פני העכבר כדי לחשוף את שריר הסולאוס. הצמידו את מלקחי הפין והניחו לולאת תפר שנייה סביב הגיד הפרוקסימלי של שריר הסולאוס. חותכים את הגיד הפרוקסימלי ומנתחים את הסולאוס כולל שתי לולאות התפר המחוברות ללא שריר הגסטרוקנמיוס.בעת האיסוף, השתמש בלולאות כדי לחבר במהירות את שריר הסולאוס לקרסים המתאימים באחד מתאי הדגירה. השתמשו במלקחיים כדי להסיר את החיתולית המכסה את השריר הקדמי של טיביאליס. הגידים הדיסטליים של שרירי הטיביאליים הקדמיים או ה-EDL צריכים להיות לבנים בהירים, גלויים ומופרדים זה מזה.חותכים את גיד הזיקוק של השריר הקדמי של הטיביאליס ומנתחים את השריר. השתמשו במלקחיים כדי לשחרר בעדינות את שריר ה-EDL מהרקמות הסובבות אותו, ולהשאיר את השריר שלם מבלי לחתוך את הגידים. הניחו לולאות תפר בודדות סביב הזיקוק וגידי ה-EDL הפרוקסימליים.כאשר הלולאות הונחו, חתכו את הגידים כדי לשחרר את שריר ה-EDL עם לולאות התפרים המחוברות והצמידו במהירות את הלולאות לקרסים בתא הדגירה השני. לאחר מכן התאימו את מתח המנוחה של כל שריר לכ-5 מילינווטון ואפשרו לשרירים להתיישב בתווך במשך 10 דקות לפחות לפני תחילת הניסוי. כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז המעוררת באינסולין, החליפו את מדיום הדגירה הבסיסית בתאים במדיום הדגירה ללא אינסולין, בריכוז אינסולין תת-מקסימלי יעיל, או בריכוז אינסולין יעיל ביותר למשך 20 דקות דגירה.בסוף תקופת הגירוי, החליפו את מדיום הדגירה במדיום ספיגת גלוקוז המכיל ריכוז זהה של אינסולין למשך 10 דקות דגירה. בסוף הדגירה של ספיגת הגלוקוז, הסירו בזהירות את השרירים מתאי הדגירה ושטפו את הדגימות במדיום דגירה בסיסי קר כקרח. לאחר הכביסה, לייבש במהירות את השרירים על נייר מסנן ולהקפיא את הרקמה ללא לולאות התפר בחנקן נוזלי.לאחר מכן אספו 100 מיקרוליטרים של מדיום הדגירה של ספיגת הגלוקוז מכל תא לאחסון של 20 מעלות צלזיוס ולניתוח ספיגת גלוקוז בשרירים. כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז המעוררת כיווץ, מניחים אלקטרודות פלטינה במרכז ובשני צידי השרירים בתוך תאי הדגירה, ומתחילים התכווצות שרירים מיד לאחר החלפת מדיום הדגירה הבסיסית במדיום ספיגת הגלוקוז. תעד את ההפקה הכפויה מכל שריר דגירה.לאחר 10 דקות, אספו והקפיאו בעדינות את השרירים כפי שהוכח, תוך אחסון 100 אליקוטים של מיקרוליטר של מדיום הדגירה לספיגת גלוקוז מכל תא לניתוח ספיגת גלוקוז בשרירים כפי שהודגם. כדי לקבוע את האיתות המיוצלולרי על ידי ניתוח כתמים מערבי באותה קבוצה של דגימות שרירים, הומוגניזציה של כל דגימת שריר קפואה ב-400 מיקרוליטרים של מאגר הומוגניזציה קר כקרח וסובבו את קצה הדגימה מקצה לקצה במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן לאסוף את ה-licate על ידי צנטריפוגאליזציה ולמדוד את כמות החלבון המעניינת בתוך כל משטח דגימה על פי פרוטוקולי ניתוח הכתמים המערביים הסטנדרטיים.כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז בכל דגימה, הוסיפו 150 מיקרוליטרים של סופרנאטנט מכל דגימה ו-25 מיקרוליטרים של מדיום ספיגת גלוקוז מתאי הדגירה המתאימים כדי להפריד בקבוקונים של ספירת ספירת נוזלים המכילים שלושה מיליליטרים של נוזל סקינטילציה נוזלי לכל בקבוקון. לאחר מכן טען את הבקבוקונים על מונה נצנוץ נוזלי ומדוד רדיואקטיביות של שני דאוקסיגלוקוס ומניטול על פי הנחיות היצרן. בניתוח מייצג זה, שיעורי ספיגת הגלוקוז הבסיסיים היו דומים בין סולאוס לשרירי EDL שבודדו מנקבות עכברים.ספיגת הגלוקוז עלתה בשרירי הסולאוס וה-EDL בתגובה לריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ויעילים ביותר. יתר על כן, גם ספיגת הגלוקוז התת-מקסימלית וגם ספיגת הגלוקוז המקסימלית עוררה אינסולין הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי בשריר הסולאוס. לעומת זאת, ספיגת הגלוקוז הנגרמת על ידי התכווצות הייתה גבוהה משמעותית ב-EDL בהשוואה לשריר הסולאוס.כאן ניתן להבחין בכוח השרירים המרבי המיוצר בשרירי סולאוס ו-EDL במהלך תקופת הגירוי של 10 דקות. כצפוי, שריר ה-EDL יצר יותר כוח במהלך החלק הראשוני של תקופת הגירוי, ולאחר מכן ירידה מהירה בהמשך תקופת הגירוי. ריכוזי אינסולין תת-מקסימליים ומקסימליים גרמו לעלייה בזרחון של Akt threonine 308 ו- TBC1D4 Serine 588, בעוד שהתכווצות גרמה לעלייה בזרחון של AMPK Alpha threonine 172 ו- ACC serine 212.לא אינסולין ולא התכווצות הובילו לשינוי בתכולת החלבון הכוללת. לפני שמנסים למדוד את ספיגת הגלוקוז בשרירי עכבר מבודדים, חיוני לתרגל ביסודיות את הניתוח של שרירי הסולאוס וה-EDL. לאחר הערכת ספיגת הגלוקוז בשרירים, ניתן להשתמש בליזאט של חלבון השריר הנותר לניתוח ביוכימי נוסף שעשוי להבהיר את השינויים שנצפו בשיעורי ספיגת הגלוקוז.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

במדידה Micro-vivo מחזור בשרירי השלד על ידי מיקרוסקופית תוך חיוני

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

הערכת Vivo לשעבר של התכווצות, ועיפנות Alternans בשרירי שלד מבודדים

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...