Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

इस काम को डेनिश काउंसिल फॉर इंडिपेंडेंट रिसर्च - मेडिकल साइंसेज (FSS8020-00288B) और नोवो नॉरडिस्क फाउंडेशन (NNF160C0023046) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। इस काम को डेनिश मधुमेह अकादमी से रासमस Kjøbsted को एक शोध अनुदान द्वारा भी समर्थित किया गया था, जिसे नोवो नॉरडिस्क फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया जाता है, अनुदान संख्या NNF17SA0031406। लेखकों को उनकी कुशल तकनीकी सहायता के लिए करीना ओल्सन, Betina Bolmgren, और Irene Bech Nielsen (पोषण, व्यायाम और खेल विभाग, विज्ञान संकाय, कोपेनहेगन विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देना चाहते हैं।

अनुसंधान जानवरों से जुड़ी प्रक्रियाओं को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और स्थानीय कानून के अनुसार किया जाना चाहिए। इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी पशु प्रयोगों ने प्रायोगिक और अन्य वैज्ञानिक उद?...

कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक का बरकरार विनियमन समग्र स्वास्थ्य1 को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक की जांच अक्सर विभिन्न स्वास्थ्य-परि...

कंकाल की मांसपेशी में इंसुलिन और व्यायाम के जवाब में बाहरी स्थान से बड़ी मात्रा में ग्लूकोज निकालने की क्षमता होती है। यह पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने में मदद करता है और उच्च ऊर्जा की मांग के समय के दौरान ग्लूकोज की आपूर्ति को सुरक्षित करता है। चूंकि कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक के बरकरार विनियमन को समग्र स्वास्थ्य और शारीरिक प्रदर्शन 1,2 के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है, इसलिए विभिन्न स्थितियों के दौरान मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप पर बहुत ध्यान दिया गया है। मनुष्यों और जानवरों में, हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप का उपयोग विवो 3,4 में इंसुलिन संवेदनशीलता का आकलन करने के लिए सोने की मानक तकनीक के रूप में किया गया है। एक मौखिक ग्लूकोज सहिष्णुता परीक्षण से प्राप्त निष्कर्षों के विपरीत, हाइपरइन्सुलिनेमिक-यूग्लाइसेमिक क्लैंप तकनीक को अग्न्याशय से बरकरार गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल फ़ंक्शन या इंसुलिन स्राव की आवश्यकता नहीं होती है और इस प्रकार इंसुलिन प्रतिक्रियाओं को उन विषयों के बीच तुलना करने की अनुमति देता है जो गैस्ट्रो-आंतों और / या अग्नाशय के कार्य में भिन्नता प्रदर्शित करते हैं। मनुष्यों में व्यायाम के दौरान विवो में मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप 1960 के दशक के बाद से अक्सर किए गएहैं। पहले धमनीशिरापरक संतुलन तकनीकों के उपयोग से6 और बाद में पॉज़िट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग के उपयोग से एक पॉज़िट्रॉन उत्सर्जक ग्लूकोज एनालॉग जैसे 18एफ-फ्लोरो-डीऑक्सी-ग्लूकोज7 के साथ संयोजन में। कृन्तकों में, विवो में व्यायाम-प्रेरित मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक आमतौर पर रेडियोधर्मी या स्थिर आइसोटोप-लेबल ग्लूकोज एनालॉग्स 8,9,10 के उपयोग से किया जाता है।
विवो में मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप के लिए एक पूरक विधि, कृन्तकों से छोटी मांसपेशियों को अलग करना और इनक्यूबेट करना है और बाद में रेडियोधर्मी या स्थिर आइसोटोप-लेबल ग्लूकोज एनालॉग्स11,12,13 का उपयोग करके ग्लूकोज अपटेक को मापना है। यह विधि परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक दरों के सटीक और विश्वसनीय परिमाणीकरण की अनुमति देती है और विभिन्न इंसुलिन सांद्रता की उपस्थिति में और विद्युत उत्तेजना द्वारा प्राप्त संकुचन के दौरान की जा सकती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि अलग-थलग और इनक्यूबेटेड कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के माप प्रासंगिक हैं जब चूहों की मांसपेशियों के चयापचय फेनोटाइप की जांच की जाती है जो विभिन्न हस्तक्षेपों (जैसे पोषण, शारीरिक गतिविधि, संक्रमण, चिकित्सीय) से गुजरचुके हैं। पृथक कंकाल मांसपेशी मॉडल भी औषधीय यौगिक परीक्षण के लिए एक उपयुक्त उपकरण है जो प्रति से ग्लूकोज अपटेक को प्रभावित कर सकता है और / या इंसुलिन संवेदनशीलता12,14 को संशोधित कर सकता है। इस तरह, मांसपेशियों के ग्लूकोज चयापचय को विनियमित करने के लिए डिज़ाइन किए गए यौगिकों की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जा सकता है और पूर्व-नैदानिक पशु मॉडल में विवो परीक्षण में बाद में होने से पहले एक अत्यधिक नियंत्रित परिवेश में मूल्यांकन किया जा सकता है।
कुछ शर्तों के तहत, चयापचय व्यवहार्यता पृथक और ऊष्मायन कंकाल मांसपेशी मॉडल प्रणाली में एक चुनौती पैदा कर सकती है। दरअसल, इनक्यूबेटेड मांसपेशियों में एक संचार प्रणाली की कमी पर जोर देती है कि सब्सट्रेट (जैसे ऑक्सीजन और पोषक तत्व) का वितरण पूरी तरह से मांसपेशियों के तंतुओं और आसपास के वातावरण के बीच सरल प्रसार पर निर्भर करता है। इसके संबंध में, यह महत्वपूर्ण है कि इनक्यूबेटेड मांसपेशियां छोटी और पतली होती हैं और इस प्रकार,15 इनक्यूबेशन के दौरान ऑक्सीजन प्रसार के लिए एक बाधा का कम प्रतिनिधित्व करती हैं। विशेष रूप से कई घंटों के लिए लंबे समय तक ऊष्मायन के दौरान, हाइपोक्सिक राज्य अपर्याप्त ऑक्सीजन की आपूर्ति के कारण विकसित हो सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप मांसपेशियों की ऊर्जा में कमीहोती है। यद्यपि इनक्यूबेटेड चूहे की मांसपेशियों में चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों को पहले महत्वपूर्ण चर की पहचान के साथ रिपोर्ट किया गया है जो चूहे की मांसपेशियों की व्यवहार्यता को बनाए रखने में मदद करते हैं15, छोटे इनक्यूबेटेड माउस की मांसपेशियों में चयापचय व्यवहार्यता का एक व्यापक मूल्यांकन अभी भी वारंट किया गया है। इसलिए, वर्तमान में, ग्लाइकोजन सामग्री का उपयोग मुख्य रूप से इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशी16,17 में चयापचय व्यवहार्यता के मार्कर के रूप में किया गया है।
यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो बेसल, इंसुलिन- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए अलग-थलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशी में रेडियोलेबल [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल का उपयोग करके चूहों से एक बाहरी मार्कर के रूप में उपयोग करता है। वर्तमान अध्ययन में, ग्लूकोज अपटेक को 10 मिनट की अवधि के दौरान मापा गया था और विधि को उप-अधिकतम और अधिकतम प्रभावी इंसुलिन सांद्रता के साथ-साथ एक एकल संकुचन प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ प्रस्तुत किया गया है। हालांकि, यहां वर्णित प्रोटोकॉल को आसानी से इनक्यूबेशन समय, इंसुलिन-खुराक और विद्युत उत्तेजना प्रोटोकॉल के संबंध में संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, हम incubated soleus और EDL माउस मांसपेशी में चयापचय व्यवहार्यता के विभिन्न मार्करों की एक पूरी तरह से लक्षण वर्णन प्रदान करते हैं। परिणामों से संकेत मिलता है कि इनक्यूबेशन बफर के लिए ग्लूकोज पूरकता 1 घंटे के लिए ऊष्मायन की मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए आवश्यक है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

कंकाल की मांसपेशी एक इंसुलिन-उत्तरदायी ऊतक है और आमतौर पर अधिकांश ग्लूकोज लेती है जो भोजन के बाद रक्त में प्रवेश करती है। इसके अलावा, यह बताया गया है कि कंकाल की मांसपेशी आराम की स्थिति की तुलना में व्यायाम के दौरान रक्त से ग्लूकोज के निष्कर्षण को 50 गुना तक बढ़ा सकती है। व्यायाम और इंसुलिन उत्तेजना के दौरान मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक में वृद्धि इंट्रासेल्युलर डिब्बों से मांसपेशी कोशिका सतह झिल्ली तक ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GLUT4) के स्थानांतरण पर निर्भर करती है, साथ ही साथ हेक्सोकाइनेज II द्वारा ग्लूकोज -6-फॉस्फेट के लिए ग्लूकोज के फॉस्फोराइलेशन पर निर्भर करती है। अलगाव और माउस की मांसपेशियों का इनक्यूबेशन जैसे कि m. soleus और m. extensor digitorum longus (EDL) परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक पर इंसुलिन और विद्युत-प्रेरित संकुचन (व्यायाम के लिए एक मॉडल) के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक उपयुक्त पूर्व विवो मॉडल है। इस प्रकार, पूर्व विवो मॉडल मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता के मूल्यांकन की अनुमति देता है और संकुचन के दौरान मांसपेशियों के बल उत्पादन से मेल खाना संभव बनाता है जो मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के माप के दौरान मांसपेशियों के तंतुओं की समान भर्ती सुनिश्चित करता है। इसके अलावा, वर्णित मॉडल औषधीय यौगिक परीक्षण के लिए उपयुक्त है जिसका मांसपेशियों की इंसुलिन संवेदनशीलता पर प्रभाव पड़ सकता है या कंकाल की मांसपेशी ग्लूकोज अपटेक की नियामक जटिलता को चित्रित करने की कोशिश करते समय मदद मिल सकती है।
यहां हम वर्णन करते हैं और एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं कि कैसे इंसुलिन को मापने के लिए- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को अलग-थलग और इनक्यूबेटेड सोलस और ईडीएल मांसपेशियों की तैयारी में चूहों से रेडियोलेबल [3एच] 2-डीऑक्सी-डी-ग्लूकोज और [14सी] मैनिटोल का उपयोग करके एक एक्स्ट्रासेल्युलर मार्कर के रूप में। यह उलझन कारकों की अनुपस्थिति में परिपक्व कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के सटीक मूल्यांकन की अनुमति देता है जो बरकरार पशु मॉडल में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसके अलावा, हम इनक्यूबेटेड माउस कंकाल की मांसपेशियों की चयापचय व्यवहार्यता के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं जो यह सुझाव देते हैं कि लागू की गई विधि में मांसपेशियों की ऊर्जा चयापचय का अध्ययन करते समय कुछ शर्तों के तहत कुछ चेतावनी होती है।

जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, बेसल ग्लूकोज अपटेक दर मादा चूहों से अलग-थलग सोलस और ईडीएल मांसपेशियों के बीच समान थी। 12,13,19,20 से पहले भी कई ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

पूरे शरीर के ग्लूकोज होमियोस्टैसिस को बनाए रखने के लिए मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक का बरकरार विनियमन महत्वपूर्ण है। यह प्रोटोकॉल इंसुलिन का आकलन प्रस्तुत करता है- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज अपटेक पृथक और इनक्यूबेटेड परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में जब पूरे शरीर के ग्लूकोज चयापचय पर विभिन्न शारीरिक हस्तक्षेपों के प्रभाव को चित्रित करता है।

इंसुलिन का माप- और संकुचन-प्रेरित ग्लूकोज चूहों से पृथक और ऊष्मायन परिपक्व कंकाल की मांसपेशी में अपटेक

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

पूर्व विवो मॉडल विभिन्न शारीरिक हस्तक्षेपों और औषधीय यौगिकों और मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी विधि है। यह तकनीक अलग-थलग माउस कंकाल की मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक के सटीक मूल्यांकन के लिए अनुमति देती है, जो एक बरकरार पशु मॉडल में हस्तक्षेप कर सकते हैं। एक प्रयोग शुरू करने से पहले, एकीकृत मांसपेशी पट्टी जीवनी प्रणाली पर स्विच करें और कक्षों को 30 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।डेटा संग्रह सॉफ़्टवेयर खोलें और डेटा सेट के बीच तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए मजबूर ट्रांसड्यूसर को कैलिब्रेट करें। प्रत्येक इनक्यूबेशन कक्ष में चार मिलीलीटर पूर्व-गर्म 30 डिग्री सेल्सियस बेसल इनक्यूबेशन माध्यम जोड़ें और सुनिश्चित करें कि माध्यम लगातार 95% ऑक्सीजन और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ऑक्सीजन युक्त है। माउस को विच्छेदन ट्रे पर प्रवण स्थिति में रखें और पेडल रिफ्लेक्स की प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करें।फिर एक सुई के साथ एक एकल सामने पंजा नीचे पिन करें। निचले पैर से त्वचा को हटाने के लिए कैंची का उपयोग करें जब तक कि अकिलीज़ कण्डरा और घुटने के जोड़ दोनों दिखाई न दें। Soleus मांसपेशी के विच्छेदन के लिए, एक एकल 0.4 सेंटीमीटर व्यास टांका पाश एक 16 सेंटीमीटर गैर अवशोषक सर्जिकल नायलॉन टांके के टुकड़े से तैयार achilles कण्डरा और सुरक्षित peen संदंश achilles कण्डरा के लिए दूरस्थ रूप से पाश करने के लिए संलग्न करें।पंजे से सोलस और गैस्ट्रोकेनेमियस मांसपेशियों को जारी करने के लिए कटौती करें और सोलस मांसपेशी को उजागर करने के लिए माउस भर में पीन संदंश को सावधानीपूर्वक स्लाइड करें। पीन संदंश नीचे पिन और soleus मांसपेशी के समीपस्थ कण्डरा के चारों ओर एक दूसरे टांका पाश जगह. समीपस्थ कण्डरा काटें और gastrocnemius मांसपेशी से मुक्त दो संलग्न टांका छोरों सहित soleus विच्छेदन।संग्रह पर, इनक्यूबेशन कक्षों में से एक में संबंधित हुक के लिए सोलस मांसपेशी को जल्दी से संलग्न करने के लिए छोरों का उपयोग करें। टिबियालिस पूर्वकाल मांसपेशी को कवर करने वाले प्रावरणी को हटाने के लिए संदंश का उपयोग करें। टिबिलिस पूर्वकाल या ईडीएल मांसपेशियों के डिस्टल टेंडन स्पष्ट सफेद, दृश्यमान और एक-दूसरे से अलग होने चाहिए।टिबियलिस पूर्वकाल की मांसपेशियों के डिस्टिल कण्डरा में कटौती करें और मांसपेशियों को विच्छेदन करें। आसपास के ऊतकों से ईडीएल मांसपेशी को धीरे से मुक्त करने के लिए संदंश का उपयोग करें, जिससे मांसपेशियों को टेंडन को काटने के बिना बरकरार रखा जा सके। डिस्टिल और समीपस्थ ईडीएल टेंडन के चारों ओर अलग-अलग सीवन लूप रखें।जब छोरों को रखा गया है, तो ईडीएल मांसपेशी को सिवनी लूप के साथ जारी करने के लिए टेंडन में कटौती करें और जल्दी से दूसरे इनक्यूबेशन कक्ष में हुक के लिए छोरों को संलग्न करें। फिर प्रत्येक मांसपेशी के आराम के तनाव को लगभग पांच मिलेनटॉन में समायोजित करें और प्रयोग शुरू करने से पहले मांसपेशियों को कम से कम 10 मिनट के लिए माध्यम में संतुलित करने की अनुमति दें। इंसुलिन प्रेरित ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए, कक्षों में बेसल इनक्यूबेशन माध्यम को इंसुलिन के बिना इनक्यूबेशन माध्यम के साथ बदलें, एक उप-अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता, या 20 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए अधिकतम प्रभावी इंसुलिन एकाग्रता।उत्तेजना की अवधि के अंत में, इनक्यूबेशन माध्यम को ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन माध्यम के साथ बदलें जिसमें 10 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए इंसुलिन की समान एकाग्रता होती है। ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन के अंत में, इनक्यूबेशन कक्षों से मांसपेशियों को सावधानीपूर्वक हटा दें और नमूनों को बर्फ के ठंडे बेसल इनक्यूबेशन माध्यम में धोएं। धोने के बाद, फ़िल्टर पेपर पर मांसपेशियों को जल्दी से सुखाएं और तरल नाइट्रोजन में सीवन छोरों के बिना ऊतक को फ्रीज करें।फिर 20 डिग्री सेल्सियस भंडारण और मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक विश्लेषण के लिए प्रत्येक कक्ष से 100 माइक्रोलीटर इनक्यूबेशन माध्यम के ग्लूकोज अपटेक एकत्र करें। संकुचन को मापने के लिए प्रेरित ग्लूकोज अपटेक, प्लैटिनम इलेक्ट्रोड को केंद्रीय रूप से और इनक्यूबेशन कक्षों के भीतर मांसपेशियों के दोनों किनारों पर रखें, और बेसल इनक्यूबेशन माध्यम को ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन माध्यम से बदलने के तुरंत बाद मांसपेशियों के संकुचन को शुरू करें। प्रत्येक incubated मांसपेशी से मजबूर उत्पादन रिकॉर्ड.10 मिनट के बाद, धीरे से मांसपेशियों को इकट्ठा करें और फ्रीज करें जैसा कि प्रदर्शन किया गया है, मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक विश्लेषण के लिए प्रत्येक कक्ष से ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन माध्यम के 100 माइक्रोलीटर एलीकोट को संग्रहीत करना जैसा कि प्रदर्शित किया गया है। मांसपेशियों के नमूनों के एक ही सेट में पश्चिमी ब्लोटिंग विश्लेषण द्वारा मायोसेलुलर सिग्नलिंग को निर्धारित करने के लिए, बर्फ के ठंडे होमोजेनाइजेशन बफर के 400 माइक्रोलीटर में प्रत्येक जमे हुए मांसपेशी नमूने को homogenize करें और चार डिग्री सेल्सियस पर एक घंटे के लिए अंत में नमूना अंत में घुमाएं। फिर केन्द्रापसारकीकरण द्वारा लिकेट एकत्र करें और मानक पश्चिमी धब्बा विश्लेषण प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक नमूना फूस के भीतर ब्याज के प्रोटीन की मात्रा को मापें।प्रत्येक नमूने में ग्लूकोज अपटेक को मापने के लिए, प्रत्येक नमूने से supernatant के 150 माइक्रोलीटर और ग्लूकोज अपटेक इनक्यूबेशन माध्यम के 25 माइक्रोलीटर को संबंधित इनक्यूबेशन कक्षों से तरल scintillation गिनती शीशियों को अलग करने के लिए जोड़ें जिसमें प्रति शीशी तरल पदार्थ के तीन मिलीलीटर तरल सिंटिलेशन तरल पदार्थ होते हैं। फिर शीशियों को एक तरल सिंटिलेशन काउंटर पर लोड करें और निर्माता के दिशानिर्देशों के अनुसार दो डीऑक्सीग्लूकोज और मैनिटोल की रेडियोधर्मिता को मापें। इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, बेसल ग्लूकोज अपटेक दर महिला चूहों से अलग किए गए सोलस और ईडीएल मांसपेशियों के बीच समान थी।ग्लूकोज अपटेक दोनों submaximally और अधिकतम प्रभावी इंसुलिन सांद्रता के जवाब में soleus और EDL मांसपेशियों में वृद्धि हुई। इसके अलावा, दोनों submaximal और अधिकतम इंसुलिन प्रेरित ग्लूकोज uptakes soleus मांसपेशी में काफी अधिक थे. इसके विपरीत, संकुचन प्रेरित ग्लूकोज अपटेक सोलस मांसपेशी की तुलना में ईडीएल में काफी अधिक था।यहां, 10 मिनट की उत्तेजना अवधि के दौरान सोलस और ईडीएल मांसपेशियों में उत्पादित अधिकतम मांसपेशी बल को देखा जा सकता है। जैसा कि अपेक्षित था, ईडीएल मांसपेशी ने उत्तेजना अवधि के प्रारंभिक भाग के दौरान अधिक बल उत्पन्न किया, इसके बाद उत्तेजना अवधि में बाद में तेजी से गिरावट आई। Submaximal और अधिकतम इंसुलिन सांद्रता Akt threonine 308 और TBC1D4 Serine 588 के फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि को प्रेरित किया, जबकि संकुचन AMPK अल्फा threonine 172 और ACC सेरीन 212 के फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि को प्रेरित किया।न तो इंसुलिन और न ही संकुचन ने कुल प्रोटीन सामग्री में बदलाव का नेतृत्व किया। अलग-थलग माउस मांसपेशियों में ग्लूकोज अपटेक को मापने का प्रयास करने से पहले, सोलस और ईडीएल मांसपेशियों के विच्छेदन का पूरी तरह से अभ्यास करना महत्वपूर्ण है। मांसपेशियों के ग्लूकोज अपटेक के आकलन के बाद, शेष मांसपेशी प्रोटीन लिसेट का उपयोग अतिरिक्त जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है जो ग्लूकोज अपटेक दरों में देखे गए परिवर्तनों को स्पष्ट कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

Vivo में माइक्रो परिसंचरण कंकाल की मांसपेशी में अंतरराज्यीय महत्वपूर्ण माइक्रोस्कोपी द्वारा मापन

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

वयस्क और भ्रूण के कंकाल की मांसपेशी Microexplant संस्कृति और कंकाल की मांसपेशी स्टेम सेल के अलगाव

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से Mitochondrial अलगाव

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

कंकाल की मांसपेशी से progenitors के शोधन

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

स्टोर संचालित जीवित कोशिकाओं में कैल्शियम प्रविष्टि प्रतिदीप्ति आधारित मापन संवर्धित सेल कैंसर से कंकाल की मांसपेशी फाइबर

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

पृथक कंकाल की मांसपेशियों में सिकुड़ना fatigability, और alternans के पूर्व vivo आकलन

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

अलगाव और व्यक्तिगत और वयस्क कंकाल की मांसपेशी से myofibers अपने उपग्रह कोशिकाओं की संस्कृति

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

कैल्शियम का आकलन बरकरार कंकाल की मांसपेशी फाइबर में स्पार्क्स

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

मानव कंकाल की मांसपेशी से रक्त वाहिका व्युत्पन्न multipotent व्यापारियों का अलगाव

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

औषध अनुसंधान के लिए अलग ऊतक स्नान-अनुप्रयोगों में चिकनी मांसपेशी समारोह के मापन

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...