Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
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この研究は、デンマーク独立研究医学評議会(FSS8020-00288B)とノボノルディスク財団(NNF160C0023046)からの助成金によって支援されました。この研究は、ノボノルディスク財団の助成金番号NNF17SA0031406からデンマーク糖尿病アカデミーからラスムス・キョブステッドへの研究助成金によっても支援されました。著者らは、カリーナ・オルセン、ベティナ・ボルムグレン、アイリーン・ベック・ニールセン(コペンハーゲン大学理学部栄養・運動・スポーツ学科)の熟練した技術支援に感謝したい。

研究動物に関する手続きは、関連するガイドラインおよび現地の法律に従って実施されるべきである。この研究に使用されたすべての動物実験は、実験的およびその他の科学的目的に使用される脊椎動物の保護に関する欧州条約に準拠しており、デンマーク動物実験検査官によって承認されました。
1. 実験装置及び縫合ループの作製
注:この研究では?...

骨格筋におけるグルコース取り込みの無傷の調節は、全体的な健康を維持するために重要である1。したがって、筋肉のグルコース取り込みの調査は、様々な健康を変える介入を評価する際の主要な読み出しとしてしばしば役立つ。ここで我々は、インスリンおよび電気的に誘導された収縮に応答してマウスから単離およびインキュベートされたヒラメおよびEDL筋肉における...

骨格筋は、インスリンおよび運動に応答して細胞外空間から大量のグルコースを抽出する能力を有する。これは、全身のグルコース恒常性を維持するのに役立ち、高いエネルギー需要の時にグルコース供給を確保します。骨格筋グルコース取り込みの無傷の調節が全体的な健康および身体能力にとって重要であることが示されているので1,2、様々な状態における筋肉グルコース取り込みの測定は多くの注目を集めている。ヒトおよび動物において、高インスリン血症 - 正常血糖クランプは、インビボでのインスリン感受性を評価するためのゴールドスタンダード技術として使用されている3,4。経口糖負荷試験から得られた所見とは対照的に、高インスリン血糖 - 正常血糖クランプ技術は、無傷の胃腸機能または膵臓からのインスリン分泌を必要としないため、胃腸および/または膵臓機能に変動を示す被験者間でインスリン応答を比較することを可能にする。ヒトにおける運動中の生体内での筋肉グルコース取り込みの測定は、1960年代から頻繁に行われてきた5。最初に動静脈平衡技術6の使用によって、そして後に陽電子放出グルコース類似体例えば18F−フルオロデオキシグルコース7と組み合わせた陽電子放出断層撮影(PET)画像化の使用による。げっ歯類において、運動刺激筋肉インビボでのグルコース取り込みは、典型的には、放射性または安定同位体標識グルコース類似体8、9、10の使用によって行われる。
インビボでの筋肉グルコース取り込みの測定に相補的な方法は、げっ歯類から小筋肉を単離およびインキュベートし、続いて放射性または安定同位体標識グルコース類似体を用いてグルコース取り込みを測定することである11、12、13。この方法は、成熟骨格筋におけるグルコース取り込み速度の正確かつ信頼性の高い定量を可能にし、様々なインスリン濃度の存在下で、および電気刺激によって誘発される収縮中に行うことができる。さらに重要なことに、単離およびインキュベートされた骨格筋におけるグルコース取り込みの測定は、様々な介入(例えば栄養、身体活動、感染、治療薬)を受けたマウスの筋肉代謝表現型を調査する際に関連性がある。単離された骨格筋モデルは、グルコース取り込み自体に影響を及ぼし、および/またはインスリン感受性を変化させる可能性のある薬理学的化合物試験のための適切なツールでもある12,14。このようにして、筋肉グルコース代謝を調節するように設計された化合物の有効性を、前臨床動物モデルにおけるその後のin vivo試験の前に、高度に制御された環境で試験および評価することができる。
いくつかの条件下では、代謝生存率は、単離およびインキュベートされた骨格筋モデル系において課題を提起し得る。実際、インキュベートされた筋肉における循環系の欠如は、基質(例えば酸素および栄養素)の送達が筋線維と周囲の環境との間の単純な拡散に完全に依存することを伴う。これに関して、インキュベートされた筋肉が小さくて薄く、したがって、インキュベーション中の酸素拡散のための障壁が少ないことが重要である15。特に数時間の長時間のインキュベーション中に、酸素供給が不十分で筋肉エネルギーが枯渇するため、低酸素状態が発症することがあります15。インキュベートされたラット筋肉における代謝生存率の様々なマーカーが、ラット筋肉の生存率を維持するのに役立つ重要な変数の同定とともに以前に報告されているが15、小さなインキュベートされたマウス筋肉における代謝生存率の包括的な評価は依然として正当化される。したがって、現在のところ、グリコーゲン含量は、主にインキュベートされたマウス骨格筋における代謝生存率のマーカーとして使用されている16、17。
ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメ筋およびEDL筋における基礎、インスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定するための詳細なプロトコールについて説明する。本研究では、グルコース取り込みを10分間に測定し、この方法は、サブ最大および最大に有効なインスリン濃度ならびに単一の収縮プロトコールの使用を提示する。しかしながら、本明細書に記載されるプロトコルは、インキュベーション時間、インスリン投与量、および電気刺激プロトコルに関して容易に変更することができる。さらに、インキュベートされたヒラメおよびEDLマウス筋肉における代謝生存率の様々なマーカーの徹底的な特徴付けを提供する。この結果は、インキュベーションバッファーへのグルコース補給が、1時間インキュベートした筋肉の代謝生存率を維持するために不可欠であることを示している。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

骨格筋はインスリン応答性組織であり、典型的には食事後に血液に入るグルコースの大部分を吸収する。また、骨格筋は、運動中に血液からのグルコースの抽出を安静時に比べて最大50倍に増加させることが報告されている。運動およびインスリン刺激中の筋肉グルコース取り込みの増加は、細胞内区画から筋細胞表面膜へのグルコーストランスポーター4(GLUT4)の転座、ならびにヘキソキナーゼIIによるグルコースのグルコース-6-リン酸へのリン酸化に依存する。ミレやm.エクステンサー・デジトルム・ロンガス(EDL)などのマウス筋肉の単離とインキュベーションは、成熟骨格筋におけるグルコース取り込みに対するインスリンおよび電気的に誘発された収縮(運動のためのモデル)の影響を研究するための適切なエクスビボモデルである。したがって、ex vivoモデルは、筋インスリン感受性の評価を可能にし、収縮中の筋力産生を一致させ、筋グルコース取り込みの測定中に筋線維の均一な動員を保証することを可能にする。さらに、記載されたモデルは、筋インスリン感受性に影響を与え得るか、または骨格筋グルコース取り込みの調節的複雑さを描写しようとする際に有用であり得る薬理学的化合物試験に適している。
ここでは、放射性標識された[3H]2-デオキシ-D-グルコースおよび[14C]マンニトールを細胞外マーカーとして用いて、マウスから単離およびインキュベートしたヒラメおよびEDL筋肉調製物におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みを測定する方法に関する詳細なプロトコールを記載および提供する。これにより、無傷の動物モデルに干渉し得る交絡因子の非存在下での成熟骨格筋におけるグルコース取り込みの正確な評価が可能になる。さらに、我々は、インキュベートされたマウス骨格筋の代謝生存率に関する情報を提供し、筋肉エネルギー代謝を研究する際に、適用された方法が特定の条件下でいくつかの注意点を有することを示唆している。

図2に示すように、基礎グルコース取り込み速度は、雌マウスから単離されたヒラメとEDL筋との間で類似していた。これはまた、12、13、19、20の前に数回報告されています。グルコース取り込みは、最大以下の有効インスリン濃度(100μU/mL)に応答して?...

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Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

筋肉グルコース取り込みの無傷の調節は、全身グルコース恒常性を維持するために重要である。このプロトコルは、全身のグルコース代謝に対する様々な生理学的介入の影響を描写する際に、単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの評価を提示する。

マウスから単離およびインキュベートされた成熟骨格筋におけるインスリンおよび収縮刺激グルコース取り込みの測定

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

このエクスビボモデルは、種々の生理学的介入ならびに薬理学的化合物ならびに筋肉グルコース取り込みの影響を評価するための有用な方法である。この技術は、無傷の動物モデルにおいて干渉し得る交絡因子の非存在下で、単離されたマウス骨格筋におけるグルコース取り込みの正確な評価を可能にする。実験を開始する前に、統合された筋ストリップバイオグラフシステムのスイッチを入れ、チャンバーを摂氏30度に温めます。データ収集ソフトウェアを開き、強制トランスデューサを較正して、データセット間の比較可能性を確保します。予め加温した摂氏30度の基礎インキュベーション培地4ミリリットルを各インキュベーションチャンバに加え、培地が95%の酸素と5%の二酸化炭素で連続的に酸素化されていることを確認します。マウスを解剖トレイの臥位に置き、ペダル反射に反応しないことを確認します。次に、1本の前足を針で固定します。はさみを使用して、アキレス腱と膝関節の両方が見えるまで下肢から皮膚を取り除きます。ヒラメ筋の解剖のために、16センチメートルの非吸収性外科用ナイロン縫合糸片から調製した直径0.4センチメートルの縫合ループを1本アキレス腱に取り付け、ピーン鉗子をアキレス腱の遠位に固定する。ヒラメと腓腹筋を足から離すために切断し、マウスを横切ってピーン鉗子を慎重にスライドさせてヒラメの筋肉を露出させます。ピーン鉗子をピン留めし、ヒラメの近位腱の周りに2回目の縫合ループを置きます。近位腱を切断し、腓腹筋のない2つの取り付けられた縫合ループを含むヒラメを解剖する。収集時に、ループを使用して、ヒラメ筋をインキュベーションチャンバの1つのそれぞれのフックにすばやく取り付けます。鉗子を使用して、脛骨前筋を覆う筋膜を除去します。脛骨前筋またはEDL筋の遠位腱は、透明で、目に見え、互いに分離しているべきである。脛骨前筋の蒸留腱を切断し、筋肉を解剖する。鉗子を使用してEDL筋肉を周囲の組織から優しく解放し、腱を切断することなく筋肉をそのまま残します。蒸留および近位EDL腱の周りに個々の縫合ループを配置する。ループが配置されたら、縫合ループを取り付けた状態で腱を切断してEDL筋を解放し、ループを第2インキュベーションチャンバ内のフックに素早く取り付けます。次に、各筋肉の安静時張力を約5ミリニュートンに調整し、実験を開始する前に筋肉が培地中で少なくとも10分間平衡化するようにします。インスリン刺激グルコース取り込みを測定するには、チャンバー内の基礎インキュベーション培地を、インスリンを含まないインキュベーション培地、最大以下の有効インスリン濃度、または最大有効インスリン濃度の20分間のインキュベーションと交換する。刺激期間の終わりに、インキュベーション培地を、同一濃度のインスリンを含むグルコース取り込みインキュベーション培地と交換し、10分間インキュベーションする。グルコース取り込みインキュベーションの最後に、インキュベーションチャンバから筋肉を慎重に取り出し、氷冷基礎インキュベーション培地でサンプルを洗浄します。洗浄後、ろ紙の上で筋肉をすばやく乾燥させ、液体窒素中の縫合糸ループなしで組織を凍結する。次いで、各チャンバーから100マイクロリットルのグルコース取り込みインキュベーション培地を収集し、摂氏20度貯蔵および筋肉グルコース取り込み分析を行う。収縮刺激されたグルコース取り込みを測定するには、インキュベーションチャンバ内の筋肉の中央および両側に白金電極を配置し、基礎インキュベーション培地をグルコース取り込みインキュベーション培地に交換した直後に筋肉収縮を開始する。インキュベートされた各筋肉からの強制生産を記録する。10分後、実証したように筋肉を穏やかに収集および凍結し、実証されるように筋肉グルコース取り込み分析のために各チャンバーから100マイクロリットルのグルコース取り込みインキュベーション培地を貯蔵する。筋肉サンプルの同じセットにおけるウェスタンブロッティング分析によって筋細胞シグナル伝達を決定するために、各凍結筋肉サンプルを400マイクロリットルの氷冷ホモジナイズバッファーでホモジナイズし、サンプル端を摂氏4度で1時間回転させる。次いで、遠心分離によってリケートを収集し、標準的なウェスタンブロット分析プロトコルに従って、各サンプルパレット内の目的のタンパク質の量を測定する。各サンプルにおけるグルコース取り込みを測定するために、各サンプルから150マイクロリットルの上清および対応するインキュベーションチャンバから25マイクロリットルのグルコース取り込みインキュベーション培地を加えて、バイアル当たり3ミリリットルの液体シンチレーション流体を含むバイアルを数える液体シンチレーションを分離する。次に、バイアルを液体シンチレーションカウンターにロードし、メーカーのガイドラインに従って2つのデオキシグルコースとマンニトールの放射能を測定します。この代表的な分析において、基礎グルコース取り込み速度は、雌マウスから単離されたヒラメ筋およびEDL筋肉間で類似していた。ヒラメおよびEDL筋肉におけるグルコース取り込みは、サブ最大および最大有効インスリン濃度の両方に応答して増加した。さらに、最大以下および最大インスリン刺激グルコース取り込みの両方がヒラメ筋において有意に高かった。対照的に、収縮誘導グルコース取り込みは、ヒラメ筋と比較してEDLにおいて有意に高かった。ここで、10分間の刺激期間中にヒラメ筋およびEDL筋に生じる最大筋力が観察され得る。予想通り、EDL筋は刺激期間の初期により多くの力を生成し、その後、刺激期間の後半に急速に減少した。最大以下および最大インスリン濃度は、Aktスレオニン308およびTBC1D4セリン588のリン酸化の増加を誘導し、一方、収縮はAMPKアルファスレオニン172およびACCセリン212のリン酸化の増加を誘導した。インスリンも収縮も総タンパク質含有量の変化をもたらさなかった。単離されたマウスの筋肉におけるグルコース取り込みを測定しようとする前に、ヒラメおよびEDL筋肉の解剖を徹底的に実践することが不可欠である。筋肉グルコース取り込みの評価に続いて、残りの筋肉タンパク質溶解物を、グルコース取り込み速度の観察された変化を解明し得る追加の生化学的分析に使用することができる。

Research

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Biology

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Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...