Name: measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice
Uploaded: 2021-05-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

Bu çalışma, Danimarka Bağımsız Araştırma Konseyi - Tıp Bilimleri (FSS8020-00288B) ve Novo Nordisk Vakfı'ndan (NNF160C0023046) gelen hibelerle desteklenmiştir. Bu çalışma aynı zamanda Novo Nordisk Vakfı tarafından finanse edilen Danimarka Diyabet Akademisi'nden Rasmus Kjøbsted'e NNF17SA0031406 hibe numaralı bir araştırma hibesi ile desteklendi. Yazarlar, yetenekli teknik yardımları için Karina Olsen, Betina Bolmgren ve Irene Bech Nielsen'e (Kopenhag Üniversitesi Fen Fakültesi Beslenme, Egzersiz ve Spor Bölümü) teşekkür eder.

Araştırma hayvanlarını içeren prosedürler, ilgili kılavuzlara ve yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Bu çalışma için kullanılan tüm hayvan deneyleri, Deneysel ve Diğer Bilimsel Amaçlar için kullanılan Omurgalı Hayvanların Korunmasına İlişkin Avrupa Sözleşmesi'ne uygun ve Danimarka Hayvan Deneyleri Müfettişliği tarafından onaylanmıştır.
1. Deney aparatlarının ve dikiş ilmeklerinin hazırlanması
NOT: Bu çalışma içi...

İskelet kasında glikoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, genel sağlığın korunması için önemlidir1. Bu nedenle, kas glukozu alımının araştırılması, çeşitli sağlık değiştirici müdahaleleri değerlendirirken genellikle birincil okuma görevi görür. Burada, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kasılmalara yanıt olarak farelerden izole ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında glikoz alımını ölçmek için bir ex vivo yöntemi tanımlamaktayız. Y...

İskelet kası, insülin ve egzersize yanıt olarak hücre dışı boşluktan büyük miktarlarda glikoz çıkarma yeteneğine sahiptir. Bu, tüm vücut glikoz homeostazının korunmasına yardımcı olur ve yüksek enerji talebi zamanlarında glikoz arzını güvence altına alır. İskelet kası glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesinin genel sağlık ve fiziksel performans için önemli olduğu gösterildiğinden1,2, çeşitli koşullar sırasında kas glikozu alımının ölçümleri çok dikkat çekmiştir. İnsanlarda ve hayvanlarda, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe, insülin duyarlılığını in vivo 3,4 değerlendirmek için altın standart teknik olarak kullanılmıştır. Oral glukoz tolerans testinden elde edilen bulguların aksine, hiperinsülinemik-öglisemik kelepçe tekniği sağlam gastrointestinal fonksiyon veya pankreastan insülin sekresyonu gerektirmez ve bu nedenle insülin yanıtlarının gastro-intestinal ve / veya pankreas fonksiyonunda farklılıklar gösteren denekler arasında karşılaştırılmasına izin verir. İnsanlarda egzersiz sırasında in vivo kas glukozu alımının ölçümleri 1960'lardan beri sıklıkla yapılmaktadır5. İlk önce arteriyovenöz denge teknikleri6 kullanılarak ve daha sonra pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntülemenin pozitron yayan glikoz analoğu ile kombinasyon halinde kullanılmasıyla, örneğin 18F-Floro-deoksi-glukoz7. Kemirgenlerde, egzersizle uyarılan kas glukoz alımı in vivo olarak radyoaktif veya stabil izotop etiketli glikoz analogları 8,9,10 kullanılarak gerçekleştirilir.
Kas glukoz alımının in vivo ölçümlerine tamamlayıcı bir yöntem, küçük kasları kemirgenlerden izole etmek ve inkübe etmek ve daha sonra radyoaktif veya stabil izotop etiketli glikoz analogları11,12,13 kullanarak glikoz alımını ölçmektir. Bu yöntem, olgun iskelet kasında glikoz alım oranlarının doğru ve güvenilir bir şekilde ölçülmesini sağlar ve çeşitli insülin konsantrasyonlarının varlığında ve elektriksel stimülasyonun neden olduğu kontraksiyon sırasında gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, izole edilmiş ve inkübe edilmiş iskelet kasında glikoz alımının ölçümleri, çeşitli müdahalelere (örneğin beslenme, fiziksel aktivite, enfeksiyon, terapötikler) maruz kalan farelerin kas metabolik fenotipini araştırırken önemlidir. İzole iskelet kası modeli aynı zamanda glikoz alımını kendi başına etkileyebilecek ve / veya insülin duyarlılığını değiştirebilecek farmakolojik bileşik testi için uygun bir araçtır12,14. Bu şekilde, kas glukoz metabolizmasını düzenlemek için tasarlanmış bileşiklerin etkinliği, klinik öncesi hayvan modellerinde daha sonra in vivo testlerden önce oldukça kontrollü bir ortamda test edilebilir ve değerlendirilebilir.
Bazı koşullar altında, metabolik canlılık, izole edilmiş ve inkübe edilmiş iskelet kası model sisteminde bir zorluk oluşturabilir. Gerçekten de, inkübe edilmiş kaslarda dolaşım sisteminin olmaması, substratların (örneğin oksijen ve besinler) verilmesinin tamamen kas lifleri ve çevresindeki ortam arasındaki basit difüzyona bağlı olmasını gerektirir. Bununla ilgili olarak, inkübe edilen kasların küçük ve ince olması ve bu nedenle inkübasyon sırasında oksijen difüzyonu için daha az bariyer oluşturması önemlidir15. Özellikle birkaç saat boyunca uzun süreli inkübasyonlar sırasında, kas enerjisinin tükenmesine neden olan yetersiz oksijen kaynağı nedeniyle hipoksik durumlar gelişebilir15. Her ne kadar inkübe edilmiş sıçan kasında metabolik canlılığın çeşitli belirteçleri, sıçan kas canlılığının korunmasına yardımcı olan önemli değişkenlerin tanımlanmasının yanı sıra daha önce bildirilmiş olsa da,15, küçük inkübe fare kaslarında metabolik canlılığın kapsamlı bir değerlendirmesi hala garanti edilmektedir. Bu nedenle, şu anda, glikojen içeriği esas olarak inkübe edilmiş fare iskelet kası16,17'de metabolik canlılığın bir belirteci olarak kullanılmıştır.
Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kasında bazal, insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için ayrıntılı bir protokol tanımlamaktayız. Bu çalışmada, glukoz alımı 10 dakikalık bir süre boyunca ölçülmüş ve yöntem, submaksimal ve maksimal etkili insülin konsantrasyonlarının yanı sıra tek bir kasılma protokolü kullanılarak sunulmuştur. Bununla birlikte, burada açıklanan protokoller inkübasyon süresi, insülin dozu ve elektriksel stimülasyon protokolü açısından kolayca değiştirilebilir. Ayrıca, inkübe soleus ve EDL fare kasında metabolik canlılığın çeşitli belirteçlerinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlıyoruz. Sonuçlar, inkübasyon tamponuna glikoz takviyesinin, 1 saat boyunca inkübe edilen kasın metabolik canlılığını korumak için gerekli olduğunu göstermektedir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>[14C]D-mannitol</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ARC 0127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[3H]2-deoxy-D-glucose&#160;</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals, Inc.</td>
			<td>ART 0103A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Deoxy-D-glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-0 USP non-sterile surgical nylon suture</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>51-7698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin/HRP (Conjugate)</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0397</td>
			<td>Used to detect ACC protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akt2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK&#945;2 antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-19131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aprotinin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A1153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1020831000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calibration kit (force)</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemiluminescence</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>WBLUF0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1084180100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data collection program</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>LabVIEW software version 7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Visking</td>
			<td>DTV.12000.09 Size No.9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>ChemiDoc MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma EDS</td>
			<td>E9884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical Pulse Stimulator</td>
			<td>Digitimer</td>
			<td>D330 MultiStim System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Novo Nordisk</td>
			<td>Actrapid, 100 IE/mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049361000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>104873025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>leupeptin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1058860500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muscle Strip Myograph System</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>Model 820MS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Orthovanadate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyrophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>221368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106041000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27778260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pACC Ser212 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>3661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAkt Thr308 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAMPK Thr172 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonylfluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum electrodes</td>
			<td>Danish Myo Technology A/S</td>
			<td>300145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pTBC1D4 Ser588 antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>8730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Tri-Carb-2910TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scintillation fluid&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>6013329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Statistical analyses software</td>
			<td>Systat</td>
			<td>SigmaPlot version 14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBC1D4 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab189890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrapure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>Milli-Q Reference A+ System</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of insulin- and contraction-stimulated glucose uptake in isolated and incubated mature skeletal muscle from mice

İskelet kası insüline duyarlı bir dokudur ve tipik olarak bir yemekten sonra kana giren glikozun çoğunu alır. Ayrıca, iskelet kasının egzersiz sırasında kandan glikoz ekstraksiyonunu dinlenme koşullarına kıyasla 50 kata kadar artırabileceği bildirilmiştir. Egzersiz ve insülin stimülasyonu sırasında kas glukoz alımındaki artış, glikoz taşıyıcı 4'ün (GLUT4) hücre içi bölmelerden kas hücresi yüzey zarına translokasyonuna ve ayrıca glikozun heksokinaz II tarafından glikoz-6-fosfata fosforilasyonuna bağlıdır. M. soleus ve m . extensor digitorum longus (EDL) gibi fare kaslarının izolasyonu ve inkübasyonu, insülin ve elektriksel olarak indüklenen kontraksiyonun (egzersiz için bir model) olgun iskelet kasında glikoz alımı üzerindeki etkilerini incelemek için uygun bir ex vivo modeldir. Böylece, ex vivo model, kas insülin duyarlılığının değerlendirilmesine izin verir ve kas glikoz alımının ölçümleri sırasında kas liflerinin düzgün bir şekilde alınmasını sağlayan kasılma sırasında kas kuvveti üretimini eşleştirmeyi mümkün kılar. Ayrıca, tarif edilen model, kas insülin duyarlılığı üzerinde etkisi olabilecek veya iskelet kası glikoz alımının düzenleyici karmaşıklığını tanımlamaya çalışırken yardımcı olabilecek farmakolojik bileşik testi için uygundur.
Burada, hücre dışı bir belirteç olarak radyoetiketli [3H]2-deoksi-D-glukoz ve [14C] mannitol kullanılarak farelerden izole edilmiş ve inkübe edilmiş soleus ve EDL kas preparatlarında insülin ve kasılma ile uyarılmış glikoz alımının nasıl ölçüleceğine dair ayrıntılı bir protokol açıklıyor ve sunuyoruz. Bu, olgun iskelet kasındaki glikoz alımının, bozulmamış hayvan modeline müdahale edebilecek kafa karıştırıcı faktörlerin yokluğunda doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Ek olarak, inkübe edilmiş fare iskelet kasının metabolik canlılığı hakkında bilgi veriyoruz, bu da uygulanan yöntemin kas enerjisi metabolizmasını incelerken belirli koşullar altında bazı uyarılara sahip olduğunu düşündürmektedir.

Şekil 2'de gösterildiği gibi, bazal glikoz alım oranları, dişi farelerden izole soleus ve EDL kası arasında benzerdi. Bu da12,13,19,20'den önce birkaç kez bildirilmiştir. Glikoz alımı, submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonuna (100 μU / mL) yanıt olarak, soleus ve EDL kasında sırasıyla 12 ve 9 μmol /...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice at JoVE.com

Measurement of Insulin- and Contraction-Stimulated Glucose Uptake in Isolated and Incubated Mature Skeletal Muscle from Mice

Kas glukoz alımının bozulmamış bir şekilde düzenlenmesi, tüm vücut glikoz homeostazını korumak için önemlidir. Bu protokol, çeşitli fizyolojik müdahalelerin tüm vücut glikoz metabolizması üzerindeki etkisini tanımlarken, izole ve inkübe edilmiş olgun iskelet kasında insülin ve kontraksiyonla uyarılmış glikoz alımının değerlendirilmesini sunar.

Farelerden İzole ve İnkübe Olgun İskelet Kasında İnsülin ve Kasılma ile Uyarılmış Glikoz Alımının Ölçülmesi

Skeletal muscle is an insulin-responsive tissue and typically takes up most of the glucose that enters the blood after a meal. Moreover, it has been ...

Exvivo model, çeşitli fizyolojik müdahalelerin ve farmakolojik bileşiklerin ve kas glukoz alımının etkisini değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir. Bu teknik, sağlam bir hayvan modeline müdahale edebilecek kafa karıştırıcı faktörlerin yokluğunda, izole fare iskelet kasında glikoz alımının doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Bir deneye başlamadan önce, entegre kas şeridi biyografi sistemini açın ve odaları 30 santigrat dereceye ısıtın.Veri toplama yazılımını açın ve veri kümeleri arasında karşılaştırılabilirliği sağlamak için cebri dönüştürücüleri kalibre edin. Her bir inkübasyon odasına dört mililitre önceden ısıtılmış 30 santigrat derece bazal inkübasyon ortamı ekleyin ve ortamın sürekli olarak% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit ile oksijenlendiğinden emin olun. Fareyi bir diseksiyon tepsisinde yüzüstü konuma getirin ve pedal refleksine yanıt verilmediğini onaylayın.Sonra bir iğne ile tek bir ön pençeyi sabitleyin. Hem aşil tendonu hem de diz eklemi görünene kadar cildi alt bacaktan çıkarmak için makas kullanın. Soleus kasının diseksiyonu için, 16 santimetrelik emilemeyen cerrahi naylon bir dikiş parçasından hazırlanan 0.4 santimetre çapında tek bir dikiş ilmeğini aşil tendonuna bağlayın ve aşil tendonuna ditel olarak peen forsepsleri döngüye sabitleyin.Soleus ve gastroknemius kaslarını pençeden serbest bırakmak için kesin ve soleus kasını ortaya çıkarmak için peen forsepslerini fare boyunca dikkatlice kaydırın. Peen forsepslerini sabitleyin ve soleus kasının proksimal tendonunun etrafına ikinci bir dikiş halkası yerleştirin. Proksimal tendonu kesin ve gastroknemius kasından arındırılmış iki bağlı sütür halkası da dahil olmak üzere soleus'u diseke edin.Toplandıktan sonra, soleus kasını inkübasyon odalarından birindeki ilgili kancalara hızlı bir şekilde bağlamak için halkaları kullanın. Tibialis anterior kasını kaplayan fasyayı çıkarmak için forseps kullanın. Tibialis anterior veya EDL kaslarının distal tendonları açık beyaz, görünür ve birbirinden ayrı olmalıdır.Tibialis ön kasının damıtılmış tendonunu kesin ve kası diseke edin. EDL kasını çevreleyen dokulardan nazikçe serbest bırakmak için forseps kullanın ve tendonları kesmeden kası sağlam bırakın. Damıtma ve proksimal EDL tendonlarının etrafına bireysel sütür halkaları yerleştirin.Döngüler yerleştirildiğinde, EDL kasını dikiş halkaları takılı olarak serbest bırakmak için tendonları kesin ve halkaları ikinci inkübasyon odasındaki kancalara hızlı bir şekilde takın. Daha sonra her kasın dinlenme gerginliğini yaklaşık beş milinewtona ayarlayın ve deneye başlamadan önce kasların ortamda en az 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. İnsülin ile uyarılmış glikoz alımını ölçmek için, odalardaki bazal inkübasyon ortamını insülinsiz inkübasyon ortamı, submaksimal olarak etkili bir insülin konsantrasyonu veya 20 dakikalık bir inkübasyon için maksimum etkili bir insülin konsantrasyonu ile değiştirin.Stimülasyon süresinin sonunda, inkübasyon ortamını, 10 dakikalık bir inkübasyon için aynı insülin konsantrasyonunu içeren glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirin. Glikoz alım inkübasyonunun sonunda, kasları inkübasyon odalarından dikkatlice çıkarın ve numuneleri buz gibi soğuk bazal inkübasyon ortamında yıkayın. Yıkamadan sonra, kasları filtre kağıdında hızla kurutun ve sıvı azotta dikiş halkaları olmadan dokuyu dondurun.Daha sonra 20 santigrat derece depolama ve kas glikoz alım analizi için her odadan 100 mikrolitre glikoz alım inkübasyon ortamı toplayın. Kasılmayı uyaran glikoz alımını ölçmek için, platin elektrotları merkezi olarak ve inkübasyon odalarındaki kasların her iki tarafına yerleştirin ve bazal inkübasyon ortamını glikoz alım inkübasyon ortamı ile değiştirdikten hemen sonra kas kasılmasını başlatın. Her inkübe edilmiş kastan zorla üretimi kaydedin.10 dakika sonra, gösterildiği gibi kasları nazikçe toplayın ve dondurun, gösterildiği gibi kas glikoz alım analizi için her odadan glikoz alım inkübasyon ortamının 100 mikrolitre alikotunu saklayın. Aynı kas numunesi setinde batı lekelenme analizi ile miyosellüler sinyalleşmeyi belirlemek için, her dondurulmuş kas örneğini 400 mikrolitre buz gibi soğuk homojenizasyon tamponunda homojenize edin ve numuneyi dört santigrat derecede bir saat boyunca uçtan uca döndürün. Daha sonra santrifüjleme yoluyla lisansı toplayın ve standart batı leke analiz protokollerine göre her numune paletindeki ilgili protein miktarını ölçün.Her numunedeki glikoz alımını ölçmek için, şişe başına üç mililitre sıvı sintilasyon sıvısı içeren sıvı sintilasyon sayma şişelerini ayırmak için her numuneden 150 mikrolitre süpernatant ve ilgili inkübasyon odalarından 25 mikrolitre glikoz alım inkübasyon ortamı ekleyin. Daha sonra şişeleri bir sıvı sintilasyon sayacına yükleyin ve üreticinin yönergelerine göre iki deoksiglikoz ve mannitolün radyoaktivitesini ölçün. Bu temsili analizde, bazal glukoz alım oranları, dişi farelerden izole edilen soleus ve EDL kasları arasında benzerdi.Glukoz alımı, hem submaksimal hem de maksimal olarak etkili insülin konsantrasyonlarına yanıt olarak soleus ve EDL kaslarında artmıştır. Ayrıca, hem submaksimal hem de maksimal insülin uyarılmış glukoz alımları soleus kasında anlamlı derecede yüksekti. Buna karşılık, kasılmaya bağlı glikoz alımı, EDL'de soleus kasına kıyasla anlamlı derecede yüksekti.Burada 10 dakikalık stimülasyon periyodu boyunca soleus ve EDL kaslarında üretilen maksimum kas kuvveti gözlemlenebilir. Beklendiği gibi, EDL kası stimülasyon periyodunun ilk bölümünde daha fazla kuvvet üretti, ardından stimülasyon periyodunda daha sonra hızlı bir düşüş oldu. Submaksimal ve maksimal insülin konsantrasyonları Akt treonin 308 ve TBC1D4 Serin 588'in fosforilasyonunda bir artışa neden olurken, kasılma AMPK Alpha treonin 172 ve ACC serin 212'nin fosforilasyonunda bir artışa neden olmuştur.Ne insülin ne de kasılma, toplam protein içeriğinde bir değişikliğe yol açmadı. İzole fare kaslarında glikoz alımını ölçmeye çalışmadan önce, soleus ve EDL kaslarının diseksiyonunu iyice uygulamak hayati önem taşır. Kas glikoz alımının değerlendirilmesini takiben, kalan kas proteini lizat, glikoz alım oranlarında gözlenen değişiklikleri aydınlatabilecek ek biyokimyasal analizler için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Micro-circulation Measurement in Skeletal Muscle by Intra-vital Microscopy

İskelet kas-içi hayati Mikroskopi in vivo Mikro sirkülasyon Ölçümü

BACKGROUND: Regulatory factors and detailed physiology of in vivo microcirculation have remained not fully clarified after many different modalities of ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

İzole İskelet Kaslar Kasılma, çabuk yorulma ve Alternans Ex Vivo Değerlendirilmesi

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Kalsiyum değerlendirilmesi Bozulmamış İskelet kas liflerinin içinde Sparks

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

İnsan İskelet Kası Kan-damar-türevli Multipotent Öncüleri İzolasyonu

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...