Name: immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells
Uploaded: 2020-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells at JoVE.com

وتم الحصول على الشعاع النيوتروني المختلط المكون من إشعاع النيوترون/غاما من مفاعل ماريا للبحوث في المركز الوطني للبحوث النووية في بولندا. 11- وقد تلقى المركز الوطني للعلوم في بولندا (Miniatura 2) دعماً من المركز الوطني للعلوم( منحة رقم #2018/02/X/NZ5/02849.

1- إعداد ثقافة الخلية والإعداد التجريبي
<ol><li>الحفاظ على خلايا سرطان القولون البشري، HCT-116 كما أوصى المورد، في monolayers في 75 سم2 قارورة الثقافة التي تحتوي على 10 مل من مكوي مقو 5A المتوسطة المعدلة، وتستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنينية و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية المضادة للمضادات الحيوية.</li>...

<ol>
	<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+DNA+Damage+Induced+by+High+Linear+Energy+Transfer+Alpha-Particles+and+Protons+Triggers+a+Specific+Cellular+DNA+Damage+Response.">Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).</li><li>Kondo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+induced+by+boron+neutron+capture+therapy+is+partially+repaired+by+DNA+ligase+IV.">DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV.</a> Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).</li><li>Sakai, W., Sugasawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Recognition+and+Repair+in+Mammalian+Global+Genome+Nucleotide+Excision+Repair.">DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair.</a> DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).</li><li>Rodriguez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+DNA+damage+and+repair+mechanisms+induced+by+BNCT+in+a+poorly+differentiated+thyroid+carcinoma+cell+line.">In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line.</a> Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).</li><li>Sollazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Dynamics+of+53BP1+Foci+Following+Simultaneous+Induction+of+Clustered+and+Dispersed+DNA+Damage+in+U2OS+Cells.">Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).</li><li>Jeggo, P., L&#246;brich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+responses.">Radiation-induced DNA damage responses.</a> Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).</li><li>Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+DNA+pairing+by+human+recombination+factors+Rad51+and+Rad54.">Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).</li><li>Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Dynamics+of+Rad51+and+Rad54+in+Response+to+Postreplicative+Stress+and+DNA+Damage+in+HeLa+Cells.">Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells.</a> Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylates+histone+H2AX+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+phosphorylation+controls+Crb2+recruitment+at+DNA+breaks,+maintains+checkpoint+arrest,+and+influences+DNA+repair+in+fission+yeast.">Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Sage, E., Shikazono, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+clustered+DNA+lesions:+Repair+and+mutagenesis.">Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).</li><li>Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+immunoassays+in+DNA+damage+and+instability+detection.">Review: immunoassays in DNA damage and instability detection.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).</li><li>M&#248;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+bromate+as+positive+assay+control+for+the+Fpg-modified+comet+assay.">Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay.</a> Mutagenesis. , (2020).</li><li>Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronucleus+Assay:+The+State+of+Art,+and+Future+Directions.">Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).</li><li>Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+imaging+of+DNA+damage+response+proteins:+optimizing+protocols+for+super-resolution+microscopy.">Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy.</a> Methods. 48 (1), 63-71 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+dispersed+and+clustered+DNA+lesions+compromises+DNA+damage+response+in+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes.</a> PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Okumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+biological+effects+of+neutron+mixed-beam+irradiation+for+boron+neutron+capture+therapy+on+cell+survival+and+DNA+double-strand+breaks+in+cultured+mammalian+cells.">Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells.</a> Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).</li><li>Dagrosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evaluation+of+the+biologic+effectiveness+factors+of+boron+neutron+capture+therapy+(BNCT)+in+a+human+colon+carcinoma+cell+line.">First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).</li><li>Dagrosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+for+the+application+of+boron+neutron+capture+therapy+to+the+treatment+of+differentiated+thyroid+cancer.">Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer.</a> Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).</li><li>Reynolds, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Ku70/80+and+DNA-PKcs+at+DSBs+induced+by+ionizing+radiation+is+dependent+on+the+complexity+of+damage.">The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage.</a> Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).</li><li>Rasche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Lymphocytic+DNA+Damage+in+Early+Multiple+Sclerosis+by+Automated+Gamma-H2AX+and+53BP1+Foci+Detection:+A+Case+Control+Study.">Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study.</a> PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).</li><li>Ban&#225;th, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).</li><li>Barth, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+boron+neutron+capture+therapy+of+high+grade+gliomas+and+recurrent+head+and+neck+cancer.">Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer.</a> Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).</li><li>Mirzaei, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+neutron+capture+therapy:+Moving+toward+targeted+cancer+therapy.">Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy.</a> Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).</li><li>Vitti, E. T., Parsons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Radiobiological+Effects+of+Proton+Beam+Therapy:+Impact+on+DNA+Damage+and+Repair.">The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair.</a> Cancers. 11 (7), 946 (2019).</li><li>Mohamad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+Ion+Radiotherapy:+A+Review+of+Clinical+Experiences+and+Preclinical+Research,+with+an+Emphasis+on+DNA+Damage/Repair.">Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair.</a> Cancers. 9 (6), 66 (2017).</li></ol>

ترددات بؤر، الملطخة مناعيا ل γ-H2AX و 53BP1 تستخدم عادة في البيولوجيا الإشعاعية وترتبط مع عدد الحمض النووي DSB وتعتبر علامات فعالة وحساسة لرصد تحريض وإصلاح الحمض النووي DSBs19. إن إجراء التلطيخ المشترك للـ γ-H2AX و 53BP1 هو إجراء قياسي للكشف عن الحمض النووي DSBs. ويرتبط تشكيل γ-H2AX مع توظيف 53BP1?...

لم يتم تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT) بشكل كامل. يوفر هذا البروتوكول إجراءً تدريجيًا لتنفيذ الكشف عن البؤر المستحثة بالإشعاع (RIF) من البروتينات المُعدة عن طريق تلطيخ الفلورس المناعية، على سبيل المثال، في خط الخلايا السرطانية القولونية البشرية بعد التشعيع مع الشعاع المختلط النيوتروني.
الإشعاع المؤين (IR) يحفز العديد من أنواع مختلفة من الضرر الحمض النووي (الحمض النووي DSBs، الحمض النووي-SSBs، الحمض النووي الضرر قاعدة) من الذي فواصل الحمض النووي المزدوج حبلا هي الآفات الحمض النووي الأكثر سمية جينية1. يمكن أن تؤدي الفواصل غير المُعاد إصلاحها إلى موت الخلايا، بينما تثير الفواصل التي تم إصلاحها بشكل خاطئ احتمال إعادة ترتيب الكروموسومات، ونشوء الطفرات، وفقدان المعلومات الوراثية الحاسمة. وتشمل مسارات الاستجابة للأضرار استجابة DSBs مسارات إصلاح الحمض النووي مثل الانضمام نهاية غير متجانسة (NHEJ)، وهي الآلية التي تتطلب كو 70/80، الحمض النووي PKcs، Xrcc4، والحمض النووي الرابع كعوامل رئيسية2،,3،,4،,5،,6. في الثدييات، المسار الرئيسي الثاني لإصلاح الحمض النووي هو مسار إصلاح إعادة التركيب المتجانس (HRR) الذي يتطلب مكونات رئيسية - عائلة جينات الغطاس Rad52 - Rad51 و Rad52 و Rad54 و Rad55 و Rad57 و Rad587. Rad51 و Rad54 هي عوامل إعادة الكومبين البشري الرئيسية المشاركة في آليات الإصلاح المتعلقة الإجهاد النسخ المتماثل وفواصل الحمض النووي في eukaryotes. ومن المثير للاهتمام، لوحظ أن الهابط من مسار HR يعزز مسار NHEJ الذي هو عرضة للخطأ مشيرا إلى أهمية مسار الموارد البشرية للاستقرار الجينوم8.
الخطوة الأولى من تشكيل DSBs هو الفوسفور من حجر الستون γ-H2AX في سير-139 بواسطة أتاكسيا تيلانجيكتاسيا تحور كيناز (ATM) من الأسرة كيناز PI37,8. ومن المثير للاهتمام، يمكن تصور الفوسفور H2AX بسهولة عن طريق تقنية مناعية الفلوروسكين كما foci (γ-H2AX بؤري) باستخدام الأجسام المضادة محددة لH2AX6الفوسفورية . هناك علاقة 1:1 بين عدد DSBs و γ-H2AX بؤر، لذلك، DSB علامة، γ-H2AX، ودرس على نطاق واسع من خلال توصيف تشكيل بؤر، وحجم، وكمية6،,7،,8،,9،,10،,11. تشكيل γ-H2AX بؤر يؤدي إلى تجنيد وتراكم الحمض النووي استجابة الضرر (DDR) البروتينات والعوامل المعدلة الكروماتين، مثل 53BP1 (p53 بروتين ملزمة 1)، MDC1 (وسيط نقطة تفتيش الضرر الحمض النووي)، BRCA1، Mre11/Rad50/Nbs1، PARP-1، والعديد من العوامل الأخرى إصلاح تشكيل عوامل أخرى من ذلك foci الناجمة عن الإشعاع (RIF). كل هذه البروتينات تشارك في التوطين مع γ-H2AX من خلال الربط المباشر أو غير المباشر1,11,12.
من المهم الكشف عن تلف الحمض النووي وإصلاح مع اختبار حساس السليم، وبالتالي، يتم إيلاء المزيد من الاهتمام لتطوير تقنيات دقيقة للغاية13. وفي سياق دراسات تلف الحمض النووي وإصلاحه، تعتبر المنهجية حاسمة بالنسبة للكشف الحساس عن تلف الحمض النووي الجيني، ووصف فئة الضرر، وتحديد كمية الضرر بالحمض النووي وآليات الإصلاح13. للكشف عن خلايا واحدة مع الحمض النووي التالفة، ويستخدم عادة في اختبار المذنبات الدراسات البيولوجية الإشعاعية14. تتعرف الطرق الخلوية الأخرى المتاحة على الانحرافات الكروموسومية، بما في ذلك الزخرف، والتوابل، والشظايا المركزية، والخواتم، والانحرافات من النوع الكروماتي، وتلف الكروموسومات بالنواة الدقيقة (Mn). الطريقة الأكثر استخداما في البيولوجيا الإشعاعية، وخاصة في قياس الجرعات البيولوجية، هو المقايسة الكروموسوم الزناة نظرا لخصوصيته العالية للإشعاع15. على سبيل المثال، لا يمكن أن يتعرف PCR، وهو أسلوب جزيئي كلاسيكي، على نوع تلف الحمض النووي المكتشف. في هذه الحالة، طرق المناعة تمرير مستوى الحساسية لأن ردود الفعل محددة بين المستضد والأجسام المضادة. يوفر التصوير المناعي للفلوريسين دليلاً مرئياً لظهور بروتينات مختلفة في بؤر مميزة استجابة لعوامل ضارة بالحمض النووي مثل الإشعاع المؤين16. ومع ذلك ، فإن مستويات التنشيط من الضرر وإصلاح البروتينات 'مرنا مستويات يمكن اكتشافها بسهولة عن طريق PCR في الوقت الحقيقي الذي هو وسيلة كمية مناسبة لمزيد من الدراسات الجزيئية في سياق الاستجابة لتلف الحمض النووي17.
مع الأخذ في الاعتبار أن γ-H2AX بؤر جذب عوامل الإصلاح18، لرصد تلف الحمض النووي وإصلاح على المستوى الخلوي ، قمنا بتطوير إجراء تلطيخ المناعة موثوقة ، استنادا إلى تحليل بؤر البروتين إصلاح ممثل من مسار NHEJ (الحمض النووي - PKcs) و Rad52 من مسار HRR.
هنا، نقترح استخدام المناعي لهذه البروتينات باعتبارها الإجراء الفعال والحساس لرصد الحمض النووي-DSB التعريفي وإصلاح. حتى الآن، لم تكن هناك بيانات متوفرة عن الحمض النووي DSBs على أساس بؤر البروتينات إصلاح على المستوى الخلوي بعد النيوترونات شعاع مختلط تشعيع لBNCT، باستثناء γ-H2AX و 53BP1 علامات19. نقترح تكييف خط خلايا سرطان القولون HCT-116، كما هو غني في نفسه في بؤر DSBs، كخط خلية قياسي لتحليل تلف الحمض النووي، لأن RIFs يمكن اكتشافها بسهولة. هذا الخط الخلية المنضمة من السهل الحفاظ على ومناسبة لإجراءات التشعيع. ويستند الإجراء المقترح على كمية كبيرة من الدراسات السابقة المتعلقة بإجراء المناعة العامة من تلطيخ γ-H2AX. ومع ذلك، فإنه يتضمن جميع التفاصيل المتعلقة باختيار الأجسام المضادة المناسبة مع التخفيفات اختبار لكل بروتين ممثل تنتمي إلى كل مسار إصلاح. وعلاوة على ذلك، فإنه يصف استخدام شعاع فريد من نوعه النيوترون مختلطة المستخدمة في العلاج BNCT. ومع ذلك، نوصي بتوسيع الدراسات مع كلا الأسلوبين، مناعية تلطيخ أولا ثم، مع تحليل الجزيئية عالية التكلفة كما أجريت سابقا4،17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7.183.390.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Borono-L-phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>17755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule)&#8211;FITC antibody produced in goat</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F0257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD52 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB117097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>BSAV-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT-116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>http://www.mediacy.com/imagepro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA II Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>B-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS</td>
			<td>20.59.52.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>T13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution 0.25%</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells

الغرض من المخطوطة هو توفير بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء المجهر المناعي لدراسة استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع الناجم عن شعاع النيوترون غاما المختلط المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). على وجه التحديد، يتم تطبيق المنهجية المقترحة للكشف عن تنشيط البروتينات إصلاح التي يمكن تصورها البؤر باستخدام الأجسام المضادة محددة لفواصل الحمض النووي مزدوجة حبلا (DNA-DSBs). تم تقييم بؤر إصلاح الحمض النووي عن طريق الفلوروسين المناعي في خلايا سرطان القولون (HCT-116) بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط. الحمض النووي DSBs هي الآفات الأكثر سمية جينية ويتم إصلاحها في خلايا الثدييات من خلال مسارين رئيسيين: مسار غير متماثل للانضمام النهائي (NHEJ) وإصلاح إعادة التركيب المتماثل (HRR). الترددات من بؤر, ملطّخة مناعيا, لعلامات شائعة الاستخدام في علم الأحياء الإشعاعية مثل γ-H2AX, 53BP1 ترتبط مع الحمض النووي DSB عدد وتعتبر علامات فعالة وحساسة لرصد تحريض وإصلاح الحمض النووي DSBs. وقد ثبت أن γ-H2AX تجمع البروتينات الإصلاح, مما يؤدي إلى تركيز أعلى من عوامل الإصلاح بالقرب من DSB. لرصد تلف الحمض النووي على المستوى الخلوي، تم التخطيط لتحليل الفلور المناعية لوجود الحمض النووي-PKcs ممثل إصلاح بؤر البروتين من مسار NHEJ و Rad52 من مسار HRR. لقد قمنا بتطوير وإدخال بروتوكول تلطيخ مناعة موثوق به للكشف عن استجابة تلف الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع مع أجسام مضادة خاصة بعوامل الإصلاح من مسارات NHEJ و HRR وocioci التي يسببها الإشعاع (RIF). ويمكن استخدام المنهجية المقترحة في فحص بروتين الإصلاح الذي يتم تنشيطه بدرجة كبيرة في حالة إشعاع الشعاع المختلط النيوترون، مما يشير إلى هيمنة مسار الإصلاح.

أولا، قمنا بتحليل علامة قياسية للكشف عن الحمض النووي DSBs، γH2AX بؤر في خلايا سرطان القولون، غير مشع، وتشع مع شعاع النيوترون مختلطة. تظهر البؤرة الفلورية المتميزة في شكل γ-H2AX وتظهر تكوين الحمض النووي DSBs (حيث أن كل نقطة فلورية من نوع γ-H2AX تمثل DSB مفردة) (انظر الشكل 1).
<p class="jove_conten...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells at JoVE.com

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

لم يتم بشكل كامل تحديد استجابة تلف الحمض النووي الناجم عن الإشعاع التي يتم تنشيطها بواسطة النيوترونات المختلطة الشعاع المستخدم في علاج التقاط النيوترون البورون (BNCT). يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن البؤر الناجمة عن الإشعاع (RIF) من البروتينات الإصلاح عن طريق تلطيخ المناعة في خطوط خلايا سرطان القولون البشرية بعد التشعيع مع شعاع النيوترون المختلط.

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

يوفر هذا البروتوكول إجراءً خطوة بخطوة للكشف عن بؤر إصلاح البروتينات الناجمة عن الإشعاع عن طريق تلطيخ الفلوروس في خطوط خلايا سرطان القولون البشري بعد التشعيع مع الحزمة المختلطة بالنيوترون. التصوير المناعي هو طريقة حساسة ويوفر أدلة بصرية لظهور البروتينات مسار إصلاح في بؤر استجابة للحمض النووي الضارة العوامل، مثل الإشعاع المؤين. ويستخدم شعاع النيوترون المختلط في العلاج بالتقاط النيوترون البورون، BNCT، ولم يتم تحديد استجابة الضرر الناتجة عن الإشعاعات من الحمض النووي.ويمكن أن يكون بروتوكولنا مفيدًا أيضًا لتحليل الآثار البيولوجية على المستوى الخلوي بسبب الإشعاع بواسطة الحزم الأخرى عالية LET ، مثل البروتونات التي تستخدم العلاج بشعاع البروتون أو أيونات الكربون باستخدام علاج الهادرون. بعد التشعيع، وإزالة المتوسطة من الخلايا المرفقة، وغسلها مرة واحدة مع 2.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم إصلاح الخلايا مع ملليلتر واحد من 70٪ الإيثانول لمدة 10 دقائق.ل Permeabilize الخلايا، وإزالة الإيثانول، وغسلها مع 2.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني. أضف برفق ملليلتر واحد من 2٪ Triton X-100 في PBS لتغطية الأغطية، واحتضان الخلايا لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني، ومنع permeabilization مع ملليلتر واحد من 2٪ BSA المخفف في برنامج تلفزيوني.ثم احتضان الخلايا لمدة لا تقل عن 30 دقيقة مع 2٪ BSA. لتلطيخ الخلايا، أضف الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الأولية المخففة في PBS مع BSA، كما هو موصى به في مخطوطة النص. ثم تغطية طبق بيتري، ووضعها في مربع من البلاستيك مع اللجنين المرطب للحفاظ على الرطوبة.احتضانه لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية. بعد الحضانة، قم بإجراء ثلاثة غسلات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة الكمية المناسبة من الأجسام المضادة الثانوية. العودة الطبق إلى مربع من البلاستيك مع lignin مرطب، واحتضانه لمدة 30 دقيقة على الأقل في 37 درجة مئوية.ثم كرر يغسل مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 100 ميكرولتر من DAPI المخفف إلى تركيز نهائي من ميكروغرام واحد لكل ملليلتر لضد النوى. احتضان الخلايا لمدة أقصاها دقيقتين في درجة حرارة الغرفة، وتكرار يغسل مع برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير، وإزالة برنامج تلفزيوني، ووضع بلطف غطاء على رأس المتوسطة المتصاعدة، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.ختم حواف الغطاء مع طلاء الأظافر، والسماح المتوسطة تصاعد لتصلب قبل إجراء المجهر الفلوريس. تم الكشف عن بؤر غاما H2AX ، وهي علامات قياسية لفواصل الحمض النووي المزدوجة التي تقطعت بها السبل ، في خلايا سرطان القولون المختلطة بالنيوترونات ، المشعة ، وغير المشععة. تظهر البؤر كنقاط فلورية متميزة.ولوحظ أن قطرها أعلى من بؤر غاما-H2AX في الخلايا المشعة. وعلاوة على ذلك، تم الكشف عن مسار واحد لجسيمات ألفا عالية LET عبور النواة. تم استخدام المجهر المناعي للكشف عن البروتينات إصلاح تمثيلي Rad52 والبروتين كيناز التي تعتمد على الحمض النووي.تم قياس قيمة متوسطة عالية من قطر البروتين كيناز البؤر المعتمد على الحمض النووي عند فواصل الحمض النووي بعد التشعيع بالمقارنة مع خلايا التحكم. ولوحظت فواصل مزدوجة التشابك من الحمض النووي في الخلايا المشعة باعتبارها بؤراً أكثر تعقيداً وأكبر وتكتلاً بكثافة أعلى. أهم مرحلة من تلطّخ الفلورة المناعية هي تثبيت الخلايا و حيّانة غشاء الخلية.هذه الخطوات مطلوبة للسماح للأجسام المضادة باختراق كل من تلك الخلايا و البروتينات داخل الخلايا. هذا الإجراء يعطي معلومات حول تنشيط كل مسار إصلاح على مستوى خلوي. وينبغي بعد ذلك تأكيد النتائج على المستوى الجزيئي باستخدام مقايسة، مثل PCR في الوقت الحقيقي.هذه التقنية تجعل من الممكن للباحثين لاستكشاف الاستجابة الناجمة عن أضرار الحمض النووي الناجمة عن الإشعاع ، والتي لم يتم تحديدها بالكامل في حالة الحزم المختلفة باستخدام العلاجات المضادة للسرطان.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Cancer Research

Unit 1

DNA Replication and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

تقييم أضرار الحمض النووي في المختبر باستخدام مقايسة المذنب

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

مجهر الفلورة γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح الحمض النووي المزدوج-حبلا فواصل

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

تحديد خصائص الخلايا السرطانية باستخدام سلك طبي لالتقاط تعميم الخلايا السرطانية: نهجاً ثلاثي الأبعاد استناداً إلى الفلورة والأسماك الحمض النووي

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

وصف عمليات إصلاح الحمض النووي في فواصل الحمض النووي عابرة وطويلة الأمد مزدوجة-حبلا مجهر الفلورة

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

في فيفو الفلورة المناعية توطين لتقييم التوزيع الحيوي للجسم المضاد العلاجي والتشخيصي في أبحاث السرطان

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

في المختبر تقييم التحول Oncogenic في الخلايا الظهارية ماماري الإنسان

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

طريقة تسجيل مجهرية آلية لإجراء فحص foci γ-H2AX في الخلايا الليمفاوية الطرفية للدم البشري

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...