Name: immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells
Uploaded: 2020-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells at JoVE.com

Neutronblandet stråle bestående af neutron-/gammastråling blev åbnet fra Maria-forskningsreaktoren i Det Nationale Center for Nuklear Forskning i Polen. K.M.O. blev støttet af National Science Centre, Polen (Miniatura 2) #2018 tilskud nr.

1. Udarbejdelse af cellekultur og eksperimentel set-up
<ol><li>Opretholde humane tyktarmskræft celler, HCT-116 som anbefalet af leverandøren, i monolag i 75 cm2 kultur kolber, der indeholder 10 ml af formuleret McCoy's 5a Medium Modificeret, suppleret med 10% føtal kvæg serum og 1% antibiotika antimykotisk opløsning.</li>
	<li>Dyrk cellerne i et befugtet 5% CO2-miljø ved 37 °C indtil 70% af sammenløbet med medium fornyelse hver 2 til 3 dage.</li>
	<li>For at få BNCT stråle (f.eks neutron...

<ol>
	<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+DNA+Damage+Induced+by+High+Linear+Energy+Transfer+Alpha-Particles+and+Protons+Triggers+a+Specific+Cellular+DNA+Damage+Response.">Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).</li><li>Kondo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+induced+by+boron+neutron+capture+therapy+is+partially+repaired+by+DNA+ligase+IV.">DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV.</a> Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).</li><li>Sakai, W., Sugasawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Recognition+and+Repair+in+Mammalian+Global+Genome+Nucleotide+Excision+Repair.">DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair.</a> DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).</li><li>Rodriguez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+DNA+damage+and+repair+mechanisms+induced+by+BNCT+in+a+poorly+differentiated+thyroid+carcinoma+cell+line.">In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line.</a> Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).</li><li>Sollazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Dynamics+of+53BP1+Foci+Following+Simultaneous+Induction+of+Clustered+and+Dispersed+DNA+Damage+in+U2OS+Cells.">Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).</li><li>Jeggo, P., L&#246;brich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+responses.">Radiation-induced DNA damage responses.</a> Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).</li><li>Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+DNA+pairing+by+human+recombination+factors+Rad51+and+Rad54.">Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).</li><li>Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Dynamics+of+Rad51+and+Rad54+in+Response+to+Postreplicative+Stress+and+DNA+Damage+in+HeLa+Cells.">Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells.</a> Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylates+histone+H2AX+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+phosphorylation+controls+Crb2+recruitment+at+DNA+breaks,+maintains+checkpoint+arrest,+and+influences+DNA+repair+in+fission+yeast.">Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Sage, E., Shikazono, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+clustered+DNA+lesions:+Repair+and+mutagenesis.">Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).</li><li>Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+immunoassays+in+DNA+damage+and+instability+detection.">Review: immunoassays in DNA damage and instability detection.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).</li><li>M&#248;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+bromate+as+positive+assay+control+for+the+Fpg-modified+comet+assay.">Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay.</a> Mutagenesis. , (2020).</li><li>Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronucleus+Assay:+The+State+of+Art,+and+Future+Directions.">Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).</li><li>Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+imaging+of+DNA+damage+response+proteins:+optimizing+protocols+for+super-resolution+microscopy.">Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy.</a> Methods. 48 (1), 63-71 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+dispersed+and+clustered+DNA+lesions+compromises+DNA+damage+response+in+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes.</a> PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Okumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+biological+effects+of+neutron+mixed-beam+irradiation+for+boron+neutron+capture+therapy+on+cell+survival+and+DNA+double-strand+breaks+in+cultured+mammalian+cells.">Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells.</a> Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).</li><li>Dagrosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evaluation+of+the+biologic+effectiveness+factors+of+boron+neutron+capture+therapy+(BNCT)+in+a+human+colon+carcinoma+cell+line.">First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).</li><li>Dagrosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+for+the+application+of+boron+neutron+capture+therapy+to+the+treatment+of+differentiated+thyroid+cancer.">Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer.</a> Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).</li><li>Reynolds, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Ku70/80+and+DNA-PKcs+at+DSBs+induced+by+ionizing+radiation+is+dependent+on+the+complexity+of+damage.">The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage.</a> Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).</li><li>Rasche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Lymphocytic+DNA+Damage+in+Early+Multiple+Sclerosis+by+Automated+Gamma-H2AX+and+53BP1+Foci+Detection:+A+Case+Control+Study.">Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study.</a> PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).</li><li>Ban&#225;th, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).</li><li>Barth, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+boron+neutron+capture+therapy+of+high+grade+gliomas+and+recurrent+head+and+neck+cancer.">Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer.</a> Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).</li><li>Mirzaei, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+neutron+capture+therapy:+Moving+toward+targeted+cancer+therapy.">Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy.</a> Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).</li><li>Vitti, E. T., Parsons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Radiobiological+Effects+of+Proton+Beam+Therapy:+Impact+on+DNA+Damage+and+Repair.">The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair.</a> Cancers. 11 (7), 946 (2019).</li><li>Mohamad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+Ion+Radiotherapy:+A+Review+of+Clinical+Experiences+and+Preclinical+Research,+with+an+Emphasis+on+DNA+Damage/Repair.">Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair.</a> Cancers. 9 (6), 66 (2017).</li></ol>

Frekvenserne af foci, immunokemisk plettet for γ-H2AX og 53BP1 er almindeligt anvendt i radiobiologi og er forbundet med DNA-DSB-nummer og betragtes som effektive og følsomme markører til overvågning af induktion og reparation af DNA-DSBs19. Co-farvningsproceduren for γ-H2AX og 53BP1 er en standardprocedure til påvisning af DNA-DSBs. Dannelse af γ-H2AX foci er forbundet med rekruttering af 53BP1, en regulator afDNA-skadesrespons 23. Forskellige cellelinjer kan dog va...

Strålingsinduceret DNA-skadesrespons, der aktiveres af neutronblandet stråle, og som anvendes til behandling med neutronfangsning (BNCT), er ikke helt bestemt. Denne protokol giver en trinvis procedure til at udføre påvisning af stråling-induceret foci (RIF) af reparation proteiner ved immunofluorescence farvning f.eks i human tyktarmskræft cellelinje efter bestråling med neutron-blandet stråle.
Iiserende stråling (IR) inducerer en lang række forskellige typer af DNA-skader (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA base skader), hvoraf DNA dobbelt-streng pauser er de mest genotoksiske DNA læsioner1. Ureparerede pauser kan forårsage celledød, mens fejlreparerede pauser øger sandsynligheden for kromosomrearrangement, mutagenese og tab af afgørende genetisk information. De skadesreaktionsveje, der reagerer på DSBs, omfatter veje til DNA-reparation som ikke-homolog ende joining (NHEJ), enmekanisme, derkræver Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 og DNA-ligase IV som nøglefaktorer2,,3,4,5,6. Hos pattedyr, den anden vigtigste DNA reparation vej er homolog rekombination reparation (HRR) vej, som kræver centrale komponenter - Den Rad52 epistasis genfamilie- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 og Rad587. Rad51 og Rad54 er vigtige menneskelige rekombinationsfaktorer, der er involveret i reparationsmekanismer i forbindelse med replikationsstress og DNA-brud i eukaryoter. Interessant, det blev observeret, at nedregulering af HRR vej forbedrer NHEJ vej, som er fejl-tilbøjelige peger på HR vej relevans for genomet stabilitet8.
Det første trin i DSBs-dannelsen er fosforylering af γ-H2AX histonen ved Ser-139 af Ataxia telangiectasia muteret kinase (ATM) fra PI3 kinase-familien7,8. Interessant, H2AX fosforylering kan visualiseres let ved immunfluorescens teknik som foci (γ-H2AX foci) ved hjælp af antistoffer specifikke for fosforyleret H2AX6. Der er en 1:1 sammenhæng mellem antallet af DSBs og γ-H2AX foci, derfor, DSB markør, γ-H2AX, undersøges grundigt gennem karakterisering af foci dannelse, størrelse og mængde6,7,8,9,10,11. Dannelse af γ-H2AX foci fører til rekruttering og akkumulering af DNA-skadesrespons (DDR) proteiner og kromatinmodificerende faktorer, såsom 53BP1 (p53 bindende protein 1), MDC1 (mediator af DNA-skade checkpoint), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, og mange andre reparation faktorer dermed danner stråling-induceret foci (RIF). Alle disse proteiner er lokaliseres sammen med γ-H2AX ved direkte eller indirekte binding1,11,12.
Det er vigtigt at opdage DNA-skader og reparere med en ordentlig følsom test, derfor er mere opmærksom på udviklingen af meget præcise teknikker13. I forbindelse med DNA-skades- og reparationsundersøgelser er metoden afgørende for følsom påvisning af dna-skader på genomet, beskrivelse af skadeskategori og kvantificering af DNA-skades- og reparationsmekanismer13. For at detektere enkelte celler med beskadiget DNA anvendes kometanalyse ofte i radiobiologiske undersøgelser14. Andre tilgængelige cytogenetiske metoder genkender kromosomale afvigelser, herunder dicentriske, omplantninger, acentriske fragmenter, ringe og kromatidtypeafvigelser og mikronukleuskromosomaleskader (Mn). Den hyppigst anvendte metode i radiobiologi, især i biologisk dosimetri, er den dicentriske kromosomanalyse på grund af dens høje specificitet forstråling 15. For eksempel, PCR, en klassisk molekylær metode, kan ikke genkende typen af opdaget DNA-skader. I dette tilfælde passerer de immunometriske metoder følsomhedsniveauet, fordi reaktionerne er specifikke mellem antigenet og antistoffet. Immunofluorescensbilleddannelse giver visuel dokumentation for udseendet af forskellige proteiner i forskellige foci som reaktion på DNA-skadelige stoffer som iiseringsstråling16. Aktiveringsniveauerne for skader og reparation af proteiners mRNA-niveauer kan dog let påvises ved pcr i realtid, som er en korrekt kvantitativ metode til yderligere molekylære undersøgelser i forbindelse medDNA-skadesrespons 17.
I betragtning af at γ-H2AX foci tiltrækkerreparationsfaktorer 18for at overvåge DNA-skader og reparation på celleniveau, har vi udviklet en pålidelig immunfluorescensfarvningsprocedure baseret på analyse af det repræsentative reparationsprotein foci fra NHEJ-vejen (DNA-pc'er) og Rad52 fra HRR-vejen.
Her foreslår vi brug af immundetektion for disse proteiner som den effektive og følsomme procedure til overvågning af DNA-DSB induktion og reparation. Indtil nu har der ikke været tilgængelige data på DNA-DSBs baseret på foci af reparationsproteiner på celleniveau efter neutronen blandet strålebestråling for BNCT, undtagen γ-H2AX og 53BP1 markører19. Vi foreslår tilpasning af HCT-116 tyktarmskræft cellelinje, da det er rigt sig i DSBs foci, som en standard cellelinje for DNA-skade analyse, fordi RIFs er let påviselige. Denne klæbende cellelinje er nem at vedligeholde og korrekt for bestrålingsprocedurer. Den foreslåede procedure er baseret på en enorm mængde af tidligere undersøgelser i forbindelse med den generelle immunfluorescens procedure af γ-H2AX farvning. Den indeholder dog alle detaljer vedrørende valget af passende antistoffer med testede fortyndinger for hvert repræsentativt protein, der tilhører hver reparationsvej. Desuden beskriver det udnyttelsen af en unik neutron-blandet stråle, der anvendes i BNCT terapi. Vi anbefaler dog, at undersøgelserne udvides med begge metoder, immunfluorescensfarvning først og derefter, med dyre molekylære analyser som udført tidligere4,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7.183.390.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Borono-L-phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>17755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule)&#8211;FITC antibody produced in goat</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F0257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD52 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB117097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>BSAV-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT-116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>http://www.mediacy.com/imagepro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA II Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>B-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS</td>
			<td>20.59.52.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>T13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution 0.25%</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells

Formålet med manuskriptet er at give en trin-for-trin protokol til udførelse af immunfluorescens mikroskopi til undersøgelse af stråling-induceret DNA skade svar induceret af neutron-gamma blandet stråle, der anvendes i bor neutron capture terapi (BNCT). Specifikt anvendes den foreslåede metode til påvisning af aktivering af reparationsproteiner, som kan visualiseres som foci ved hjælp af antistoffer, der er specifikke for DNA-dobbeltstrengede brud (DNA-DSBs). DNA reparation foci blev vurderet ved immunofluorescens i tyktarmskræft celler (HCT-116) efter bestråling med neutron-blandet stråle. DNA-DSBs er de mest genotoksiske læsioner og repareres i pattedyrceller af to store veje: ikke-homolog end-joining pathway (NHEJ) og homolog rekombinationsreparation (HRR). Frekvenserne af foci, immunokemisk farves, for almindeligt anvendte markører i radiobiologi som γ-H2AX, 53BP1 er forbundet med DNA-DSB-nummer og betragtes som effektive og følsomme markører til overvågning af induktion og reparation af DNA-DSBs. Det blev fastslået, at γ-H2AX foci tiltrækker reparationsproteiner, hvilket fører til en højere koncentration af reparationsfaktorer i nærheden af et DSB. For at overvåge DNA-skader på celleniveau, immunofluorescens analyse for tilstedeværelsen af DNA-PKcs repræsentative reparation protein foci fra NHEJ vej og Rad52 fra HRR vej var planlagt. Vi har udviklet og indført en pålidelig immunfluorescens farvning protokol til påvisning af stråling-induceret DNA-skade respons med antistoffer specifikke for reparation faktorer fra NHEJ og HRR veje og observeret stråling-induceret foci (RIF). Den foreslåede metode kan anvendes til undersøgelse af reparationsprotein, der er stærkt aktiveret i tilfælde af neutronblandet strålestråling, hvilket indikerer reparationsvejens dominans.

For det første udførte vi en analyse af en standardmarkør for påvisning af DNA-DSBs, γH2AX foci i tyktarmskræftceller, ikke-udstrålede og bestrålet med neutronblandet stråle. γ-H2AX foci fremstår som særskilte fluorescerende prikker og viser dannelsen af DNA-DSBs (da hver γ-H2AX fluorescerende prik repræsenterer en enkelt DSB) (se figur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61399/61399fig01.jp...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells at JoVE.com

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Strålingsinduceret DNA-skadesrespons, der aktiveres af neutronblandet stråle, og som anvendes til behandling med neutronfangsning (BNCT), er ikke fuldt ud klarlagt. Denne protokol giver en trin-for-trin procedure til påvisning af stråling-induceret foci (RIF) af reparation proteiner ved immunfluorescens farvning i human tyktarmskræft cellelinjer efter bestråling med neutron-blandet stråle.

Immunofluorescens Imaging af DNA-skader og reparation Foci i Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Denne protokol giver en trinvis procedure til påvisning af stråling-induceret foci af reparation proteiner ved immunfluorescens farvning i human tyktarmskræft cellelinjer efter bestråling med neutron-blandet stråle. Immunofluorescens imaging er en følsom metode og giver visuelle beviser for udseendet af reparation vej proteiner i foci som reaktion på DNA skadelige-agenter, ligesom iioniserende stråling. Neutronb blandet stråle anvendes i bor neutronopsamlingsterapi, BNCT, og det strålingsinducerede DNA-skadesrespons er ikke fuldt ud fastslået.Vores protokol kan også være nyttig til analyse af biologiske virkninger på celleniveau på grund af stråling fra andre high-LET bjælker, ligesom protoner ved hjælp af protonstråle terapi eller kulstofioner ved hjælp af hadron terapi. Efter bestråling fjernes mediet fra de tilknyttede celler, og det vaskes én gang med 2,5 milliliter PBS. Derefter fastgør cellerne med en milliliter på 70% ethanol i 10 minutter.For at gennemtrænge cellerne, fjerne ethanol, og vaske dem med 2,5 milliliter PBS. Tilsæt forsigtigt en milliliter 2%Triton X-100 i PBS for at dække dækslerne, og inkuber cellerne i fem minutter ved stuetemperatur. Cellerne vaskes tre gange med PBS, og permeabiliseringen blokeres med en milliliter 2%BSA fortyndet i PBS.Derefter inkuberes cellerne i mindst 30 minutter med 2%BSA. For at plette cellerne tilsættes den korrekte mængde primære antistoffortyndes i PBS med BSA, som anbefalet i tekstmanuskriptet. Derefter dække petriskålen, og læg den i en plastikkasse med fugtet lignin for at opretholde luftfugtigheden.Inkuber den i 30 minutter ved 37 grader Celsius. Efter inkubationen udføres tre vaske med PBS, og den korrekte mængde sekundært antistof tilsættes. Returner skålen til plastkassen med fugtet lignin, og inkuber det i mindst 30 minutter ved 37 grader Celsius.Gentag derefter vaskerne med PBS, og tilsæt 100 mikroliter DAPI fortyndet til en endelig koncentration af et mikrogram pr. milliliter for at modvirke kernerne. Cellerne inkuberes i højst to minutter ved stuetemperatur, og vaskes igen med PBS. Efter den sidste vask fjernes PBS, og der forsigtigt sættes en dækslæd på monteringsmediet, så man undgår dannelse af luftbobler.Seal kanterne af dækslet med neglelak, og lad monteringsmediet hærde, før fluorescensmikroskopien udføres. Gamma-H2AX foci, som er standardmarkører for DNA-dobbeltstrengede brud, blev påvist i neutronblandet, strålebestrålet og ikke-bestrålet tyktarmskræftceller. Foci vises som forskellige fluorescerende prikker.Der blev observeret en højere diameter af gamma-H2AX foci i de bestrålede celler. Desuden blev der fundet et enkelt spor af en alfapartikel med høj LET-skæringssten, der krydsede kernerne. Immunfluorescensmikroskopi blev brugt til at detektere repræsentative reparationsproteiner Rad52 og DNA-afhængig proteinkinase.En høj gennemsnitsværdi af DNA-afhængig proteinkinase foci diameter blev målt ved DNA-brud efter bestråling i forhold til kontrolceller. Grupperet DNA dobbeltstrengede pauser blev observeret i bestrålede celler som mere komplekse, større og grupperet foci med højere intensitet. Den vigtigste fase af immunfluorescens farvning er fiksering af celler og permeabilisering af cellemembranen.Disse trin er nødvendige for at tillade antistoffer til nemt at trænge ind i både disse celler og intracellulære reparation proteiner. Denne procedure giver oplysninger om aktivering af hver reparationsvej på celleniveau. Resultaterne bør derefter bekræftes på molekylært niveau ved hjælp af en analyse, såsom real-time PCR.Denne teknik gør det muligt for forskere at udforske stråling-induceret DNA-skader svar, som ikke er fuldt ud bestemt i tilfælde af forskellige bjælker ved hjælp af anticancer behandlinger.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Cancer Research

Unit 1

DNA Replication and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluering af In Vitro DNA skader med Comet Assay

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunfluorescens mikroskopi af γH2AX og 53BP1 til at analysere den dannelse og reparation af DNA dobbelt-strenget pauser

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Karakterisering af tumorceller ved hjælp af en medicinsk Wire for optager cirkulerende tumorceller: en 3D tilgang baseret på immunofluorescens og DNA fisk

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

En metode til at definere virkningerne af miljøberigelse på tyktarmen Microbiome biodiversitet i en mus tyktarmen tumoren Model

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolering af menneskelige endotelceller fra normale kolon og Colorectal karcinom - en forbedret protokol

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

Kendetegner DNA reparationsprocesser på forbigående og langvarig dobbelt-strenget DNA pauser ved immunfluorescens mikroskopi

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

In vivo immunofluorescens lokalisering til vurdering af terapeutisk og diagnostisk antistof Biodistribution i kræftforskning

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

En automatiseret mikroskopisk scoringsmetode til γ-H2AX Foci-analysen i humane perifere blodlymfocytter

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering af hjernemetastase ved intern halspulsåreinjektion af kræftceller

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...