Name: immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells
Uploaded: 2020-06-09T15:00:00
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Il fascio misto di neutroni composto da radiazioni neutroni/gamma è stato consultato dal reattore di ricerca Maria del Centro nazionale per la ricerca nucleare in Polonia. K.M.O. è stato sostenuto dal National Science Centre, Polonia (Miniatura 2) sovvenzione n. #2018/02/X/N'5/02849.

1. Preparazione della coltura cellulare e configurazione sperimentale
<ol><li>Mantenere le cellule tumorali del colon umano, HCT-116 come raccomandato dal fornitore, in monostrati in 75 cm2 flaconi di coltura contenenti 10 mL di 5a Medium Modified di McCoy, integrati con 10% siero bovino fetale e 1% soluzione antimicotica antibiotica.</li>
	<li>Coltiva le cellule in un ambiente umidizzato del 5% di CO2 fino al 70% della confluenza con un rinnovo medio ogni 2 o 3 giorni.</li>
	<li>Per ottenere il f...

<ol>
	<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+DNA+Damage+Induced+by+High+Linear+Energy+Transfer+Alpha-Particles+and+Protons+Triggers+a+Specific+Cellular+DNA+Damage+Response.">Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).</li><li>Kondo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+induced+by+boron+neutron+capture+therapy+is+partially+repaired+by+DNA+ligase+IV.">DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV.</a> Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).</li><li>Sakai, W., Sugasawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Recognition+and+Repair+in+Mammalian+Global+Genome+Nucleotide+Excision+Repair.">DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair.</a> DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).</li><li>Rodriguez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+DNA+damage+and+repair+mechanisms+induced+by+BNCT+in+a+poorly+differentiated+thyroid+carcinoma+cell+line.">In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line.</a> Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).</li><li>Sollazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Dynamics+of+53BP1+Foci+Following+Simultaneous+Induction+of+Clustered+and+Dispersed+DNA+Damage+in+U2OS+Cells.">Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).</li><li>Jeggo, P., L&#246;brich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+responses.">Radiation-induced DNA damage responses.</a> Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).</li><li>Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+DNA+pairing+by+human+recombination+factors+Rad51+and+Rad54.">Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).</li><li>Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Dynamics+of+Rad51+and+Rad54+in+Response+to+Postreplicative+Stress+and+DNA+Damage+in+HeLa+Cells.">Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells.</a> Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylates+histone+H2AX+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+phosphorylation+controls+Crb2+recruitment+at+DNA+breaks,+maintains+checkpoint+arrest,+and+influences+DNA+repair+in+fission+yeast.">Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Sage, E., Shikazono, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+clustered+DNA+lesions:+Repair+and+mutagenesis.">Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).</li><li>Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+immunoassays+in+DNA+damage+and+instability+detection.">Review: immunoassays in DNA damage and instability detection.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).</li><li>M&#248;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+bromate+as+positive+assay+control+for+the+Fpg-modified+comet+assay.">Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay.</a> Mutagenesis. , (2020).</li><li>Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronucleus+Assay:+The+State+of+Art,+and+Future+Directions.">Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).</li><li>Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+imaging+of+DNA+damage+response+proteins:+optimizing+protocols+for+super-resolution+microscopy.">Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy.</a> Methods. 48 (1), 63-71 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+dispersed+and+clustered+DNA+lesions+compromises+DNA+damage+response+in+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes.</a> PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Okumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+biological+effects+of+neutron+mixed-beam+irradiation+for+boron+neutron+capture+therapy+on+cell+survival+and+DNA+double-strand+breaks+in+cultured+mammalian+cells.">Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells.</a> Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).</li><li>Dagrosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evaluation+of+the+biologic+effectiveness+factors+of+boron+neutron+capture+therapy+(BNCT)+in+a+human+colon+carcinoma+cell+line.">First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).</li><li>Dagrosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+for+the+application+of+boron+neutron+capture+therapy+to+the+treatment+of+differentiated+thyroid+cancer.">Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer.</a> Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).</li><li>Reynolds, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Ku70/80+and+DNA-PKcs+at+DSBs+induced+by+ionizing+radiation+is+dependent+on+the+complexity+of+damage.">The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage.</a> Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).</li><li>Rasche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Lymphocytic+DNA+Damage+in+Early+Multiple+Sclerosis+by+Automated+Gamma-H2AX+and+53BP1+Foci+Detection:+A+Case+Control+Study.">Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study.</a> PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).</li><li>Ban&#225;th, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).</li><li>Barth, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+boron+neutron+capture+therapy+of+high+grade+gliomas+and+recurrent+head+and+neck+cancer.">Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer.</a> Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).</li><li>Mirzaei, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+neutron+capture+therapy:+Moving+toward+targeted+cancer+therapy.">Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy.</a> Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).</li><li>Vitti, E. T., Parsons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Radiobiological+Effects+of+Proton+Beam+Therapy:+Impact+on+DNA+Damage+and+Repair.">The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair.</a> Cancers. 11 (7), 946 (2019).</li><li>Mohamad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+Ion+Radiotherapy:+A+Review+of+Clinical+Experiences+and+Preclinical+Research,+with+an+Emphasis+on+DNA+Damage/Repair.">Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair.</a> Cancers. 9 (6), 66 (2017).</li></ol>

Le frequenze dei foci, immunochimicamente macchiati per la z-H2AX e 53BP1 sono comunemente utilizzate nella radiobiologia e sono associate al numero DNA-DSB e sono considerate come marcatori efficienti e sensibili per monitorare l'induzione e la riparazione di DNA-DSB19. La procedura di co-colorazione di -H2AX e 53BP1 è una procedura standard per la rilevazione di DNA-DSBs. La formazione dei focolai di H2AX è associata al reclutamento di 53BP1, regolatore della risposta al danno del DNA<sup clas...

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente determinata. Questo protocollo fornisce una procedura passo-passo per eseguire il rilevamento di foci indotti da radiazioni (RIF) di proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza, ad esempio, nella linea cellulare umana dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.
Le radiazioni ionizzanti (IR) inducono una moltitudine di diversi tipi di danno al DNA (DNA-DSB, DNA-SSB, danni alla base del DNA) da cui le rotture del DNA a doppio filamento sono le lesioni del DNA più genotossiche1. Le rotture non riparate possono causare la morte delle cellule, mentre le rotture errate aumentano la probabilità di riarrangiamento cromosomico, mutagenesi e perdita di informazioni genetiche decisive. I percorsi di risposta ai danni che rispondono ai DSB includono vie di riparazione del DNA come l'unione finale non omologa (NHEJ), un meccanismo che richiede Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4, e DNA ligase IV come fattori chiave2,3,4,5,6. Nei mammiferi, la seconda via principale di riparazione del DNA è la via omologa di riparazione della ricombinazione (HRR) che richiede componenti chiave - la famiglia genica Rad52 epistasis – Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 e Rad587. Rad51 e Rad54 sono fattori chiave di ricombinazione umana coinvolti nei meccanismi di riparazione legati allo stress da replicazione e alle rotture del DNA negli eucarioti. È interessante notare che è stato osservato che la downregolazione del percorso HRR migliora la via NHEJ che è soggetta a errori indicando la pertinenza del percorso HR per la stabilità del genoma8.
Il primo passo della formazione dei DSB è la fosforolalazione dell'istone di z-H2AX a Ser-139 dell'Ataxia telangiectasia mutata chinasi (ATM) della famiglia pi3 chinasi7,8. È interessante notare che il fosfororylazione H2AX può essere facilmente visualizzata con la tecnica dell'immunofluorescenza come foci (z-H2AX foci) utilizzando anticorpi specifici per il fosforoH6. C'è una relazione 1:1 tra il numero di DSB e i foci di z-H2AX, quindi, il marcatore DSB, z-H2AX, è studiato ampiamente attraverso la caratterizzazione della formazione di foci, delle dimensioni e della quantità6,7,8,9,10,11.11 La formazione di foci di z-H2AX porta al reclutamento e all'accumulo di proteine d'emergenza (DDR) e fattori che modificano la cromatina, come 53BP1 (proteina legante p53 1), MDC1 (mediatore del checkpoint del danno al DNA), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1 e molti altri fattori di riparazione che formano così i fattori di riparazione indotti da radiazioni (RIF). Tutte queste proteine co-localizzano con la z-H2AX attraverso il legame diretto o indiretto1,11,12.
È importante rilevare i danni al DNA e riparare con un adeguato test sensibile, quindi, più attenzione è prestata allo sviluppo di tecniche altamente precise13. Nel contesto degli studi di riparazione e danni al DNA, la metodologia è fondamentale per il rilevamento sensibile del danno del DNA del genoma, la descrizione della categoria di danni e la quantificazione del danno del DNA e dei meccanismi di riparazione13. Per rilevare singole cellule con DNA danneggiato, il saggio della cometa viene utilizzato comunemente negli studi radiobiologici14. Altri metodi citogenetici disponibili riconoscono le aberrazioni cromosomiche, tra cui dicentrici, traslocazioni, frammenti acentrici, anelli e aberrazioni di tipo cromata, e danni cromosomici micronucleosi (Mn). Il metodo più frequentemente usato nella radiobiologia, specialmente nella dosimetria biologica, è il saggio cromosomico dicentrico dovuto alla sua elevata specificità per la radiazione15. Ad esempio, la PCR, un metodo molecolare classico, non è in grado di riconoscere il tipo di danno rilevato al DNA. In questo caso, i metodi immunometrici passano il livello di sensibilità perché le reazioni sono specifiche tra l'antigene e l'anticorpo. L'imaging dell'immunofluorescenza fornisce prove visive per la comparsa di diverse proteine in focolai distinti in risposta ad agenti dannosi del DNA come le radiazioni ionizzanti16. Tuttavia, i livelli di attivazione dei danni e dei livelli di mRNA delle proteine di riparazione sono facilmente rilevabili dalla PCR in tempo reale, il cui metodo quantitativo è un metodo quantitativo adeguato per ulteriori studi molecolari nel contesto della risposta al danno del DNA17.
Tenendo conto che i foci-H2AX attirano i fattori di riparazione18, per monitorare i danni al DNA e la riparazione a livello cellulare, abbiamo sviluppato una procedura affidabile di colorazione immunofluorescenza, basata sull'analisi dei focolai proteici di riparazione rappresentativi dal percorso NHEJ (DNA-PKcs) e Rad52 dal percorso HRR.
Qui, proponiamo l'uso dell'immunodiagnosi per queste proteine come procedura efficiente e sensibile per il monitoraggio dell'induzione e della riparazione del DNA-DSB. Fino ad ora, non ci sono stati dati disponibili sul DNA-DSB a base di foci di proteine di riparazione a livello cellulare dopo l'irradiazione a fascio misto di neutroni per BNCT, ad eccezione dei marcatori di -H2AX e 53BP119. Suggeriamo l'adattamento della linea cellulare del cancro del colon HCT-116, in quanto è ricca di DSBs foci, come linea cellulare standard per l'analisi dei danni al DNA, perché i RIF sono facilmente rilevabili. Questa linea cellulare aderente è facile da mantenere e corretta per le procedure di irradiazione. La procedura proposta si basa su un'enorme quantità di studi precedenti relativi alla procedura generale di immunofluorescenza della colorazione z-H2AX. Tuttavia, include tutti i dettagli relativi alla selezione di anticorpi appropriati con diluizioni testate per ogni proteina rappresentativa appartenente a ciascun percorso di riparazione. Inoltre, descrive l'utilizzo di un fascio unico miscelato a neutroni utilizzato nella terapia BNCT. Tuttavia, si consiglia di estendere gli studi con entrambi i metodi, l'immunofluorescenza colorazione prima e poi, con l'analisi molecolare ad alto costo come eseguito in precedenza4,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7.183.390.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Borono-L-phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>17755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule)&#8211;FITC antibody produced in goat</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F0257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD52 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB117097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>BSAV-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT-116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>http://www.mediacy.com/imagepro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA II Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>B-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS</td>
			<td>20.59.52.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>T13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution 0.25%</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells

Lo scopo del manoscritto è quello di fornire un protocollo graduale per l'esecuzione della microscopia immunofluorescenza per studiare la risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni indotta dal fascio misto neutro-gamma utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boro (BNCT). In particolare, la metodologia proposta viene applicata per il rilevamento dell'attivazione delle proteine di riparazione che può essere visualizzata come foci utilizzando anticorpi specifici per le rotture del DNA a doppio filamento (DNA-DSB). I foci di riparazione del DNA sono stati valutati dall'immunofluorescenza nelle cellule tumorali del colon (HCT-116) dopo l'irradiazione con il fascio misto di neutroni. I DNA-DSB sono le lesioni più genotosine e vengono riparate nelle cellule dei mammiferi da due vie principali: la via di giunzione finale non omologa (NHEJ) e la riparazione omologa ricombinazione (HRR). Le frequenze dei foci, macchiati immunochimicamente, per i marcatori comunemente usati in radiobiologia come l'H2AX, 53BP1 sono associati al numero DNA-DSB e sono considerati marcatori efficienti e sensibili per monitorare l'induzione e la riparazione di DNA-DSB. È stato stabilito che i foci-H2AX attraggono le proteine di riparazione, portando ad una maggiore concentrazione di fattori di riparazione nei pressi di un DSB. Per monitorare i danni al DNA a livello cellulare, è stata pianificata un'analisi dell'immunofluorescenza per la presenza di focolai proteici di riparazione di riparazione DNA-PKcs rappresentativi dalla via NHEJ e Rad52 dal percorso HRR. Abbiamo sviluppato e introdotto un protocollo affidabile di colorazione dell'immunofluorescenza per il rilevamento della risposta al danno del DNA indotta da radiazioni con anticorpi specifici per i fattori di riparazione delle vie NHEJ e HRR e foci indotti da radiazioni (RIF) indotti da radiazioni. La metodologia proposta può essere utilizzata per studiare proteine di riparazione altamente attivate nel caso di radiazioni a fascio miscelato di neutroni, indicando così il predominio del percorso di riparazione.

In primo luogo, abbiamo eseguito un'analisi di un marcatore standard di rilevamento del DNA-DSB, foci di z - cellule tumorali del colon, non irradiati e irradiati con il fascio miscelato di neutroni. I foci z-H2AX appaiono come distinti punti fluorescenti e mostrano la formazione di DNA-DSB (come ogni punto fluorescente z-H2AX rappresenta un singolo DSB) (vedi Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61...

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Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

La risposta al danno del DNA indotta dalle radiazioni attivata dal fascio misto di neutroni utilizzato nella terapia di cattura di neutroni boronica (BNCT) non è stata completamente stabilita. Questo protocollo fornisce una procedura graduale per rilevare i foci indotti da radiazioni (RIF) delle proteine di riparazione mediante colorazione immunofluorescenza nelle linee cellulari del cancro del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio di neutroni misto.

Immunofluorescenza Immagini di danno al DNA e riparazione Foci nelle cellule tumorali del colon umano

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Questo protocollo prevede una procedura passo-passo per rilevare i focolai indotti dalle radiazioni delle proteine di riparazione mediante colorazione dell'immunofluorescenza nelle linee cellulari del colon umano dopo l'irradiazione con il fascio misto neutroni. L'imaging ad immunofluorescenza è un metodo sensibile e fornisce prove visive per la comparsa di proteine della via di riparazione nei focolai in risposta agli agenti dannosi del DNA, come le radiazioni ionizzanti. Il fascio misto neutronico è usato nella terapia di cattura neutronica del boro, BNCT, e la risposta ai danni al DNA indotta dalle radiazioni non è stata completamente stabilita.Il nostro protocollo può anche essere utile per l'analisi degli effetti biologici a livello cellulare dovuti alle radiazioni di altri fasci ad alto LET, come protoni che utilizzano la terapia con fascio di protoni o ioni di carbonio utilizzando la terapia adron. Dopo l'irradiazione, rimuovere il mezzo dalle cellule attaccate e lavarle una volta con 2,5 millilitri di PBS. Quindi fissare le cellule con un millilitro di 70%etanolo per 10 minuti.Per permeabilizzare le cellule, rimuovere l'etanolo e lavarle con 2,5 millilitri di PBS. Aggiungere delicatamente un millilitro di 2%Triton X-100 in PBS per coprire i copripavimenti e incubare le cellule per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle tre volte con PBS e bloccare la permeabilizzazione con un millilitro di 2%BSA diluito in PBS.Quindi incubare le cellule per un minimo di 30 minuti con il 2%BSA. Per macchiare le cellule, aggiungere la giusta quantità di anticorpo primario diluito in PBS con BSA, come raccomandato nel manoscritto testuale. Quindi coprire la piastra di Petri e posizionare in una scatola di plastica con lignina idratata per mantenere l'umidità.Incubarlo per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, eseguire tre lavaggi con PBS e aggiungere la giusta quantità di anticorpi secondari. Riportare il piatto nella scatola di plastica con lignina idratata e incubarlo per almeno 30 minuti a 37 gradi Celsius.Quindi ripetere i lavaggi con PBS e aggiungere 100 microlitri di DAPI diluiti a una concentrazione finale di un microgrammo per millilitro per controsostenere i nuclei. Incubare le cellule per un massimo di due minuti a temperatura ambiente e ripetere i lavaggi con PBS. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il PBS e mettere delicatamente un coverslip sopra il mezzo di montaggio, evitando la formazione di bolle d'aria.Sigillare i bordi del coverslip con smalto per unghie e lasciare indurire il supporto di montaggio prima di eseguire la microscopia a fluorescenza. I focolai gamma-H2AX, che sono marcatori standard per le rotture a doppio filamento di DNA, sono stati rilevati in cellule tumorali del colon miscelate a neutroni, irradiate dal fascio e non irradiate. I fuochi appaiono come punti fluorescenti distinti.Nelle cellule irradiate è stato osservato un diametro più elevato dei focolai gamma-H2AX. Inoltre, è stato rilevato un singolo binario di una particella alfa ad alto LET che attraversa i nuclei. La microscopia ad immunofluorescenza è stata utilizzata per rilevare proteine rappresentative rad52 e protein chinasi dipendente dal DNA.Un alto valore medio del diametro dei focolai di chinasi proteica dipendente dal DNA è stato misurato alle rotture del DNA dopo l'irradiazione rispetto alle cellule di controllo. Le rotture a doppio filamento di DNA raggruppate sono state osservate nelle cellule irradiate come focolai più complessi, più grandi e raggruppati con maggiore intensità. Lo stadio più importante della colorazione dell'immunofluorescenza è la fissazione delle cellule e la permeabilità della membrana cellulare.Questi passaggi sono necessari per consentire agli anticorpi di penetrare facilmente sia in quelle cellule che nelle proteine di riparazione intracellulari. Questa procedura fornisce informazioni sull'attivazione di ogni percorso di riparazione a livello cellulare. I risultati dovrebbero quindi essere confermati a livello molecolare utilizzando un saggio, come la PCR in tempo reale.Questa tecnica consente ai ricercatori di esplorare la risposta ai danni al DNA indotta dalle radiazioni, che non è stata completamente determinata nel caso di travi diverse che utilizzano terapie antitumorali.

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