Name: immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells
Uploaded: 2020-06-09T15:00:00
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중성자/감마 방사선으로 구성된 중성자 혼합 빔은 폴란드 국립 핵연구 센터의 마리아 연구 원자로에서 접근했다. K.M.O.는 폴란드 국립 과학 센터(Miniatura 2)가 #2018/02/X/NZ5/02849를 지원받았습니다.

1. 세포 배양 및 실험 설정 준비
<ol><li>인간 대장암세포를 유지, HCT-116 공급 업체에 의해 권장, 75cm2 배양 플라스크에서 단층으로 10 mL를 포함하는 맥코이의 5a 중간 변형, 10% 태아 소 혈청과 1% 항생제 항mycotic 용액으로 보충.</li>
	<li>가습된 5%CO2 환경에서 37°C에서 2~3일마다 중간 재생과 함께 70%의 응력까지 세포를 성장시다.</li>
	<li>BNCT 빔(예를 들어,21중성자 빔 플?...

<ol>
	<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+DNA+Damage+Induced+by+High+Linear+Energy+Transfer+Alpha-Particles+and+Protons+Triggers+a+Specific+Cellular+DNA+Damage+Response.">Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).</li><li>Kondo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+induced+by+boron+neutron+capture+therapy+is+partially+repaired+by+DNA+ligase+IV.">DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV.</a> Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).</li><li>Sakai, W., Sugasawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Recognition+and+Repair+in+Mammalian+Global+Genome+Nucleotide+Excision+Repair.">DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair.</a> DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).</li><li>Rodriguez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+DNA+damage+and+repair+mechanisms+induced+by+BNCT+in+a+poorly+differentiated+thyroid+carcinoma+cell+line.">In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line.</a> Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).</li><li>Sollazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Dynamics+of+53BP1+Foci+Following+Simultaneous+Induction+of+Clustered+and+Dispersed+DNA+Damage+in+U2OS+Cells.">Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).</li><li>Jeggo, P., L&#246;brich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+responses.">Radiation-induced DNA damage responses.</a> Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).</li><li>Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+DNA+pairing+by+human+recombination+factors+Rad51+and+Rad54.">Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).</li><li>Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Dynamics+of+Rad51+and+Rad54+in+Response+to+Postreplicative+Stress+and+DNA+Damage+in+HeLa+Cells.">Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells.</a> Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylates+histone+H2AX+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+phosphorylation+controls+Crb2+recruitment+at+DNA+breaks,+maintains+checkpoint+arrest,+and+influences+DNA+repair+in+fission+yeast.">Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Sage, E., Shikazono, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+clustered+DNA+lesions:+Repair+and+mutagenesis.">Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).</li><li>Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+immunoassays+in+DNA+damage+and+instability+detection.">Review: immunoassays in DNA damage and instability detection.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).</li><li>M&#248;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+bromate+as+positive+assay+control+for+the+Fpg-modified+comet+assay.">Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay.</a> Mutagenesis. , (2020).</li><li>Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronucleus+Assay:+The+State+of+Art,+and+Future+Directions.">Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).</li><li>Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+imaging+of+DNA+damage+response+proteins:+optimizing+protocols+for+super-resolution+microscopy.">Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy.</a> Methods. 48 (1), 63-71 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+dispersed+and+clustered+DNA+lesions+compromises+DNA+damage+response+in+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes.</a> PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Okumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+biological+effects+of+neutron+mixed-beam+irradiation+for+boron+neutron+capture+therapy+on+cell+survival+and+DNA+double-strand+breaks+in+cultured+mammalian+cells.">Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells.</a> Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).</li><li>Dagrosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evaluation+of+the+biologic+effectiveness+factors+of+boron+neutron+capture+therapy+(BNCT)+in+a+human+colon+carcinoma+cell+line.">First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).</li><li>Dagrosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+for+the+application+of+boron+neutron+capture+therapy+to+the+treatment+of+differentiated+thyroid+cancer.">Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer.</a> Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).</li><li>Reynolds, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Ku70/80+and+DNA-PKcs+at+DSBs+induced+by+ionizing+radiation+is+dependent+on+the+complexity+of+damage.">The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage.</a> Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).</li><li>Rasche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Lymphocytic+DNA+Damage+in+Early+Multiple+Sclerosis+by+Automated+Gamma-H2AX+and+53BP1+Foci+Detection:+A+Case+Control+Study.">Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study.</a> PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).</li><li>Ban&#225;th, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).</li><li>Barth, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+boron+neutron+capture+therapy+of+high+grade+gliomas+and+recurrent+head+and+neck+cancer.">Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer.</a> Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).</li><li>Mirzaei, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+neutron+capture+therapy:+Moving+toward+targeted+cancer+therapy.">Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy.</a> Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).</li><li>Vitti, E. T., Parsons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Radiobiological+Effects+of+Proton+Beam+Therapy:+Impact+on+DNA+Damage+and+Repair.">The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair.</a> Cancers. 11 (7), 946 (2019).</li><li>Mohamad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+Ion+Radiotherapy:+A+Review+of+Clinical+Experiences+and+Preclinical+Research,+with+an+Emphasis+on+DNA+Damage/Repair.">Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair.</a> Cancers. 9 (6), 66 (2017).</li></ol>

포시의 주파수, γ-H2AX 및 53BP1을 위해 면역화학적으로 염색된 것은 방사선생물학에서 일반적으로 사용되며 DNA-DSB 번호와 연관되며 DNA-DSB(19)의 유도 및19수리를 모니터링하기 위한 효율적이고 민감한 마커로 간주됩니다. γ-H2AX 및 53BP1의 공동 염색 절차는 DNA-DSBs의 검출을 위한 표준 절차입니다.23 그러나, 상이한 세포주(γ-H2AX/53BP1 foci 11)의배경 ?...

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 결정되지 않았다. 이러한 프로토콜은 중성자 혼합 빔을 조사한 후 인간 대장암 세포주에서 면역형 염색에 의한 수리 단백질의 방사선 유도 포시(RIF)의 검출을 수행하기 위한 단계별 절차를 제공한다.
이온화 방사선(IR)은 DNA 이중 가닥 휴식이 가장 유전자 독성 DNA 병변1인DNA 손상(DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA 기지 손상)의 다양한 유형의 DNA 손상을 유도한다. 수리되지 않은 휴식은 세포 사망을 일으킬 수 있으며, 잘못 수리된 휴식은 염색체 재배열, 돌연변이 발생 및 결정적인 유전 정보의 손실 가능성을 높입니다. DSB에 반응하는 손상 반응 경로는 비 동형 종조 (NHEJ) 같은 DNA 수리의 경로를 포함, Ku 70/80을 필요로하는 메커니즘, DNA -PKcs, Xrcc4, DNA 리개세 IV주요 요인으로22,3,,4,,5,,6. 포유류에서, 두 번째 주요 DNA 수리 경로는 주요 구성 요소를 필요로 동종 재조합 수리 (HRR) 경로 - Rad52 에피스타시스 유전자 가족 - Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 및 Rad587. Rad51 및 Rad54는 진핵생물의 복제 스트레스 및 DNA 파손과 관련된 수리 메커니즘에 관여하는 주요 인간 재조합 요소입니다. 흥미롭게도, HRR 통로의 다운규제는 게놈 안정성에 대한 HR 통로 관련성을 가리키는 오류가 발생하기 쉬운 NHEJ 통로를 향상시키는 것으로 관찰되었다8.
DSB의 형성의 첫 번째 단계는 PI3 키나아제 패밀리7,,8에서알로카 텔란지크시아 돌연변이 키나아제(ATM)에 의해 Ser-139에서 γ-H2AX 히스톤의 인광이다. 흥미롭게도, H2AX 인산화는 인광H2AX6에특이적 항체를 사용하여 포시(γ-H2AX foci)로서 면역형광 기술에 의해 쉽게 시각화될 수 있다. DSB와 γ-H2AX 포시의 수 사이에 는 1:1 관계가 있기 때문에, DSB 마커, γ-H2AX는, 포시 형성, 크기 및 수량6,,7,,8,,9,,10,,11의특성화를 통해 광범위하게 연구된다. γ-H2AX 포시의 형성은 53BP1(p53 결합 단백질 1), MDC1(DNA 손상 체크포인트의 중재자), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, 및 많은 수산 계보(이와 같은 DNA 손상 반응)의 모집 및 축적으로 이어집니다. 이러한 모든 단백질은 직간접 결합1,,11,12를통해 γ-H2AX와 공동 국한한다.,
적절한 민감한 검사를 통해 DNA 손상을 감지하고 수리하는 것이 중요하므로, 고정밀 기술의 개발에 더 많은 주의를기울인다(13). DNA 손상 및 수리 연구의 맥락에서, 방법론은 게놈 DNA 손상의 민감한 검출, 손상 범주의 설명 및 DNA 손상 및 수리 메커니즘의 정량화에 매우 중요하다13. 손상된 DNA를 가진 단 하나 세포를 검출하기 위하여는, 혜성 분석은 방사선 생물학 연구결과 14에서일반적으로 이용됩니다. 다른 사용 가능한 세포 유전학 방법은 다심루, 전좌, 심심 단편, 고리 및 크로마티드 형 수차 및 미세 핵 염색체 손상(Mn)을 포함한 염색체 수차를 인식합니다. 방사선 생물학에서 가장 자주 사용되는 방법은, 특히 생물학적 도시계에서, 방사선 에 대한 높은 특이성으로 인한 심루 염색체 분석이다15. 예를 들어, 고전적인 분자 방법인 PCR은 검출된 DNA 손상의 유형을 인식할 수 없습니다. 이 경우, 면역측정 방법은 반응이 항원과 항체 사이에 특이적이기 때문에 감도 수준을 통과한다. 면역 형광 화상 진찰은 이온화 방사선16같이 DNA 손상 에이전트에 응하여 구별되는 foci에 있는 다른 단백질의 외관을 위한 시각적인 증거를 제공합니다. 그러나, 손상 및 수리 단백질의 mRNA 수준의 활성화 수준은 DNA 손상 반응반응(17)의맥락에서 추가 분자 연구를 위한 적절한 정량적 방법이되는 실시간 PCR에 의해 쉽게 검출할 수 있다.
γ-H2AX 포시가 수리인자(18)를유치하고, 세포 수준에서 DNA 손상 및 수리를 모니터링하는 것을 고려하여, HRR 통로에서 NHEJ 통로(DNA-PKcs)와 Rad52로부터 대표적인 수리 단백질 포치의 분석을 기반으로 신뢰할 수 있는 면역형 플루오레스 염색 절차를 개발했습니다.
여기에서, 우리는 DNA-DSB 유도 및 수리를 감시하기 위한 효율적이고 민감한 절차로 이 단백질을 위한 면역 검출의 사용을 제안합니다. 지금까지, Γ-H2AX 및 53BP1 마커19를제외하고 BNCT에 대한 중성자 혼합 빔 조사 후 세포 수준에서 수리 단백질의 초점에 기초하여 DNA-DSBs에 대한 사용 가능한 데이터가 없었다. 우리는 HCT-116 결장암 세포주의 적응을 건의합니다, 그것은 DSBs foci에서 풍부하기 때문에, DNA 손상 분석을 위한 표준 세포주로서, RIF는 쉽게 검출하기 때문에. 이 부착 된 세포주 유지 하기 쉽고 조사 절차에 대 한 적절 한. 제안된 절차는 γ-H2AX 염색의 일반적인 면역 형광 절차와 관련된 이전 연구의 거대한 양을 기반으로합니다. 그러나, 각 수리 경로에 속하는 각 대표적인 단백질에 대해 테스트된 희석을 가진 적절한 항체의 선택에 관한 모든 세부 사항을 포함한다. 더욱이, BNCT 치료에 사용되는 독특한 중성자 혼합 빔의 활용을 설명합니다. 그러나,이전에,수행된 바와 같이 고비용 분자 분석을 통해 두 가지 방법, 면역형광 염색을 먼저 연장하는 것이좋습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7.183.390.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Borono-L-phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>17755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule)&#8211;FITC antibody produced in goat</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F0257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD52 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB117097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>BSAV-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT-116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>http://www.mediacy.com/imagepro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA II Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>B-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS</td>
			<td>20.59.52.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>T13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution 0.25%</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells

원고의 목적은 붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 감마 혼합빔에 의해 유도된 방사선 유도 DNA 손상 반응을 연구하기 위해 면역형광 현미경 검사를 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 제공하는 것이다. 구체적으로, 제안된 방법론은 DNA 이중 가닥 휴식(DNA-DSBs)에 특이적인 항체를 사용하여 포시로 시각화될 수 있는 수리 단백질 활성화의 검출을 위해 적용된다. DNA 복구 포시는 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 결장 암 세포 (HCT-116)에서 면역 형광에 의해 평가되었다. DNA-DSB는 가장 유독성 병변이며 두 가지 주요 경로에 의해 포유류 세포에서 수리됩니다: 비 동형 최종 결합 경로 (NHEJ) 및 상동성 재조합 수리 (HRR). 국소, 면역화학적으로 염색된 포시의 주파수는 γ-H2AX와 같은 방사선 생물학에서 일반적으로 사용되는 마커를 위해, 53BP1은 DNA-DSB 번호와 연관되고 DNA-DSB의 유도 및 수리를 감시하기 위한 효율적이고 민감한 마커로 간주됩니다. γ-H2AX 포시가 수리 단백질을 유치하여 DSB 근처의 고농도의 수리 인자를 유도한다는 것이 확립되었습니다. 세포 수준에서 DNA 손상을 모니터링하기 위해, HRR 통로로부터 의 DNA-PKcs 대표 수리 단백질 포시의 존재를 위한 면역형광 분석및 HRR 통로로부터 Rad52가 계획되었다. NHEJ 및 HRR 경로및 관찰된 방사선 유도 포시(RIF)로부터의 수리 인자에 특이적인 항체를 이용한 방사선 유도 DNA 손상 반응의 검출을 위한 신뢰할 수 있는 면역형 염색 프로토콜을 개발 및 도입했습니다. 제안된 방법론은 중성자 혼합 빔 방사선의 경우 고도로 활성화되는 수리 단백질을 조사하는 데 사용될 수 있으며, 이로 인해 수리 경로의 지배력을 나타낸다.

첫째, 우리는 대장암세포에서 DNA-DSB, γH2AX 포시의 검출의 표준 마커의 분석을 수행, 비방사, 중성자 혼합 빔으로 조사. γ-H2AX 포시는 뚜렷한 형광점으로 나타나고 DNA-DSB의 형성을 나타낸다(각 γ-H2AX 형광점은 단일 DSB를 나타내기 때문에)(도 1참조).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61399/61399fig01.jpg"> 도 1: 세포주 ...

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Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

붕소 중성자 포획 요법(BNCT)에 사용되는 중성자 혼합빔에 의해 활성화된 방사선 유도 DNA 손상 반응은 완전히 확립되지 않았다. 이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 면역 형광 염색에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 포시 (RIF)를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다.

인간 결장 암 세포에 있는 DNA 손상 및 복구 Foci의 면역 형광 화상 진찰

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

이 프로토콜은 중성자 혼합 빔으로 조사 한 후 인간 대장암 세포주에서 염색된 면역 형광에 의해 수리 단백질의 방사선 유도 된 포시를 검출하는 단계별 절차를 제공합니다. 면역 형광 화상 진찰은 민감한 방법이며 이온화 방사선과 같은 DNA 손상 에이전트에 대한 응답으로 foci에서 수리 경로 단백질의 출현에 대한 시각적 증거를 제공합니다. 중성자 혼합 빔은 붕소 중성자 포획 요법, BNCT 및 방사선 유발 DNA 손상 반응이 완전히 확립되지 않은 데 사용된다.우리의 프로토콜은 또한 다른 높은 LET 빔에 의한 방사선으로 인한 세포 수준에서 생물학적 효과의 분석에 유용 할 수있다, 양성자 빔 치료를 사용하여 양성자 빔 또는 하드론 치료를 사용하여 탄소 이온과 같은. 조사 후, 부착 된 세포에서 배지를 제거하고 PBS의 2.5 밀리리터로 한 번 세척하십시오. 그런 다음 10 분 동안 70 %의 에탄올의 1 밀리리터로 세포를 수정합니다.세포를 투약화하려면 에탄올을 제거하고 PBS의 2.5 밀리리터로 세척하십시오. PBS에 2%트리톤 X-100의 밀리리터 1밀리리터를 부드럽게 추가하여 커버립을 덮고 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. PBS로 세포를 세 번 세척하고 PBS에서 희석된 2%BSA의 1밀리리터로 투과화를 차단합니다.그런 다음 2%BSA로 최소 30분 동안 세포를 배양한다. 세포를 염색하려면 텍스트 원고에서 권장되는 대로 PBS에서 희석된 1차 항체의 적절한 양을 BSA로 추가합니다. 그런 다음 페트리 접시를 덮고 습도를 유지하기 위해 보습 리그닌이있는 플라스틱 상자에 놓습니다.섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션을 사용하세요. 인큐베이션 후 PBS로 3개의 세차스를 수행하고 적절한 양의 이차 항체를 첨가한다. 수분이 있는 리그닌으로 접시를 플라스틱 상자에 반납하고 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다.그런 다음 PBS로 세초를 반복하고, 핵을 카운터스테인하기 위해 밀리리터 당 1 마이크로그램의 최종 농도로 희석된 DAPI의 100 마이크로리터를 추가한다. 실온에서 최대 2분 동안 세포를 배양하고 PBS로 세척을 반복합니다. 마지막 세척 후 PBS를 제거하고 장착 매체 위에 커버슬립을 부드럽게 놓아 기포의 형성을 피하십시오.매니큐어로 커버슬립의 가장자리를 밀봉하고 형광 현미경 검사를 수행하기 전에 장착 매체가 굳어지게 합니다. DNA 이중 좌초 휴식의 표준 마커인 감마-H2AX 포치는 중성자 혼합, 빔 조사 및 비조사 대장 암세포에서 검출되었다. foci는 뚜렷한 형광점으로 나타납니다.감마-H2AX 포시의 높은 직경은 조사된 세포에서 관찰되었다. 더욱이, 핵을 가로지르는 고-LET 알파 입자의 단일 트랙이 검출되었다. 면역형광 현미경 검사는 대표적인 수리 단백질 Rad52 및 DNA 의존성 단백질 키나아제검출을 위해 사용되었다.DNA 의존성 단백질 키나아제 포시 직경의 높은 평균 값은 대조군 세포와 비교하여 조사 후 DNA 휴식시 측정하였다. 클러스터된 DNA 이중 좌초 휴식은 조사된 세포에서 더 복잡하고, 더 크고, 더 높은 강도로 클러스터된 초점으로 관찰되었다. 면역 형광 염색의 가장 중요한 단계는 세포의 고정 및 세포막의 투과화입니다.이 단계는 항체가 그 세포 및 세포내 복구 단백질로 쉽게 침투하는 것을 허용하기 위하여 요구됩니다. 이 절차는 셀룰러 수준에서 각 수리 경로의 활성화에 대한 정보를 제공합니다. 결과는 실시간 PCR과 같은 분석서를 사용하여 분자 수준에서 확인되어야 합니다.이 기술은 연구원이 항암 치료를 사용하여 다른 광선의 경우에 완전히 결정되지 않은 방사선 유도한 DNA 손상 반응을 탐구하는 가능하게 합니다.

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Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

DNA 손상 생체 외에서 혜성 분석 결과 사용 하 여 평가

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

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Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

ΓH2AX와 53BP1 형성 및 DNA 두 배 물가 틈의 수리 분석에 대 한 면역 형광 검사 현미경 검사 법

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

순환 종양 세포를 캡처에 대 한 의료 와이어를 사용 하 여 종양 세포의 특성: 면역 형광 DNA 물고기 기반으로 3 차원 접근

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

마우스 결 장 종양 모델에서 콜론 미생물 생물 다양성에 환경 농축의 효과 정의 하는 방법

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

정상적인 대 장 암과 대 장 암-향상 된 프로토콜에서 인간의 내 피 세포의 고립

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

면역 형광 검사 현미경 검사 법에 의해 변이 및 긴-지속 이중 가닥 DNA 틈에 DNA 복구 과정을 특성화

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

암 연구에서 치료 및 진단 항체 바이오 유통 평가를 위한 생체내 면역형광 국소화

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

인간 유방 상피 세포에 있는 종양원성 변환의 시험관 내 평가

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

인간 말초 혈액 림프구의 γ-H2AX 포시 분석에 대한 자동화된 현미경 채점 방법

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...