Name: immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells
Uploaded: 2020-06-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells at JoVE.com

Nötron/gama radyasyonundan oluşan nötron karışımı ışınlara Polonya'daki Ulusal Nükleer Araştırma Merkezi'ndeki Maria araştırma reaktöründen erişildi. K.M.O. Polonya Ulusal Bilim Merkezi (Miniatura 2) tarafından #2018 desteklenmiştir.

1. Hücre kültürünün hazırlanması ve deneysel kurulum
<ol><li>İnsan kolon kanseri hücreleri korumak, HCT-116 tedarikçi tarafından tavsiye edildiği gibi, monolayers içinde 75 cm2 kültür şişeleri içeren 10 mL formüle McCoy's 5a Orta Modifiye, ile takviye 10% fetal sığır serum ve 1% antibiyotik antimikotik solüsyon.</li>
	<li>37 °C'de nemlendirilmiş %5 CO2 ortamında hücreleri 2-3 günde bir orta yenileme ile %70 oranında biraraya gelene kadar büyütün.</li>
	<li>BNCT ış...

<ol>
	<li>Carter, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+DNA+Damage+Induced+by+High+Linear+Energy+Transfer+Alpha-Particles+and+Protons+Triggers+a+Specific+Cellular+DNA+Damage+Response.">Complex DNA Damage Induced by High Linear Energy Transfer Alpha-Particles and Protons Triggers a Specific Cellular DNA Damage Response.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 100 (3), 776-784 (2018).</li><li>Kondo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+induced+by+boron+neutron+capture+therapy+is+partially+repaired+by+DNA+ligase+IV.">DNA damage induced by boron neutron capture therapy is partially repaired by DNA ligase IV.</a> Radiation Environmental Biophysics. 55 (1), 89-94 (2016).</li><li>Sakai, W., Sugasawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Damage+Recognition+and+Repair+in+Mammalian+Global+Genome+Nucleotide+Excision+Repair.">DNA Damage Recognition and Repair in Mammalian Global Genome Nucleotide Excision Repair.</a> DNA Replication, Recombination, and Repair: Molecular Mechanisms and Pathology. , 155-174 (2016).</li><li>Rodriguez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+DNA+damage+and+repair+mechanisms+induced+by+BNCT+in+a+poorly+differentiated+thyroid+carcinoma+cell+line.">In vitro studies of DNA damage and repair mechanisms induced by BNCT in a poorly differentiated thyroid carcinoma cell line.</a> Radiation Environmental Biophysics. 57 (2), 143-152 (2018).</li><li>Sollazzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Dynamics+of+53BP1+Foci+Following+Simultaneous+Induction+of+Clustered+and+Dispersed+DNA+Damage+in+U2OS+Cells.">Live Dynamics of 53BP1 Foci Following Simultaneous Induction of Clustered and Dispersed DNA Damage in U2OS Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (2), (2018).</li><li>Jeggo, P., L&#246;brich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+DNA+damage+responses.">Radiation-induced DNA damage responses.</a> Radiation Protection Dosimetry. 122 (1-4), 124-127 (2006).</li><li>Sigurdsson, S., Van Komen, S., Petukhova, G., Sung, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homologous+DNA+pairing+by+human+recombination+factors+Rad51+and+Rad54.">Homologous DNA pairing by human recombination factors Rad51 and Rad54.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (45), 42790-42794 (2002).</li><li>Choi, E. H., Yoon, S., Hahn, Y., Kim, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+Dynamics+of+Rad51+and+Rad54+in+Response+to+Postreplicative+Stress+and+DNA+Damage+in+HeLa+Cells.">Cellular Dynamics of Rad51 and Rad54 in Response to Postreplicative Stress and DNA Damage in HeLa Cells.</a> Molecules and Cells. 40 (2), 143-150 (2017).</li><li>Burma, S., Chen, B. P., Murphy, M., Kurimasa, A., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATM+phosphorylates+histone+H2AX+in+response+to+DNA+double-strand+breaks.">ATM phosphorylates histone H2AX in response to DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 42462-42467 (2001).</li><li>Nakamura, T. M., Du, L. L., Redon, C., Russell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone+H2A+phosphorylation+controls+Crb2+recruitment+at+DNA+breaks,+maintains+checkpoint+arrest,+and+influences+DNA+repair+in+fission+yeast.">Histone H2A phosphorylation controls Crb2 recruitment at DNA breaks, maintains checkpoint arrest, and influences DNA repair in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 24 (14), 6215-6230 (2004).</li><li>Kuo, L. J., Yang, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma-H2AX+-+a+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks.">Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).</li><li>Sage, E., Shikazono, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-induced+clustered+DNA+lesions:+Repair+and+mutagenesis.">Radiation-induced clustered DNA lesions: Repair and mutagenesis.</a> Free Radical Biology and Medicine. 107, 125-135 (2017).</li><li>Boguszewska, K., Szewczuk, M., Urbaniak, S., Karwowski, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+immunoassays+in+DNA+damage+and+instability+detection.">Review: immunoassays in DNA damage and instability detection.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (23), 4689-4704 (2019).</li><li>M&#248;ller, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+bromate+as+positive+assay+control+for+the+Fpg-modified+comet+assay.">Potassium bromate as positive assay control for the Fpg-modified comet assay.</a> Mutagenesis. , (2020).</li><li>Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micronucleus+Assay:+The+State+of+Art,+and+Future+Directions.">Micronucleus Assay: The State of Art, and Future Directions.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1534 (2020).</li><li>Bennett, B. T., Bewersdorf, J., Knight, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+imaging+of+DNA+damage+response+proteins:+optimizing+protocols+for+super-resolution+microscopy.">Immunofluorescence imaging of DNA damage response proteins: optimizing protocols for super-resolution microscopy.</a> Methods. 48 (1), 63-71 (2009).</li><li>Cheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+induction+of+dispersed+and+clustered+DNA+lesions+compromises+DNA+damage+response+in+human+peripheral+blood+lymphocytes.">Simultaneous induction of dispersed and clustered DNA lesions compromises DNA damage response in human peripheral blood lymphocytes.</a> PLoS One. 13 (10), 0204068 (2018).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Okumura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relative+biological+effects+of+neutron+mixed-beam+irradiation+for+boron+neutron+capture+therapy+on+cell+survival+and+DNA+double-strand+breaks+in+cultured+mammalian+cells.">Relative biological effects of neutron mixed-beam irradiation for boron neutron capture therapy on cell survival and DNA double-strand breaks in cultured mammalian cells.</a> Journal of Radiation Research. 54 (1), 70-75 (2013).</li><li>Dagrosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+evaluation+of+the+biologic+effectiveness+factors+of+boron+neutron+capture+therapy+(BNCT)+in+a+human+colon+carcinoma+cell+line.">First evaluation of the biologic effectiveness factors of boron neutron capture therapy (BNCT) in a human colon carcinoma cell line.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 79 (1), 262-268 (2011).</li><li>Dagrosa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+for+the+application+of+boron+neutron+capture+therapy+to+the+treatment+of+differentiated+thyroid+cancer.">Studies for the application of boron neutron capture therapy to the treatment of differentiated thyroid cancer.</a> Applied Radiation and Isotopes. 69 (12), 1752-1755 (2011).</li><li>Reynolds, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamics+of+Ku70/80+and+DNA-PKcs+at+DSBs+induced+by+ionizing+radiation+is+dependent+on+the+complexity+of+damage.">The dynamics of Ku70/80 and DNA-PKcs at DSBs induced by ionizing radiation is dependent on the complexity of damage.</a> Nucleic Acids Research. 40 (21), 10821-10831 (2012).</li><li>Rasche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Lymphocytic+DNA+Damage+in+Early+Multiple+Sclerosis+by+Automated+Gamma-H2AX+and+53BP1+Foci+Detection:+A+Case+Control+Study.">Analysis of Lymphocytic DNA Damage in Early Multiple Sclerosis by Automated Gamma-H2AX and 53BP1 Foci Detection: A Case Control Study.</a> PLoS One. 11 (1), 0147968 (2016).</li><li>Ban&#225;th, J. P., Macphail, S. H., Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+sensitivity,+H2AX+phosphorylation,+and+kinetics+of+repair+of+DNA+strand+breaks+in+irradiated+cervical+cancer+cell+lines.">Radiation sensitivity, H2AX phosphorylation, and kinetics of repair of DNA strand breaks in irradiated cervical cancer cell lines.</a> Cancer Research. 64 (19), 7144-7149 (2004).</li><li>Barth, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+boron+neutron+capture+therapy+of+high+grade+gliomas+and+recurrent+head+and+neck+cancer.">Current status of boron neutron capture therapy of high grade gliomas and recurrent head and neck cancer.</a> Radiatiation Oncology. 7, 146 (2012).</li><li>Mirzaei, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Boron+neutron+capture+therapy:+Moving+toward+targeted+cancer+therapy.">Boron neutron capture therapy: Moving toward targeted cancer therapy.</a> Journal of Cancer Research and Therapeutics. 12 (2), 520-525 (2016).</li><li>Vitti, E. T., Parsons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Radiobiological+Effects+of+Proton+Beam+Therapy:+Impact+on+DNA+Damage+and+Repair.">The Radiobiological Effects of Proton Beam Therapy: Impact on DNA Damage and Repair.</a> Cancers. 11 (7), 946 (2019).</li><li>Mohamad, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbon+Ion+Radiotherapy:+A+Review+of+Clinical+Experiences+and+Preclinical+Research,+with+an+Emphasis+on+DNA+Damage/Repair.">Carbon Ion Radiotherapy: A Review of Clinical Experiences and Preclinical Research, with an Emphasis on DNA Damage/Repair.</a> Cancers. 9 (6), 66 (2017).</li></ol>

Γ-H2AX ve 53BP1 için immünokimyasal olarak boyanmış foksin frekansları radyobiyolojide yaygın olarak kullanılır ve DNA-DSB numarası ile ilişkilidir ve DNA-DSB'lerin indüksiyon ve onarımını izlemek için etkili ve hassas belirteçler olarak kabul edilir19. Γ-H2AX ve 53BP1'in ortak boyama prosedürü DNA-DSB'lerin tespiti için standart bir prosedürdür. γ-H2AX foci oluşumu 53BP1, DNA hasar yanıtı23bir regülatör işe ile ilişkilidir. Ancak, γ-H2AX /53...

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron la karışık ışınla ışınlama dan sonra insan kolon kanseri hücre hattında immünororesans boyama gibi, radyasyonkaynaklı fok (RIF) onarım proteinlerinin tespitini gerçekleştirmek için adım adım bir prosedür sağlar.
İzole radyasyon (IR) DNA çift iplikçik sonları en genotoksik DNA lezyonları olan DNA hasarı (DNA-DSBs, DNA-SSBs, DNA baz hasarı) farklı türde çok sayıda neden olur1. Onarılmamış molalar hücre ölümüne neden olabilir, yanlış tamir edilmiş molalar kromozom yeniden düzenlenmesi, mutagenezi ve belirleyici genetik bilgi kaybı olasılığını yükseltir. DSB'lere yanıt veren hasar yanıt yolları arasında homolog olmayan son birleştirme (NHEJ), Ku 70/80, DNA-PKcs, Xrcc4 ve DNA ligaz IV gerektiren bir mekanizma gibi DNA onarım yolları yer almaktadır2,3,4,5,6. Memelilerde ikinci ana DNA onarım yolu, rad52 epistazis gen ailesi- Rad51, Rad52, Rad54, Rad55, Rad57 ve Rad587olmak üzere temel bileşenler gerektiren homolog rekombinasyon onarımı (HRR) yoludur. Rad51 ve Rad54 ökaryotlarda replikasyon stresi ve DNA kırılmaları ile ilgili onarım mekanizmalarında önemli insan rekombinasyon faktörleridir. İlginçtir, HRR yolunun downregulation genom stabilitesi için Hr yolu alaka işaret hata eğilimli NHEJ yolu geliştirir gözlenmiştir8.
DSBoluşumunun ilk adımı Pi3 kilaz ailesinden Ataxia telangieektazi mutasyona uğramış kilaz (ATM) tarafından Ser-139 γ-H2AX histonun fosforilasyon olduğunu7,8. İlginçtir, H2AX fosforilasyon fosforlu H2AX6için özel antikorlar kullanarak foci (γ-H2AX foci) olarak immünorfloresan tekniği ile kolayca görüntülenebilir. DSB'lerin sayısı ile γ-H2AX odakları arasında 1:1 ilişki vardır, bu nedenle, DSB marker, γ-H2AX, foci oluşumu, büyüklüğü ve miktarı6,7,,8,9,10,11karakterizasyonu ile kapsamlı olarak incelenir. Γ-H2AX foci oluşumu işe ve DNA hasar yanıtı (DDR) proteinleri ve kromatin değiştirici faktörlerin birikimine yol açar, gibi 53BP1 (p53 bağlayıcı protein 1), MDC1 (DNA hasar kontrol noktası arabulucusu), BRCA1, Mre11/Rad50/Nbs1, PARP-1, ve diğer birçok onarım faktörleri böylece radyasyon kaynaklı foci (RIF) oluşturan oluşturur. Tüm bu proteinler γ-H2AX ile doğrudan veya dolaylı bağlama yoluyla1,111,12ile birlikte lokalize dir.
Bu dna hasarı ve onarım uygun bir hassas test ile tespit etmek önemlidir, bu nedenle, daha fazla dikkat son derece hassas tekniklerin geliştirilmesi ne kadar ödenir13. DNA hasarı ve onarım çalışmaları bağlamında, metodoloji genom DNA hasarının hassas tespiti, hasar kategorisinin tanımlanması ve DNA hasar ve onarım mekanizmalarının sayısallaştırılması için çok önemlidir13. Hasarlı DNA'lı tek hücreleri tespit etmek için kuyruklu yıldız testi radyobiyolojik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır14. Diğer mevcut sitogenetik yöntemler, diysentrikler, translokasyonlar, asentrik parçalar, halkalar ve kromatit tip sapmaları ve mikronükleus kromozom hasarı (Mn) dahil olmak üzere kromozom sapmalarını tanır. Radyobiyolojide, özellikle biyolojik dozimetride en sık kullanılan yöntem, radyasyona özgüllüğü nedeniyle disantrik kromozomdosay'ıdır 15. Örneğin, klasik bir moleküler yöntem olan PCR, tespit edilen DNA hasarının türünü tanıyamaz. Bu durumda, immünometrik yöntemler duyarlılık seviyesini geçer çünkü reaksiyonlar antijen ve antikor arasında spesifiktir. İmmünofloresan görüntüleme, iyonlaştırıcı radyasyon gibi DNA zararlı ajanlara yanıt olarak farklı fosilerde farklı proteinlerin ortaya çıkması için görsel kanıtlar sağlar16. Ancak, hasar ve onarım proteinlerin mRNA düzeylerinin aktivasyon düzeyleri kolayca DNA hasar yanıtı bağlamında daha fazla moleküler çalışmalar için uygun bir kantitatif yöntemdir gerçek zamanlı PCR tarafından tespit edilebilir17.
Γ-H2AX foci onarım faktörleri çekmek dikkate alarak18, HÜCRESEL düzeyde DNA hasarı ve onarım izlemek için, biz güvenilir bir immünoresans boyama prosedürü geliştirdik, NHEJ yolu temsili onarım protein foci analizine dayalı (DNA-PKcs) ve RAD52 HRR yolu.
Burada, bu proteinler için immünoalgılamanın DNA-DSB indüksiyon ve onarımının izlenmesi için etkili ve hassas bir prosedür olarak kullanılmasını öneriyoruz. Şimdiye kadar, bnct için nötron karışık ışınlama sonra hücresel düzeyde onarım proteinlerinin foci dayalı DNA-DSBs üzerinde mevcut veri olmuştur, γ-H2AX ve 53BP1 belirteçleri hariç19. BIZ HCT-116 kolon kanseri hücre hattının adaptasyon öneririz, DSBs odak zengin kendisi olarak, DNA hasar analizi için standart bir hücre hattı olarak, RiFs kolayca tespit edilebilir çünkü. Bu yapışık hücre hattı bakımı kolaydır ve ışınlama prosedürleri için uygun. Önerilen prosedür γ-H2AX boyama genel immünofloresan prosedürü ile ilgili önceki çalışmaların büyük miktarda dayanmaktadır. Ancak, her onarım yoluna ait her temsili protein için test edilmiş seyreltme ile uygun antikorların seçimi ile ilgili tüm ayrıntıları içerir. Ayrıca, BNCT tedavisinde kullanılan benzersiz bir nötron-karışık ışın kullanımını açıklar. Ancak, her iki yöntem ile çalışmaları uzatmak için tavsiye, immünoresans boyama ilk ve daha sonra, daha önce yapılan yüksek maliyetli moleküler analiz ile4,17.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>12 mm Coverslips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89015-725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7.183.390.000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Borono-L-phenylalanine</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>17755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-DNA PKcs (phospho S2056) antibody - ChIP Grad</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB18192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mouse IgG (whole molecule)&#8211;FITC antibody produced in goat</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F0257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody, clone JBW301</td>
			<td>MerckMillipore</td>
			<td>05-636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-RAD52 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB117097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>BSAV-RO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>F9665</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCT-116 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247&#8482;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health (NIH)</td>
			<td>https://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Pro</td>
			<td>Media cybernetics</td>
			<td>http://www.mediacy.com/imagepro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUNA II Automated Cell Counter</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>L40002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#8217;s 5A Medium (Modified, with L-glutamine and sodium bicarbonate)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>M9309</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td>
			<td>B-1198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Hirszfeld Institute of Immunology and Experimental Therapy, PAS</td>
			<td>20.59.52.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Stain, 0.4%</td>
			<td>Logos Biosystems</td>
			<td>T13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution 0.25%</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunofluorescence imaging of dna damage and repair foci in human colon cancer cells

Makalenin amacı, bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron-gama karışık ışınının neden olduğu radyasyona bağlı DNA hasar yanıtını incelemek için immünoresans mikroskobu için adım adım bir protokol sağlamaktır. Özellikle, önerilen metodoloji DNA çift iplikçik sonları (DNA-DSBs) özgü antikorlar kullanılarak fok olarak görüntülenebilir onarım proteinleri aktivasyonu tespiti için uygulanır. DNA onarım odakları, nötron-karışık ışınla ışınlama sonrası kolon kanseri hücrelerinde (HCT-116) immünororesans ile değerlendirildi. DNA-DSB'ler en genotoksik lezyonlardır ve memeli hücrelerinde iki ana yol ile onarılır: homolog olmayan son birleştirme yolu (NHEJ) ve homolog rekombinasyon onarımı (HRR). Γ-H2AX, 53BP1 gibi radyobiyolojide yaygın olarak kullanılan belirteçler için fokların frekansları, 53BP1 DNA-DSB numarası ile ilişkilidir ve DNA-DSB'lerin indüksiyon ve onarımını izlemek için etkili ve hassas belirteçler olarak kabul edilir. Γ-H2AX foci'nin onarım proteinlerini cezbettiği ve DSB'ye yakın onarım faktörlerinin daha yüksek bir konsantrasyona yol ettiği tespit edilmiştir. HÜCRESEL düzeyde DNA hasarını izlemek için, NHEJ yolundan DNA-PKcs temsilcisi onarım protein foci ve HRR yolundan Rad52 varlığı için immünofloresans analizi planlandı. NHEJ ve HRR yollarından gelen onarım faktörlerine özgü antikorlar ve radyasyona bağlı foci (RIF) ile radyasyona bağlı DNA hasar yanıtının tespiti için güvenilir bir immünorfloresans boyama protokolü geliştirdik ve uygulamaya koyduk. Önerilen metodoloji, nötron-karışık ışın radyasyonu durumunda yüksek oranda aktive olan ve onarım yolunun hakimiyetini gösteren onarım proteinini araştırmak için kullanılabilir.

İlk olarak, DNA-DSBs tespiti standart bir belirteç bir analiz yapıldı, kolon kanseri hücrelerinde γH2AX foci, yayılamaz, ve nötron karışık ışın ile ışınlanmış. γ-H2AX foci farklı floresan nokta olarak görünür ve DNA-DSB'lerin oluşumunu gösterir (her γ-H2AX floresan nokta tek bir DSB'yi temsil eder) (Bkz. Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61399/61399fig01.jpg"> <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells at JoVE.com

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Bor nötron yakalama terapisinde (BNCT) kullanılan nötron karışık ışınıile aktive edilen radyasyona bağlı DNA hasar tepkisi tam olarak belirlenmemiştir. Bu protokol, nötron-karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında immünofloresan boyama tarafından onarım proteinlerinin radyasyonkaynaklı foci (RIF) tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar.

İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde DNA Hasarı ve Onarım Foci İmmünofloresan Görüntüleme

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Bu protokol nötron karışık ışın ile ışınlama sonra insan kolon kanseri hücre hatlarında boyama immünororeskence tarafından onarım proteinleri radyasyon kaynaklı odak tespit etmek için adım adım bir prosedür sağlar. İmmünofloresan görüntüleme hassas bir yöntemdir ve iyonlaştırıcı radyasyon gibi DNA zararlı ajanlarına yanıt olarak foci'deki onarım yolu proteinlerinin görünümü için görsel kanıtlar sağlar. Nötron-karışık ışın bor nötron yakalama tedavisi kullanılır, BNCT, ve radyasyona bağlı DNA hasar yanıtı tam olarak tespit edilmemiştir.Protokolümüz aynı zamanda proton ışın terapisi kullanan protonlar veya hadron terapisi kullanan karbon iyonları gibi diğer yüksek LET ışınlarının radyasyona bağlı olarak hücresel düzeydeki biyolojik etkilerinin analizinde de yararlı olabilir. Işınlama sonra, bağlı hücrelerden orta çıkarın ve pbs 2,5 mililitre ile bir kez yıkayın. Sonra 10 dakika boyunca% 70 etanol bir mililitre ile hücreleri düzeltmek.Hücreleri permeabilize etmek için, etanol kaldırmak ve PBS 2.5 mililitre ile yıkayın. Kapak dudaklarını kapsayacak şekilde PBS'ye %2'lik Triton X-100 mililitresini hafifçe ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile üç kez yıkayın ve permeabilizasyonu PBS'de seyreltilmiş %2 BSA'lık bir mililitre ile engelleyin.Daha sonra%2 BSA ile en az 30 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yatırın. Hücreleri lekelemek için, metin makalesinde önerildikçe PBS'de BSA ile seyreltilmiş uygun miktarda birincil antikor ekleyin. Sonra Petri çanak kapağı ve nem korumak için nemlendirilmiş lignin ile plastik bir kutuya yerleştirin.37 derecede 30 dakika kuluçkaya yat. Kuluçkadan sonra, PBS ile üç yıkar ve ikincil antikor uygun miktarda ekleyin. Bulaşıkları nemlendirilmiş lignin içeren plastik kutuya geri verin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra PBS ile yıkar ve çekirdekleri dengelemek için mililitre başına bir mikrogramın son konsantrasyonuna seyreltilmiş 100 mikrolitre DAPI ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında en fazla iki dakika kuluçkaya yatırın ve yıkayıp PBS ile tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, PBS'yi çıkarın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önleyerek montaj ortamının üzerine hafifçe bir kapak slip koyun.Kapak kapağının kenarlarını oje ile kapatın ve floresan mikroskopi yapmadan önce montaj ortamının sertleştirilmesine izin verin. DNA çift iplikli kırıklar için standart belirteçler olan Gamma-H2AX foci, nötron karışık, ışınlanmış ve ışınlanmamış kolon kanseri hücrelerinde tespit edildi. Foci farklı floresan nokta olarak görünür.Işınlanmış hücrelerde daha yüksek çapta gama-H2AX foci gözlendi. Dahası, yüksek let alfa parçacığının tek bir parçası çekirdekleri geçerken tespit edildi. İmmünofloresan mikroskobu rad52 ve DNA'ya bağımlı protein kiazını temsilen onarım proteinlerini saptamak için kullanıldı.DNA'ya bağımlı protein kiaz fosçapının ortalama değeri, kontrol hücreleriile karşılaştırıldığında ışınlama sonrası DNA molalarında ölçüldü. Daha karmaşık, daha büyük ve daha yüksek yoğunlukta kümelenmiş fosi olarak ışınlanmış hücrelerde kümelenmiş DNA çift iplikli kırıklar gözlendi. İmmünofloresan boyamanın en önemli aşaması hücrelerin fiksasyonu ve hücre zarının permeabilizasyonudur.Bu adımlar antikorların hem bu hücrelere hem de hücre içi onarım proteinlerine kolayca nüfuz etmesini sağlamak için gereklidir. Bu yordam, hücresel düzeyde her onarım yolunun aktivasyonu hakkında bilgi verir. Sonuçlar daha sonra gerçek zamanlı PCR gibi bir tahkikat kullanılarak moleküler düzeyde teyit edilmelidir.Bu teknik, araştırmacıların radyasyona bağlı DNA hasar yanıtını keşfetmelerini mümkün kılmıştır, bu da antikanser tedavileri kullanılarak farklı ışınlarda tam olarak belirlenmemiştir.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Cancer Research

Unit 1

DNA Replication and Repair

SCIENTISTS IN ACTION

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Evaluating In Vitro DNA Damage Using Comet Assay

Vitro DNA hasarı kuyruklu yıldız tahlil kullanarak değerlendirmek

DNA damage is a common phenomenon for each cell during its lifespan, and is defined as an alteration of the chemical structure of genomic DNA. Cancer ...

Immunofluorescence Microscopy of &#947;H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

Immunofluorescence Microscopy of ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³H2AX and 53BP1 for Analyzing the Formation and Repair of DNA Double-strand Breaks

ΓH2AX ve 53BP1 oluşumu ve DNA çift iplikli kırılmalara tamiri analiz etmek için ayirt mikroskobu

DNA double-strand breaks (DSB) are serious DNA lesions. Analysis of the formation and repair of DSB is relevant in a broad spectrum of research areas ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Yalıtım Normal kolon ve kolorektal Karsinom - gelişmiş bir iletişim kuralı üzerinden insan endotel hücrelerinin

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Characterizing DNA Repair Processes at Transient and Long-lasting Double-strand DNA Breaks by Immunofluorescence Microscopy

DNA onarım işlemleri, Darbe Gerilimlerinden ve uzun süreli iki iplikçikli DNA sonları ayirt mikroskobu ile karakterize

The repair of double-stranded breaks (DSBs) in DNA is a highly coordinated process, necessitating the formation and resolution of multi-protein repair ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Kanser Araştırmalarında Terapötik ve Tanısal Antikor Biyodağılımının Değerlendirilmesi için In Vivo Immunofluoresence Lokalizasyonu

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

An Automated Microscopic Scoring Method for the &#947;-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

An Automated Microscopic Scoring Method for the ÃƒÅ½Ã‚Â³-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes

İnsan Periferik Kan Lenfositlerinde γ-H2AX Odak Analizi için Otomatik Mikroskobik Puanlama Yöntemi

Ionizing radiation is a potent inducer of DNA damage and a well-documented carcinogen. Biological dosimetry comprises the detection of biological effects ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Kanser Hücrelerinin İç Karotis Arter Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...