Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

نود أن نشكر راؤول تيرون إكسبوزيتو على المساعدة التقنية الممتازة. وقد مول هذا العمل مجلس بحوث التكنولوجيا الأحيائية والعلوم البيولوجية (BB/R002517/1; MCP و FMA) وصندوق ويلكوم (203731/Z/16/A; SGU)

<ol>
	<li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success.">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters.">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li><li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases:+excitement+continues.">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li><li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNG+and+HCN+channels:+two+peas,+one+pod.">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li><li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+coupling+between+CFTR's+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations.">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li><li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1:+A+Mechanistic+Model.">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li><li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors.">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li><li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K(+)+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding.">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103 (2019).</li><li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K++channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry.">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775 (2020).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane.">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+'cell+cortices'+for+light+and+electron+microscopy.">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li><li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase/tRNA+expression+and+engineered+eRF1.">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li><li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature.">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).</li><li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions.">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li><li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding,+gating,+affinity+and+efficacy:+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors.">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry.">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels.">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).</li><li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels.">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels.">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry.">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K(+)+channels.">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li><li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization.">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance.">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li><li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction.">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li><li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels.">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li><li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel.">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).</li><li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1,+P2X3,+and+heteromeric+P2X2/3+receptors.">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li><li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization.">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

لقد طورنا طريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين في الوقت الفعلي ببروتينات الغشاء السليمة. تعتمد طريقتنا على العديد من التقنيات الراسخة الأخرى بما في ذلك وضع العلامات على البروتينات باستخدام ANAP باستخدام كودون توقفالكهرماني 12 ، وفك سقف الخلية 14 ، وقياس فلورة مشبك الجهد / PCF19،20،21،22،23،24،25. يسمح توليف هذه الأساليب بقياس ارتباط النوكليوتيدات بدقة مكانية وزمانية عالية. في الواقع ، في عملنا السابق ، تمكنا من التمييز بين مواقع الربط المختلفة على نفس مركب البروتين باستخدام هذا النهج10,11. الأهم من ذلك ، يمكن تطبيق هذه التقنية مباشرة على كميات صغيرة من البروتين في بيئة خلوية في ظل ظروف تحافظ على وظيفة البروتين. يتيح لنا استخدام طريقة الربط الخاصة بنا جنبا إلى جنب مع القراءة الكهربية المباشرة لتيارات القناة الأيونية الحصول على رؤى غنية حول الأسس الجزيئية لبوابةالقناة 11.
نظرا لأن مقاييس الطيف هي قطعة غير قياسية من معدات المختبر ، يمكن أيضا مراقبة شدة ANAP في عزلة نسبية باستخدام مرشحات تمرير النطاق. يصور الشكل 5B الخصائص الطيفية لاثنين من هذه المرشحات. يقوم مرشح تمرير النطاق 470/10 نانومتر بحجب إشارة التألق بشكل فعال من TNP-ATP ويتداخل جيدا مع ذروة مضان ANAP. ومع ذلك ، فإن ذروة نفاذية هذا المرشح تبلغ حوالي 50٪ فقط ، مما قد يجعل من الصعب الحصول على إشارات جيدة من الأغشية المعتمة (أو في بقع الغشاء المستأصلة تحت مشبك الجهد). خيار آخر هو مرشح تمرير النطاق 460/60 نانومتر. هناك تداخل أكثر قليلا بين مرشح 460/60 نانومتر وقدم ذروة انبعاث TNP-ATP مقارنة بمرشح 470/10 نانومتر. ومع ذلك ، فإن ممر النطاق 460/60 نانومتر لديه نفاذية بنسبة 90-95٪ على نطاق واسع من ذروة ANAP ، والتي من المتوقع أن تعزز إشارة انبعاث التألق.
ANAP هو فلوروفور حساس بيئيا12،26،27. تختلف ذروة الانبعاث والعائد الكمي اعتمادا على موقع الدمج على البروتين محل الاهتمام وقد يتغير مع تغير شكل البروتين. ستكون هذه التغييرات واضحة على الفور من أطياف الانبعاثات ولكنها لن تكون واضحة عند قياس شدة ANAP باستخدام المرشحات. على أي حال ، هناك حاجة إلى ضوابط مناسبة لإثبات أن إشارة التألق لا تختلف بسبب التغيرات في البيئة المحلية حول ANAP بعد ارتباط النوكليوتيدات. يمكن أن تساعد تجارب التحكم مع النيوكليوتيدات غير المسماة في التحقق من أن أي تغييرات في شدة ANAP هي نتيجة FRET بين ANAP و TNP-nucleotides. يمكن أن ترتبط نيوكليوتيدات TNP بشكل غير محدد بالأغشية المشتقة من الخلايا غير المنقولة (إما بغشاء البلازما أو ببروتينات الغشاء الأصلية)10. نحن نحدد كمية الارتباط كتناقص في مضان المتبرع ، لأن هذه الإشارة خاصة بالقناة الموصوفة. ومع ذلك ، نوصي بإجراء تجارب تحكم إضافية لكل زوج من الناهضات / المستقبلات ، على سبيل المثال تحور موقع ربط النوكليوتيدات إذا كان معروفا ، للتحقق من أن التغيير في مضان المتبرع هو في الواقع نتيجة الارتباط المباشر بالمستقبل المسمى11. أخيرا ، يوصى بالعمل مع التركيبات التي تحتوي على علامة بروتين الفلورسنت بالإضافة إلى ملصق ANAP. هذا يساعد على التمييز بين مضان المستقبلات المسمى من الخلفية / التألق الذاتي. يمكن تمييز مضان الخلفية عن ANAP من خلال ذروة وشكل أطياف الانبعاث10 ، ولكن مثل هذه التحديدات قد تكون صعبة للغاية عند استخدام مجموعات المرشح فقط. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحديد الخلايا والأغشية غير المسقوفة التي تعبر عن مستقبلات الفلورسنت باستخدام علامة البروتين الفلوري دون الحاجة إلى إثارة ANAP والمخاطرة بالتبييض الضوئي المفرط.
في العديد من سجلات PCF الخاصة بنا ، لاحظنا ذروة سلبية قوية في أطيافنا عند تركيزات عالية من TNP-ATP (الشكل 4C). هذه القمة السالبة هي قطعة أثرية من بروتوكول الطرح في الخلفية. يوضح الشكل 4D صورا ساطعة المجال وفلورية لماصة رقعة معرضة ل 1 mMM TNP-ATP. الظل عند طرف الماصة واضح ، ناتج عن استبعاد TNP-ATP من حجم جدران الماصة ، والذي يكون أكثر وضوحا داخل مستوى التركيز. تظهر الصورة الطيفية في الشكل 4E شريطا داكنا يتوافق مع هذا الظل. عند استخدام منطقة أعلى أو أسفل هذا الشريط الداكن لطرح الخلفية ، فإنها تنتج قمة سالبة. الأهم من ذلك ، أن هذه الذروة حدثت على نطاق الطول الموجي المقابل لانبعاث TNP-ATP ولم تؤثر على قياساتنا لتبريد ANAP.
كان القيد الرئيسي لتجاربنا هو الحصول على تعبير غشاء البلازما الكافي للتركيبات الموسومة ANAP لقياس التألق. كان من الأسهل عموما الحصول على أطياف عالية الجودة من الأغشية غير المسقوفة مقارنة ب PCF ، نظرا لحجمها الأكبر وقدرتنا على مسح طبق كامل من الأغشية غير المسقوفة بسرعة ، على عكس PCF حيث لا يمكن الحصول على بقع إلا واحدة في كل مرة. في تجاربنا ، كانت البيانات من الأغشية غير المسقوفة وتجارب PCF متشابهة ولكنها ليست متكافئة (الشكل 6)11. ومع ذلك ، لا يوجد سبب مسبق يجعل هذا يجب أن يكون ملاحظة عالمية لأن البروتينات في ماصة التصحيح قد تكون في حالة وظيفية مختلفة عن تلك الموجودة في الأغشية غير المسقوفة.
هنا ، بذلت محاولات لزيادة التعبير عن بنياتنا الموسومة ANAP ، ولا سيما خفض درجة حرارة ثقافة الخلية إلى 33 درجة مئوية10،11،16. في تجربتنا ، فإن محاولة تحديد المواقع في البروتين التي سيكون فيها ANAP بديلا محافظا لم تسفر باستمرار عن تركيبات يتم التعبير عنها بشكل جيد. لقد حققنا نجاحا أكبر في المسح المنهجي لمناطق البروتين بأكملها لمواقع دمج ANAP وفحص المرشحين للتعبير السطحي10. يعمل نظام وضع العلامات ANAP أيضا في بويضات Xenopus laevis ، مما يسمح باستئصال بقع غشائية أكبر بكثير ، وبالتالي زيادة الإشارة إلى الضوضاء26،27،28.
في حين أنه من المتوقع أن تؤدي مستويات التعبير الأكبر إلى إشارات أكثر إشراقا ، فإن الحد الأدنى لعدد القنوات المطلوبة لقياس التألق يعتمد على عدة عوامل ، بما في ذلك سطوع الفلوروفور ، ودرجة التبييض الضوئي ، وشدة ضوء الإثارة ، ومستوى التركيز. من الناحية النظرية ، يمكن إجراء تقديرات من خلال ربط شدة التألق وتيار القناة كما هو موضح سابقا28,29. ومع ذلك ، فإن موثوقية هذه التقديرات تتطلب بعض المعرفة بالتوصيل أحادي القناة والاحتمال المفتوح للقناة. بالإضافة إلى العوامل المذكورة أعلاه ، ستتأثر إشارة التألق أيضا بالقنوات المرتبطة بالحويصلات أو أقسام غشاء البلازما الملتصقة بزجاج الماصة التي لا تخضع لمشبك الجهد.
يتم تكييف هذه الطريقة بسهولة لدراسة القنوات الأيونية الأخرى الحساسة للنيوكليوتيدات. يشبه CFTR هيكليا الوحدة الفرعية لمستقبلات السلفونيل يوريا الملحقة ل KATP30,31. مثلK ATP CFTR يتم التحكم في البوابة عن طريق ربط النوكليوتيدات ، مما يجعلها هدفا مستقبليا واضحا لطريقتنا7. مستقبلات P2X Purinergic هي قنوات أيونية مسورة بواسطة ATP9 خارج الخلية. يعمل TNP-ATP كمضاد لمستقبلات P2X32,33. لذلك ، لن يكون مفيدا لدراسة تنشيط P2X ، على الرغم من أنه يمكن استخدامه في مقايسات المنافسة مع منبهات P2X. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مشتقات ATP الفلورية الأخرى ذات التداخل الطيفي الكافي مع انبعاث ANAP لدراسة التنشيط. Alexa-647-ATP هو ناهض فلوري P2X34. R0 المحسوب بين Alexa-647 و ANAP هو ~ 85 Å ، مما يعني أن الارتباط المباشر ب P2X يجب أن يؤدي إلى تبريد كبير ل ANAP المدمج في القناة. ومع ذلك ، فإن مثل هذا R0 الطويل سيؤدي أيضا إلى التبريد من Alexa-647-ATP المرتبط بالوحدات الفرعية المجاورة ويزيد من احتمال أن يؤدي ارتباط النوكليوتيدات غير المحدد إلى FRET. نظرا لأن موقع ربط الرباط في مستقبلات P2X خارج الخلية ، إجراء قياسات الربط على الخلايا السليمة ، أو في مشبك جهد الخلية بالكامل ، أو في بقع الغشاء الخارجي. يمكن أيضا توسيع طريقتنا لدراسة ربط وتنشيط الناقلات والمضخات الكهروجينية وغير الكهروجينية التي تعتمد على ATP لدورة تفاعلها بالإضافة إلى مستقبلات P2Y المقترنة بالبروتين G. أخيرا ، على الرغم من أننا طورنا هذه الطريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين (TNP-ATP ، TNP-ADP ، TNP-AMP) ، يمكن استخدام نفس النهج لدراسة الارتباط بأي مستقبل تقريبا تم تحديد ليجند فلوري مناسب له.

يتم تنظيم عدة فئات مهمة من البروتين مباشرة عن طريق ربط الرباط. تتراوح هذه من الإنزيمات القابلة للذوبان إلى البروتينات المضمنة في الغشاء بما في ذلك مستقبلات التيروزين كينازات والمستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCRs) والقنوات الأيونية. تمثل GPCRs والقنوات ~ 34٪ و ~ 15٪ من جميع أهداف الأدوية الحالية ،على التوالي 1,2. لذلك ، هناك اهتمام كيميائي حيوي كبير ، بالإضافة إلى اهتمام طبي بتطوير الأساليب التي توفر رؤى ميكانيكية في تفاعلات مستقبلات الرباط. تتطلب الطرق التقليدية لقياس ارتباط الربيطة ، بما في ذلك وضع العلامات على التقارب الضوئي ودراسات ربط الليجند الإشعاعي ، كميات كبيرة من البروتين المنقى جزئيا ويتم إجراؤها عادة في ظل ظروف غير فسيولوجية ومقاييس زمنية. تتطلب الطريقة المثالية كميات صغيرة فقط من البروتين ، ويمكن إجراؤها على بروتينات سليمة يتم التعبير عنها في بيئة خلوية أو غشائية ، ويمكن مراقبتها في الوقت الفعلي ، وستكون متوافقة مع القراءات المباشرة لوظيفة البروتين.
نقل طاقة الرنين Förster (FRET) هي طريقة تكتشف القرب بين جزيئين موسومين بالفلورسنت3. يحدث الحنق عندما ينقل فلوروفور متبرع متحمس الطاقة بطريقة غير إشعاعية إلى جزيء متقبل (عادة فلوروفور آخر). يؤدي نقل الطاقة إلى إخماد انبعاث مضان المتبرع وتوعية انبعاث المستقبل (إذا كان المستقبل عبارة عن فلوروفور). تعتمد كفاءة النقلعلى قوة 6 للمسافة بين المتبرع والمستقبل. علاوة على ذلك ، يجب أن يكون المتبرع والمتقبل على مقربة (عادة أقل من 10 نانومتر) حتى يحدث FRET. على هذا النحو ، يمكن استغلال FRET لقياس الارتباط المباشر بين مستقبلات البروتين الموسومة بالفلورسنت والرباط الفلوري.
يتم تنظيم أو تنشيط العديد من البروتينات المختلفة عن طريق ربط نيوكليوتيدات الأدينين داخل الخلايا أو خارج الخلية (ATP ، ADP ، AMP ، cAMP). تتطلب العديد من بروتينات النقل التحلل المائي ATP لدورة تفاعلها ، بما في ذلك ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP و ATPases من النوع P مثل مضخة Na + / K + 4,5 . قنوات K + (K ATP) الحساسة لATP ، ومنظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) ، والقنوات المنظمة للنيوكليوتيدات الحلقية كلها قنوات أيونية مسورة بربط نيوكليوتيدات الأدينين داخل الخلايا ، مما يجعلها حساسة بشكل رائع للتغيرات في التمثيل الغذائي الخلوي ونقل الإشارة6،7،8. تستجيب مستقبلات P2X و P2Y Purinergic للتغيرات في ATP خارج الخلية ، والتي يمكن إطلاقها كناقل عصبي أو نتيجة لتلف الأنسجة9. لقد طورنا مقايسة قائمة على FRET لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين ببروتينات الغشاء في الوقت الفعلي. لقد طبقنا هذه الطريقة سابقا لدراسة ارتباط النوكليوتيدات بقنوات KATP 10,11.
لقياس ارتباط النوكليوتيدات عبر FRET ، يجب أولا تمييز البروتين محل الاهتمام بالفلوروفور. يجب إدخال علامة الفلورسنت في الموقع على وجه التحديد في البروتين محل الاهتمام بحيث يكون قريبا بدرجة كافية من موقع ربط الليجند لحدوث FRET ، مع توخي الحذر بشكل خاص لضمان عدم تأثير العلامة على الهيكل العام للبروتين ووظيفته. لتحقيق ذلك ، نستخدم تقنية طورها Chatterjee et al. ، باستخدام قمع كودون إيقاف الكهرمان لإدخال حمض أميني فلوري غير قانوني (l-3- (6-acetylnaphthalen-2-ylamino) -2-aminopropionic; ANAP) في الموقع المطلوب12. نقيس ارتباط النوكليوتيدات على أنه FRET بين البروتين المسمى ANAP ومشتقات النوكليوتيدات الفلورية ، ثلاثي نيتروفينيل (TNP) (الشكل 1 أ). يتداخل طيف الانبعاث ل ANAP مع طيف امتصاص نيوكليوتيدات TNP ، وهي حالة ضرورية لحدوث FRET (الشكل 1B). نوضح هنا نوعين مختلفين من تجارب الربط. في الأول ، يتم قياس ارتباط النوكليوتيدات بالجانب داخل الخلايا من قنوات KATP التي تحمل علامة ANAP في الخلايا التي تم تسقيفها عن طريق صوتنة تاركة شظايا ملتصقة من غشاء البلازما على انزلاق غطاء زجاجي10،11،13،14.
في الطريقة الثانية ، يتم قياس ارتباط النوكليوتيدات بقنوات KATP التي تحمل علامة ANAP في رقعة غشائية تحت مشبك الجهد ، مما يسمح بالقياس المتزامن للتيارات الأيونية والتألق. من خلال الجمع بين هذين النهجين التجريبيين ، يمكن ربط التغييرات في الربط ارتباطا مباشرا بالتغيرات في وظيفة القناة11. تتم مناقشة النتائج النموذجية والمزالق المحتملة وتحليل البيانات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

لقد طورنا طريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين بمستقبلات غشائية سليمة ووظيفية في بيئة خلوية أو غشائية. تجمع هذه الطريقة بين التعبير عن البروتينات الموسومة بالحمض الأميني الفلوري غير المتعارف عليه ANAP ، والحنق بين مشتقات النوكليوتيدات ANAP والفلورية (ثلاثي النيتروفينيل). نقدم أمثلة على ارتباط النوكليوتيدات بقنوات أيون KATP الموسومة ب ANAP المقاسة في أغشية البلازما غير المسقوفة وبقع الغشاء المستأصلة من الداخل إلى الخارج تحت مشبك الجهد. هذا الأخير يسمح بالقياسات المتزامنة لربط الليجند وتيار القناة ، وهي قراءة مباشرة لوظيفة البروتين. تتم مناقشة معالجة البيانات وتحليلها على نطاق واسع ، إلى جانب المزالق والمصنوعات اليدوية المحتملة. توفر هذه الطريقة رؤى ميكانيكية غنية حول البوابة المعتمدة على الرباط لقنوات KATP ويمكن تكييفها بسهولة لدراسة البروتينات الأخرى التي ينظمها النيوكليوتيدات أو أي مستقبل يمكن تحديد ليجند فلوري مناسب له.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

يقدم هذا البروتوكول طريقة لقياس ارتباط نيوكليوتيدات الأدينين بالمستقبلات في الوقت الفعلي في بيئة خلوية. يتم قياس الارتباط على أنه نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين مشتقات نيوكليوتيدات ثلاثي نيتروفينيل والبروتين المسمى بحمض أميني فلوري غير قانوني.

قياس ارتباط النوكليوتيدات ببروتينات الغشاء الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

وبما أن جزيء ATP رسول خلوي مهم، فقد طورنا طريقة تسمح لنا بقياس ارتباط جزيء ATP بمستقبلاته بدقة عالية. باستخدام FRET بين مشتقات النوكليوتيدات والبروتينات الموسومة بالفلورسنت ، يمكننا مراقبة ارتباط النوكليوتيدات بالمستقبلات الوظيفية السليمة في الوقت الفعلي وبدقة مكانية ممتازة. نستخدم هذه الطريقة لفهم آثار التمثيل الغذائي الخلوي على قناة البوتاسيوم الحساسة ATP ، والتي تشارك في أشكال معينة من مرض السكري.لإعداد تجربة غشاء غير مسقوف ، استخدم أولا زوجا من الملقط لكسر جزء صغير من زلة غطاء بخلايا منقولة وشطف الجزء باستخدام برنامج تلفزيوني. إذا كانت زلة الغطاء مغلفة مسبقا بالبولي ليسين ، فضع الجزء في قاع طبق 35 ملم يحتوي على ملليلتر من PBS وأمسك صوتي مسبار ثلاثة ملليمترات من ثلاثة إلى خمسة ملليمترات فوق العينة ، ينبض عند 50 واط وسعة 20 إلى 40٪ لمدة 200 إلى 500 مللي ثانية لفتح الخلايا. إذا لم تكن زلات الغطاء مغلفة مسبقا ، بعد الشطف باستخدام PBS ، اغمس الجزء في أنبوب يحتوي على 0.1٪ poly-L-lysine لمدة 30 ثانية تقريبا قبل فتح الخلايا بصوتنة قصيرة كما هو موضح.نقل جزء صوتنة إلى الزجاج المغطى أسفل 35 ملم طبق يحتوي على ملليلتر من محلول حمام وتركيب الطبق على المجهر المقلوب مجهزة بفتحة عددية عالية 60x هدف الغمر في الماء. تأكد من أن منفذ الكاميرا الخاص بالمجهر متصل بمطياف في سلسلة بكاميرا CCD عالية الحساسية واستخدم مضخة تمعجية لتغذية غرفة الحمام بمخزن مؤقت بمعدل تدفق يتراوح من 0.5 إلى ملليلتر واحد من المخزن المؤقت في الدقيقة. لتحديد شظايا الغشاء غير المسقوفة التي تعبر عن القناة المصنفة ANAP ، اعرض العينة لتحديد موقع الأغشية ذات القنوات الفلورية.قم بإشراك قناع مقياس الطيف جزئيا بين منفذ الكاميرا على المجهر والمطياف. سيظهر ظل القناع على صورة الكاميرا. الحصول على حقل مشرق وصورة مضان للغشاء غير المسقوف للسماح باختيار المنطقة محل الاهتمام للتحليل.اجعل طرف نظام التروية microvolume قريبا من الغشاء غير المسقوف. للحصول على صورة لمضان ANAP ، قم بإثارة الغشاء باستخدام مصباح LED 385 نانومتر من خلال مرشح إثارة تمرير نطاق 390/18 نانومتر وحافة ثنائية اللون 416 نانومتر ، وجمع الضوء المنبعث من خلال مرشح انبعاث طويل 400 نانومتر. قم بإشراك قناع مقياس الطيف وتأكد من مرور الضوء المنبعث.قم بمحاذاة المنطقة محل الاهتمام مع شق قناع مقياس الطيف. إشراك حواجز شبكية الطيف. مع وجود حواجز شبكية في مكانها ، سيتم إسقاط الضوء المنحرف بواسطة مقياس الطيف على شريحة كاميرا CCD لإنتاج صور طيفية.ستحتفظ الصور بالمعلومات المكانية في البعد Y. سيتم استبدال البعد X بالطول الموجي. أثناء الترشيح باستخدام محلول عازل خال من النوكليوتيدات ، احصل على واحد أو أكثر من التعرض من 0.1 إلى 10 ثوان لتصحيح المصب وتطبيع البيانات التي تم جمعها خلال بقية التجربة.بعد ذلك ، قم بتطبيق مجموعة من تركيزات TNP ATP في محلول الاستحمام لإنشاء منحنى استجابة التركيز ، مع تعطير كل محلول لمدة دقيقة واحدة على الأقل لضمان الوصول إلى حالة مستقرة والحصول على تعرض لكل تركيز. بعد كل تركيز ، اغسل TNP ATP بمحلول حمام خال من النوكليوتيدات لمدة دقيقة واحدة على الأقل قبل الحصول على صورة التعرض بعد العلاج. لإجراء تجربة قياس الفلور بمشبك رقعة ، قم أولا بسحب ماصات التصحيح من الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات ذات الجدران السميكة إلى مقاومة من 1.5 إلى 2.5 ميجاأوم عند ملئها بمحلول ماصة.بعد ذلك ، قم بنقل زلة غطاء مع خلايا منقولة إلى طبق زجاجي 35 ملم يحتوي على ملليلتر من محلول الاستحمام وقم بتركيب الطبق على المجهر المقلوب. قم بتهوية غرفة الاستحمام بمحلول الاستحمام وحدد خلية تعبر عن القنوات المصنفة ANAP. ضع ضغطا إيجابيا لطيفا على ماصة التصحيح وضع الماصة في حجرة الاستحمام.اضغط على الماصة على غشاء الخلية وقم بتطبيق شفط لطيف لتحقيق ختم جيجاأوم. لاستئصال الرقعة ، حرك حامل الماصة بسرعة بعيدا عن الخلية المرقعة. اجعل طرف ماصة الرقعة بالقرب من طرف نظام التروية ، وتحقق من أن الرقعة داخل شق قناع مقياس الطيف.ثم قم بتطبيق TNP ATP وجمع أطياف الصور. في هذه الصور ، يمكن ملاحظة جزء غشاء نموذجي غير مسقوف من خلية HEK293T يعبر عن قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP الموسومة ببروتين الفلورسنت البرتقالي. في هذه الصورة الطيفية لقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ANAP الموسومة ATP في غشاء غير مسقوف من خلية HEK293T معرضة لخمسة ميكرومولار TNP ATP ، يمكن ملاحظة منطقتين من الكثافة العالية التي تتوافق مع ذروة انبعاث ANAP و TNP ATP.يمكن الحصول على طيف نهائي عن طريق طرح متوسط طيف الخلفية من متوسط طيف منطقة الاهتمام. هنا ، يمكن ملاحظة الانخفاض في ذروة مضان ANAP بعد التعرض المتعدد. تم تركيب ذروة التألق من عدة تعرضات في غياب TNP ATP على اضمحلال أسي واحد.ثم تم استخدام هذه البيانات لتصحيح القطع الأثرية للتبييض الضوئي. هنا ، يتم عرض صور طيفية تمثيلية من غشاء غير مسقوف تم الحصول عليه من خلية تعبر عن ANAP الموسومة بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP في غياب ووجود TNP ATP. تكشف مراقبة أطياف الانبعاثات المصححة عن فصل واضح بين انبعاث الفلورسنت المانح والمتلقي.في هذا الشكل ، يتم عرض التيارات والأطياف التمثيلية من ANAP الموسومة بقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP من تجربة قياس فلوري نموذجية بمشبك رقعة. يتم تصحيح أطياف الانبعاث للخلفية والتبييض كما هو موضح للأغشية غير المسقوفة. توخ الحذر من عناصر التحكم للتحقق من أن إشارة الفلورسنت خاصة بالمستقبل.تأكد من أن وفرة الخاصة بك سريعة وفعالة وكاملة والحفاظ على التعرض الخاص بك قصيرة قدر الإمكان. تجيب هذه الطريقة على أسئلة حول إشغال المستقبلات وكيفية ارتباطها بالوظيفة. يمكن لتقنيات FRET الأخرى المستخدمة مع إعداد مماثل أن تسبر التغييرات التأكيدية التي يسببها الرباط في المستقبل.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

طريقة لتصور وتحليل غشاء متبادلة البروتينات التي نقل المجهر

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

قياس إشارة مستقبلات G- البروتينات عبر الملزمة غتب المسمى راديو

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

قياس الملامح الجزيئية البيولوجية DSC مع يغاندس ثيرمولابيلي لوصف سرعة قابلة للطي والربط التفاعلات

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

قياس الإلكترون غشاء البلازما عبر النقل بواسطة ميوتوبيس C2C12

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

رصد GPCR-β-arrestin1/2 التفاعلات في أنظمة المعيشة في الوقت الحقيقي لتسريع اكتشاف المخدرات

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...