Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

We willen Raul Terron Exposito bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door de Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/R002517/1; MCP en FMA) en de Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

<ol>
	<li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success.">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters.">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li><li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases:+excitement+continues.">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li><li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNG+and+HCN+channels:+two+peas,+one+pod.">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li><li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+coupling+between+CFTR's+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations.">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li><li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1:+A+Mechanistic+Model.">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li><li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors.">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li><li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K(+)+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding.">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103 (2019).</li><li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K++channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry.">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775 (2020).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane.">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+'cell+cortices'+for+light+and+electron+microscopy.">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li><li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase/tRNA+expression+and+engineered+eRF1.">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li><li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature.">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).</li><li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions.">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li><li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding,+gating,+affinity+and+efficacy:+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors.">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry.">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels.">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).</li><li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels.">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels.">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry.">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K(+)+channels.">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li><li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization.">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance.">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li><li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction.">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li><li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels.">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li><li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel.">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).</li><li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1,+P2X3,+and+heteromeric+P2X2/3+receptors.">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li><li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization.">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li></ol>

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

We hebben een methode ontwikkeld om adeninenucleotidebinding in real time te meten aan intacte membraaneiwitten. Onze methode bouwt voort op verschillende andere gevestigde technieken, waaronder het labelen van eiwitten met ANAP met behulp van amber stop codononderdrukking 12, celontsluiting 14 en spanningsklemfluorometrie / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . De synthese van deze benaderingen maakt het mogelijk om nucleotidebinding met hoge ruimtelijke en temporele resolutie te meten. Inderdaad, in ons vorige werk waren we in staat om onderscheid te maken tussen verschillende bindingsplaatsen op hetzelfde eiwitcomplex met behulp van deze benadering10,11. Belangrijk is dat deze techniek direct kan worden toegepast op kleine hoeveelheden eiwit in een cellulaire omgeving onder omstandigheden die de eiwitfunctie behouden. Door onze bindingsmethode te gebruiken in combinatie met directe, elektrofysiologische uitlezing van ionkanaalstromen kunnen we rijke inzichten verkrijgen in de moleculaire onderbouwing van channel gating11.
Omdat spectrometers een niet-standaard laboratoriumapparaat zijn, kan de ANAP-intensiteit ook in relatieve isolatie worden bewaakt met behulp van banddoorlaatfilters. Figuur 5B toont de spectrale eigenschappen van twee van dergelijke filters. Het 470/10 nm band-pass filter schermt effectief het fluorescentiesignaal van TNP-ATP af en overlapt goed met de piek ANAP-fluorescentie. De piektransmissie van dit filter is echter slechts ongeveer 50%, wat het moeilijk kan maken om goede signalen te verkrijgen van dimmembranen (of in weggesneden membraanvlekken onder spanningsklem). Een andere optie is een 460/60 nm band-pass filter. Er is iets meer overlap tussen het 460/60 nm filter en de voet van de TNP-ATP emissiepiek in vergelijking met het 470/10 nm filter. De 460/60 nm-bandpas heeft echter een transmissie van 90-95% over een breed bereik van de ANAP-piek, waarvan zou worden verwacht dat het het fluorescentie-emissiesignaal zal versterken.
ANAP is een milieugevoelige fluorofoor 12,26,27. De piekemissie en kwantumopbrengst variëren afhankelijk van de plaats van opname op het eiwit van belang en kunnen veranderen als het eiwit van conformatie verandert. Dergelijke veranderingen zouden onmiddellijk duidelijk zijn uit emissiespectra, maar zouden niet zo duidelijk zijn wanneer de ANAP-intensiteit wordt gemeten met behulp van filters. In ieder geval zijn passende controles vereist om aan te tonen dat het fluorescentiesignaal niet varieert als gevolg van veranderingen in de lokale omgeving rond ANAP na de nucleotidebinding. Controle-experimenten met niet-gelabelde nucleotiden kunnen helpen verifiëren dat eventuele veranderingen in ANAP-intensiteit het gevolg zijn van FRET tussen ANAP- en TNP-nucleotiden. TNP-nucleotiden kunnen niet-specifiek binden aan de membranen afkomstig van niet-getransfecteerde cellen (hetzij aan het plasmamembraan of aan inheemse membraaneiwitten)10. We kwantificeren binding als een afname in de donorfluorescentie, omdat dit signaal specifiek is voor het gelabelde kanaal. We raden echter aan om aanvullende controle-experimenten uit te voeren voor elk agonist/receptorpaar, bijvoorbeeld het muteren van de nucleotidebindingsplaats indien bekend, om te verifiëren dat de verandering in donorfluorescentie echt het resultaat is van directe binding aan de gelabelde receptor11. Ten slotte wordt aanbevolen om te werken met constructies die naast het ANAP-label ook een fluorescerend eiwitlabel bevatten. Dit helpt om gelabelde receptorfluorescentie te onderscheiden van achtergrond / autofluorescentie. Achtergrondfluorescentie kan van ANAP worden onderscheiden door de piek en vorm van emissiespectra10, maar dergelijke bepalingen kunnen erg moeilijk zijn wanneer alleen filtersets worden gebruikt. Bovendien kunnen cellen en niet-gedekte membranen die fluorescerende receptoren tot expressie brengen, worden geïdentificeerd met behulp van de fluorescerende eiwittag zonder ANAP te hoeven prikkelen en overmatig fotobleken te riskeren.
In veel van onze PCF-records zagen we een sterke negatieve piek in onze spectra bij hoge TNP-ATP-concentraties (figuur 4C). Deze negatieve piek is een artefact van ons achtergrondaftrekkingsprotocol. Figuur 4D toont heldere veld- en fluorescerende beelden van een patchpipet blootgesteld aan 1 mM TNP-ATP. Een schaduw aan de pipetpunt is duidelijk als gevolg van de uitsluiting van TNP-ATP van het volume van de pipetwanden, wat het duidelijkst zichtbaar is binnen het scherpstelvlak. De spectrale afbeelding in figuur 4E toont een donkere band, die overeenkomt met deze schaduw. Wanneer een gebied boven of onder deze donkere band wordt gebruikt voor achtergrondaftrek, produceert dit een negatieve piek. Belangrijk is dat deze piek plaatsvond over een golflengtebereik dat overeenkomt met TNP-ATP-emissie en geen invloed had op onze metingen van ANAP-blussing.
De belangrijkste beperking van onze experimenten was het verkrijgen van adequate plasmamembraanexpressie van ANAP-gelabelde constructies om fluorescentie te meten. Het was over het algemeen gemakkelijker om spectra van hoge kwaliteit te verkrijgen van niet-overdekte membranen dan in PCF, vanwege hun grotere formaat en ons vermogen om snel een hele schaal met niet-overdekte membranen te scannen, in tegenstelling tot PCF waar patches slechts één voor één kunnen worden verkregen. In onze experimenten waren de gegevens van niet-overdekte membranen en PCF-experimenten vergelijkbaar, maar niet gelijkwaardig (figuur 6)11. Er is echter geen a priori reden waarom dit een universele waarneming zou moeten zijn, aangezien eiwitten in een patchpipet zich in een andere functionele toestand kunnen bevinden dan die in niet-overdekte membranen.
Hier zijn pogingen gedaan om de expressie van onze ANAP-gelabelde constructies te maximaliseren, met name het verlagen van de celkweektemperatuur tot 33 °C10,11,16. In onze ervaring resulteerde het proberen te identificeren van plaatsen in het eiwit waar ANAP een conservatieve substitutie zou zijn, niet consequent in constructies die goed tot expressie kwamen. We hadden meer succes met het systematisch scannen van hele eiwitgebieden voor ANAP-opnameplaatsen en het screenen van kandidaten op oppervlakte-expressie10. Het ANAP-etiketteringssysteem werkt ook in Xenopus laevis-eicellen, waardoor veel grotere membraanpleisters kunnen worden weggesneden, waardoor het signaal naar ruis 26,27,28 toeneemt.
Terwijl grotere expressieniveaus naar verwachting zullen resulteren in helderdere signalen, hangt het minimale aantal kanalen dat nodig is om fluorescentie te meten af van verschillende factoren, waaronder de helderheid van de fluorofoor, de mate van fotobleaching, de intensiteit van het excitatielicht en het focusvlak. In theorie kunnen schattingen worden gemaakt door de fluorescentie-intensiteit en de kanaalstroom te correleren, zoals eerder is aangetoond28,29. De betrouwbaarheid van dergelijke schattingen vereist echter enige kennis van de eenkanaalsgeleiding en de open waarschijnlijkheid van het kanaal. Naast de hierboven genoemde factoren zal het fluorescentiesignaal ook worden beïnvloed door kanalen die verband houden met blaasjes of delen van het plasmamembraan die aan het pipetglas zijn geplakt en die niet onder spanningsklem staan.
Deze methode is gemakkelijk aan te passen aan de studie van andere nucleotidegevoelige ionkanalen. CFTR is structureel vergelijkbaar met de accessoire sulfonylureumreceptorsubeenheid van KATP30,31. Net als KATP CFTR wordt gating gecontroleerd door nucleotidebinding, waardoor het een voor de hand liggend toekomstig doelwit is van onze methode7. Purinerge P2X-receptoren zijn ionkanalen die worden afgesloten door extracellulaire ATP9. TNP-ATP werkt als een antagonist voor P2X-receptoren32,33. Daarom zal het niet nuttig zijn voor het bestuderen van P2X-activering, hoewel het kan worden gebruikt in competitietests met P2X-agonisten. Als alternatief kunnen andere fluorescerende ATP-derivaten met voldoende spectrale overlap met ANAP-emissie worden gebruikt om activering te bestuderen. Alexa-647-ATP is een fluorescerende P2X-agonist34. De berekende R0 tussen Alexa-647 en ANAP is ~85 Å, wat betekent dat directe binding aan P2X zou moeten resulteren in een aanzienlijke uitdoven van ANAP die in het kanaal is opgenomen. Zo'n lange R0 zal echter ook resulteren in het uitdoven van Alexa-647-ATP gebonden aan naburige subeenheden en verhoogt de kans dat niet-specifieke nucleotidebinding zal resulteren in FRET. Omdat de ligandbindingsplaats in P2X-receptoren extracellulair is, zouden bindingsmetingen worden uitgevoerd op intacte cellen, in spanningsklemmen van de hele cel of in buitenste membraanpleisters. Onze methode kan ook worden uitgebreid met het bestuderen van binding en activering van elektrogene en niet-elektrogene transporters en pompen die afhankelijk zijn van ATP voor hun reactiecyclus, evenals G-eiwit gekoppelde P2Y-receptoren. Ten slotte, hoewel we deze methode hebben ontwikkeld om adenine-nucleotidebinding (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP) te meten, kan dezelfde benadering worden gebruikt om binding te bestuderen aan vrijwel elke receptor waarvoor een geschikte, fluorescerende ligand is geïdentificeerd.

Verschillende belangrijke eiwitklassen worden direct gereguleerd door ligandbinding. Deze variëren van oplosbare enzymen tot membraan-ingebedde eiwitten, waaronder receptor tyrosinekinasen, G-eiwitgekoppelde receptoren (GPCR's) en ionkanalen. GPCR's en kanalen zijn goed voor ~34% en ~15% van alle huidige medicijndoelen, respectievelijk 1,2. Daarom is er een aanzienlijke biochemische, evenals medische interesse in het ontwikkelen van methoden die mechanistische inzichten bieden in ligand-receptorinteracties. Traditionele methoden voor het meten van ligandbinding, waaronder fotoaffiniteitsetikettering en radioligandbindingsstudies, vereisen grote hoeveelheden gedeeltelijk gezuiverd eiwit en worden meestal uitgevoerd onder niet-fysiologische omstandigheden en tijdschalen. Een ideale methode zou slechts kleine hoeveelheden eiwit vereisen, zou kunnen worden uitgevoerd op intacte eiwitten die tot expressie komen in een cellulaire of membraanomgeving, zou in realtime kunnen worden gecontroleerd en zou compatibel zijn met directe uitlezingen van de eiwitfunctie.
Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een methode die de nabijheid tussen twee fluorescerend gelabelde moleculen detecteert3. FRET treedt op wanneer een geëxciteerde donorfluorofoor energie op een niet-stralingsmanier overdraagt aan een acceptormolecuul (meestal een andere fluorofoor). Energieoverdracht resulteert in het blussen van de donorfluorescentie-emissie en sensibilisatie van de acceptoremissie (als de acceptor een fluorofoor is). De overdrachtsefficiëntie is afhankelijk van de6e macht van de afstand tussen de donor en de acceptor. Bovendien moeten de donor en acceptor in de buurt zijn (meestal minder dan 10 nm) om FRET te laten optreden. Als zodanig kan FRET worden gebruikt om de directe binding tussen een fluorescerend gelabelde eiwitreceptor en een fluorescerend ligand te meten.
Verschillende eiwitten worden gereguleerd of geactiveerd door intracellulaire of extracellulaire adeninenucleotiden (ATP, ADP, AMP, cAMP) te binden. Veel transporteiwitten hebben ATP-hydrolyse nodig voor hun reactiecyclus, waaronder ATP-bindende cassettetransporters en P-type ATPases zoals de Na+/K+ pomp 4,5. ATP-gevoelige K + (KATP) kanalen, de cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) en cyclisch-nucleotide gereguleerde kanalen zijn allemaal ionkanalen die worden afgesloten door de binding van intracellulaire adenine nucleotiden, waardoor ze buitengewoon gevoelig zijn voor veranderingen in cellulair metabolisme en signaaltransductie 6,7,8 . Purinerge P2X- en P2Y-receptoren reageren op veranderingen in extracellulaire ATP, die kunnen worden vrijgegeven als een neurotransmitter of als gevolg van weefselbeschadiging9. We hebben een FRET-gebaseerde assay ontwikkeld voor het meten van adenine nucleotide binding aan membraaneiwitten in real time. We hebben deze methode eerder toegepast om nucleotidebinding aan KATP-kanalen 10,11 te bestuderen.
Om de nucleotidebinding via FRET te meten, moet een interessant eiwit eerst worden gelabeld met een fluorofoor. Het fluorescerende label moet plaatsspecifiek in het eiwit van belang worden ingebracht, zodat het dicht genoeg bij de ligandbindingsplaats ligt om FRET te laten optreden, met speciale aandacht om ervoor te zorgen dat het label de algehele structuur en functie van het eiwit niet beïnvloedt. Om dit te bereiken, gebruiken we een techniek ontwikkeld door Chatterjee et al., met behulp van amber stop-codon onderdrukking om een fluorescerend niet-canoniek aminozuur (l-3-(6-acetylnaftaleen-2-ylamino)-2-aminopropionisch in te voegen; ANAP) op de gewenste locatie12. We meten nucleotidebinding als FRET tussen ANAP-gelabeld eiwit en fluorescerende, trinitrofenyl (TNP) nucleotidederivaten (figuur 1A). Het emissiespectrum voor ANAP overlapt met het absorptiespectrum van TNP-nucleotiden, een voorwaarde die nodig is om FRET te laten optreden (figuur 1B). Hier schetsen we twee verschillende soorten bindingsexperimenten. In de eerste wordt nucleotidebinding aan de intracellulaire kant van ANAP-gelabelde KATP-kanalen gemeten in cellen die zijn losgemaakt door ultrasoonapparaat, waardoor aanhangende fragmenten van plasmamembraan op een glazen afdekplaat10,11,13,14 achterblijven.
In de tweede methode wordt nucleotidebinding aan ANAP-gelabelde KATP-kanalen gemeten in een membraanpleister onder spanningsklem, waardoor gelijktijdige meting van ionische stromen en fluorescentie mogelijk is. Door deze twee experimentele benaderingen te combineren, kunnen veranderingen in binding direct worden gecorreleerd met veranderingen in kanaalfunctie11. Typische resultaten, mogelijke valkuilen en data-analyse worden besproken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

We hebben een methode ontwikkeld om de binding van adenine-nucleotiden aan intacte, functionele transmembraanreceptoren in een cellulaire of membraanomgeving te meten. Deze methode combineert expressie van eiwitten gelabeld met het fluorescerende niet-canonieke aminozuur ANAP, en FRET tussen ANAP en fluorescerende (trinitrofenyl) nucleotidedederivaten. We presenteren voorbeelden van nucleotidebinding aan ANAP-gelabelde KATP-ionkanalen gemeten in niet-overdekte plasmamembranen en weggesneden, binnenstebuiten gekeerde membraanpleisters onder spanningsklem. Dit laatste maakt gelijktijdige metingen van ligandbinding en kanaalstroom mogelijk, een directe uitlezing van de eiwitfunctie. Databehandeling en -analyse komen uitgebreid aan bod, samen met mogelijke valkuilen en artefacten. Deze methode biedt rijke mechanistische inzichten in de ligand-afhankelijke gating van KATP-kanalen en kan gemakkelijk worden aangepast aan de studie van andere nucleotide-gereguleerde eiwitten of elke receptor waarvoor een geschikt fluorescerend ligand kan worden geïdentificeerd.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Dit protocol presenteert een methode voor het meten van adenine nucleotide binding aan receptoren in real time in een cellulaire omgeving. Binding wordt gemeten als Förster resonantie energieoverdracht (FRET) tussen trinitrofenylnucleotidederivaten en eiwit gelabeld met een niet-canoniek, fluorescerend aminozuur.

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Omdat ATP een belangrijke cellulaire boodschapper is, hebben we een methode ontwikkeld waarmee we ATP-binding aan zijn receptoren met hoge precisie kunnen meten. Met behulp van FRET tussen nucleotidederivaten en fluorescerend gelabelde eiwitten, kunnen we de nucleotidebinding aan intacte functionele receptoren in realtime en met een uitstekende ruimtelijke resolutie volgen. We gebruiken deze methode om de effecten van cellulair metabolisme op het ATP-gevoelige kaliumkanaal te begrijpen, dat betrokken is bij bepaalde vormen van diabetes.Om een niet-gedekt membraanexperiment op te zetten, gebruikt u eerst een tang om een klein fragment van een afdekslip met getransfecteerde cellen te breken en het fragment af te spoelen met PBS. Als de afdeklaag is voorgecoat met polylysine, plaatst u het fragment op de bodem van een schaal van 35 millimeter met twee milliliter PBS en houdt u een sondesonator van drie millimeter drie tot vijf millimeter boven het monster, pulserend met 50 watt en 20 tot 40% amplitude gedurende 200 tot 500 milliseconden om de cellen los te maken. Als de afdekslip niet is voorgecoat, dompelt u het fragment na het spoelen met PBS gedurende ongeveer 30 seconden in een buis met 0,1% poly-L-lysine voordat u de cellen losmaakt met korte ultrasoonapparaat, zoals gedemonstreerd.Breng het gesonificeerde fragment over in een overdekte glazen bodem van 35 millimeter schaal met twee milliliter badoplossing en monteer de schaal op een omgekeerde microscoop uitgerust met een hoog numeriek diafragma 60x wateronderdompelingsobjectief. Controleer of de camerapoort van de microscoop is aangesloten op een spectrograaf in serie met een zeer gevoelige CCD-camera en gebruik een peristaltische pomp om de badkamer met buffer te doordrenken met een stroomsnelheid van 0,5 tot één milliliter buffer per minuut. Om niet-gedekte membraanfragmenten te identificeren die het ANAP-gelabelde kanaal tot expressie brengen, bekijkt u het monster om membranen met fluorescerende kanalen te lokaliseren.Schakel het spectrometermasker gedeeltelijk in tussen de camerapoort op de microscoop en de spectrograaf. De schaduw van het masker verschijnt op het camerabeeld. Verkrijg een helder veld- en fluorescentiebeeld van het niet-overdekte membraan om selectie van het gebied van belang voor analyse mogelijk te maken.Breng de punt van het microvolumeperfusiesysteem dicht bij het niet-overdekte membraan. Om een beeld van ANAP-fluorescentie te verkrijgen, prikkelt u het membraan met een 385 nanometer LED door een 390/18 nanometer band pass excitatiefilter en een 416 nanometer rand dichroic, waarbij het uitgezonden licht wordt verzameld door een 400 nanometer longpass emissiefilter. Schakel het spectrometermasker in en zorg ervoor dat het uitgestraalde licht wordt doorgelaten.Lijn het gebied van belang uit met de spleet van het spectrometermasker. Schakel de spectrometerroosters in. Met de roosters op hun plaats wordt het licht dat door de spectrometer wordt verspreid, op de chip van de CCD-camera geprojecteerd om spectrale beelden te produceren.De beelden behouden ruimtelijke informatie in de Y-dimensie. De X-dimensie wordt vervangen door golflengte. Verkrijg tijdens het perfuseren met een nucleotidevrije bufferoplossing een of meer blootstellingen van 0,1 tot tien seconden voor downstream-correctie en normalisatie van de gegevens die gedurende de rest van het experiment zijn verzameld.Breng vervolgens een reeks TNP ATP-concentraties in de badoplossing aan om een concentratieresponscurve vast te stellen, waarbij elke oplossing gedurende ten minste één minuut wordt doordrenkt om ervoor te zorgen dat een stabiele toestand wordt bereikt en een blootstelling voor elke concentratie wordt verkregen. Was na elke concentratie de TNP ATP gedurende ten minste één minuut uit met nucleotidevrije badoplossing voordat u een blootstellingsbeeld na de behandeling krijgt. Om een patch-clamp fluorometrie-experiment uit te voeren, trekt u eerst patchpipetten uit dikwandige borosilicaatglascapillairen tot een weerstand van 1,5 tot 2,5 megaohm wanneer ze worden gevuld met pipetoplossing.Breng vervolgens een afdekslip met getransfecteerde cellen over in een glazen bodemschaal van 35 millimeter met twee milliliter badoplossing en monteer de schaal op de omgekeerde microscoop. Perfuseer de badkamer met badoplossing en identificeer een cel die ANAP-gelabelde kanalen tot expressie brengt. Oefen zachte positieve druk uit op een patchpipet en plaats de pipet in een badkamer.Druk de pipet tegen het membraan van de cel en zuig zachtjes aan om een gigaohm-afdichting te bereiken. Om de pleister te verwijderen, verplaatst u de pipethouder snel uit de buurt van de gepatchte cel. Breng de punt van de patchpipet dicht bij de punt van het perfusiesysteem en controleer of de pleister zich in de spleet van het spectrometermasker bevindt.Pas vervolgens TNP ATP toe en verzamel beeldspectra. In deze afbeeldingen kan een typisch niet-geroofd membraanfragment van een HEK293T cel worden waargenomen dat ATP-gevoelige kaliumkanalen tot expressie brengt die zijn gelabeld met oranje fluorescerend eiwit. In deze spectrale afbeelding van ANAP-gelabelde ATP-gevoelige kaliumkanalen in een niet-geroofd membraan van een HEK293T cel blootgesteld aan vijf micromolaire TNP ATP, kunnen twee gebieden van hoge intensiteit worden waargenomen die overeenkomen met de piekemissie van ANAP en TNP ATP.Een laatste spectrum kan worden verkregen door het gemiddelde achtergrondspectrum af te trekken van het gemiddelde interessegebiedspectrum. Hier kan de vermindering van piek ANAP-fluorescentie na meerdere blootstellingen worden waargenomen. De piekfluorescentie van verschillende blootstellingen in afwezigheid van TNP ATP werd aangepast aan een enkel exponentieel verval.Deze gegevens werden vervolgens gebruikt om fotobleaching-artefacten te corrigeren. Hier worden representatieve spectrale beelden getoond van een niet-geroofd membraan verkregen uit een cel die ANAP-gelabelde ATP-gevoelige kaliumkanalen tot expressie brengt in afwezigheid en de aanwezigheid van TNP ATP. Het observeren van de gecorrigeerde emissiespectra onthult een duidelijke scheiding tussen de fluorescerende emissie van donor en acceptor.In deze figuur worden representatieve stromen en spectra getoond van ANAP-gelabelde ATP-gevoelige kaliumkanalen van een typisch patch-clamp fluorometrie-experiment. De emissiespectra worden gecorrigeerd voor achtergrond en bleken, zoals aangetoond voor niet-overdekte membranen. Wees voorzichtig met bedieningselementen om te controleren of het fluorescerende signaal specifiek is voor uw receptor.Zorg ervoor dat je overvloed snel, efficiënt en compleet is en houd je belichtingen zo kort mogelijk. Deze methode beantwoordt vragen over receptorbezetting en hoe deze zich verhoudt tot functie. Andere FRET-technieken die met een vergelijkbare opstelling worden gebruikt, kunnen ligand-geïnduceerde bevestigingsveranderingen in de receptor onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Gebruik Steiger Liposomen lipide-proximale eiwit-eiwit interacties reconstitueren<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Methode om te visualiseren en te analyseren Membrane interagerende eiwitten door Transmission Electron Microscopy

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoren van GPCR-β-arrestin1/2 interacties in real-time levende systemen om de geneesmiddelen ontdekking te versnellen

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...