Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Raul Terron Exposito für die hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom Forschungsrat für Biotechnologie und Biowissenschaften (BB/R002517/1; MCP und FMA) und dem Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Wir haben eine Methode entwickelt, um die Adenin-Nukleotid-Bindung an intakte Membranproteine in Echtzeit zu messen. Unsere Methode baut auf mehreren anderen etablierten Techniken auf, darunter die Markierung von Proteinen mit ANAP unter Verwendung von Amber-Stop-Codon-Suppression 12, Cell Unroofing 14 und Voltage-Clamp-Fluorometrie/PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Die Synthese dieser Ansätze ermöglicht die Messung der Nukleotidbindung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. Tatsächlich konnten wir in unserer früheren Arbeit mit diesem Ansatz zwischen verschiedenen Bindungsstellen auf demselben Proteinkomplex unterscheiden10,11. Wichtig ist, dass diese Technik direkt auf kleine Proteinmengen in einer zellulären Umgebung unter Bedingungen angewendet werden kann, die die Proteinfunktion erhalten. Die Verwendung unserer Bindungsmethode in Verbindung mit dem direkten, elektrophysiologischen Auslesen von Ionenkanalströmen ermöglicht es uns, reichhaltige Einblicke in die molekularen Grundlagen des Kanal-Gating11 zu erhalten.
Da es sich bei Spektrometern um ein nicht standardmäßiges Laborgerät handelt, kann die ANAP-Intensität auch relativ isoliert mit Bandpassfiltern überwacht werden. Abbildung 5B zeigt die spektralen Eigenschaften zweier solcher Filter. Der 470/10 nm Bandpassfilter schirmt das Fluoreszenzsignal von TNP-ATP effektiv ab und überlappt sich gut mit der ANAP-Spitzenfluoreszenz. Die maximale Durchlässigkeit dieses Filters beträgt jedoch nur etwa 50 %, was es schwierig machen kann, gute Signale von schwachen Membranen (oder in herausgeschnittenen Membranfeldern unter Spannungsklemme) zu erhalten. Eine weitere Option ist ein 460/60 nm Bandpassfilter. Es gibt etwas mehr Überlappung zwischen dem 460/60-nm-Filter und dem Fuß des TNP-ATP-Emissionspeaks im Vergleich zum 470/10-nm-Filter. Der 460/60-nm-Bandpass hat jedoch eine Transmission von 90-95% über einen weiten Bereich des ANAP-Peaks, was das Fluoreszenzemissionssignal verstärken würde.
ANAP ist ein umweltempfindlicher Fluorophor 12,26,27. Die Spitzenemission und die Quantenausbeute variieren je nach Einbaustelle auf dem interessierenden Protein und können sich ändern, wenn sich die Konformation des Proteins ändert. Solche Veränderungen wären aus den Emissionsspektren sofort ersichtlich, aber nicht so offensichtlich, wenn die ANAP-Intensität mit Filtern gemessen wird. In jedem Fall sind geeignete Kontrollen erforderlich, um nachzuweisen, dass das Fluoreszenzsignal nicht aufgrund von Veränderungen in der lokalen Umgebung von ANAP nach der Nukleotidbindung variiert. Kontrollexperimente mit unmarkierten Nukleotiden können helfen, zu überprüfen, ob Änderungen der ANAP-Intensität das Ergebnis von FRET zwischen ANAP- und TNP-Nukleotiden sind. TNP-Nukleotide können unspezifisch an die Membranen von nicht transfizierten Zellen binden (entweder an die Plasmamembran oder an native Membranproteine)10. Wir quantifizieren die Bindung als Dekrement in der Donorfluoreszenz, da dieses Signal spezifisch für den markierten Kanal ist. Wir empfehlen jedoch, für jedes Agonist/Rezeptor-Paar zusätzliche Kontrollexperimente durchzuführen, z. B. die Nukleotid-Bindungsstelle zu mutieren, falls bekannt, um zu überprüfen, ob die Änderung der Donorfluoreszenz wirklich das Ergebnis einer direkten Bindung an den markierten Rezeptor11 ist. Schließlich empfiehlt es sich, mit Konstrukten zu arbeiten, die neben der ANAP-Markierung auch einen fluoreszierenden Protein-Tag enthalten. Dies hilft bei der Unterscheidung zwischen markierter Rezeptorfluoreszenz und Hintergrund-/Autofluoreszenz. Die Hintergrundfluoreszenz kann durch den Peak und die Form der Emissionsspektren10 von ANAP unterschieden werden, aber solche Bestimmungen können sehr schwierig sein, wenn nur Filtersätze verwendet werden. Darüber hinaus können Zellen und unbedeckte Membranen, die fluoreszierende Rezeptoren exprimieren, mit dem fluoreszierenden Protein-Tag identifiziert werden, ohne ANAP anregen zu müssen und eine übermäßige Photobleichung zu riskieren.
In vielen unserer PCF-Aufzeichnungen beobachteten wir einen starken negativen Peak in unseren Spektren bei hohen TNP-ATP-Konzentrationen (Abbildung 4C). Dieser negative Peak ist ein Artefakt unseres Hintergrundsubtraktionsprotokolls. Abbildung 4D zeigt Hellfeld- und Fluoreszenzbilder einer Patch-Pipette, die mit 1 mM TNP-ATP belichtet wurde. An der Pipettenspitze ist ein Schatten zu erkennen, der sich aus dem Ausschluss von TNP-ATP aus dem Volumen der Pipettenwände ergibt, was innerhalb der Fokusebene am deutlichsten ist. Das Spektralbild in Abbildung 4E zeigt ein dunkles Band, das diesem Schatten entspricht. Wenn ein Bereich oberhalb oder unterhalb dieses dunklen Bandes für die Hintergrundsubtraktion verwendet wird, erzeugt dies eine negative Spitze. Wichtig ist, dass dieser Peak über einen Wellenlängenbereich auftrat, der der TNP-ATP-Emission entsprach und unsere Messungen der ANAP-Abschreckung nicht beeinflusste.
Die größte Einschränkung unserer Experimente bestand darin, eine adäquate Plasmamembranexpression von ANAP-markierten Konstrukten zur Messung der Fluoreszenz zu erhalten. Es war im Allgemeinen einfacher, qualitativ hochwertige Spektren von Membranen ohne Dach zu erhalten als mit PCF, da sie größer sind und wir in der Lage sind, schnell eine ganze Schüssel mit nicht überdachten Membranen zu scannen, im Gegensatz zu PCF, wo Patches nur einzeln erhalten werden können. In unseren Experimenten waren die Daten von Membranen ohne Dach und PCF-Experimenten ähnlich, aber nicht äquivalent (Abbildung 6)11. Es gibt jedoch keinen A-priori-Grund, warum dies eine universelle Beobachtung sein sollte, da Proteine in einer Patch-Pipette in einem anderen funktionellen Zustand sein können als solche in Membranen ohne Dach.
Hier wurde versucht, die Expression unserer ANAP-markierten Konstrukte zu maximieren, insbesondere die Zellkulturtemperatur auf 33 °C zu senken10,11,16. Unserer Erfahrung nach führte der Versuch, Stellen im Protein zu identifizieren, an denen ANAP eine konservative Substitution darstellen würde, nicht durchweg zu Konstrukten, die gut exprimiert wurden. Wir hatten mehr Erfolg damit, ganze Proteinregionen systematisch nach ANAP-Einbaustellen zu durchsuchen und Kandidaten auf Oberflächenexpression zu untersuchen10. Das ANAP-Markierungssystem funktioniert auch in Xenopus laevis-Oozyten, wodurch viel größere Membranflecken herausgeschnitten werden können, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis erhöhtwird 26,27,28.
Während erwartet wird, dass größere Expressionsniveaus zu helleren Signalen führen, hängt die minimale Anzahl von Kanälen, die zur Messung der Fluoreszenz erforderlich sind, von mehreren Faktoren ab, darunter die Helligkeit des Fluorophors, der Grad der Photobleichung, die Intensität des Anregungslichts und die Schärfeebene. Theoretisch könnten Schätzungen durch Korrelation der Fluoreszenzintensität und des Kanalstroms vorgenommen werden, wie bereits gezeigt wurde28,29. Die Zuverlässigkeit solcher Schätzungen erfordert jedoch eine gewisse Kenntnis des Einkanalleitwerts und der Offenheitswahrscheinlichkeit des Kanals. Zusätzlich zu den oben genannten Faktoren wird das Fluoreszenzsignal auch durch Kanäle beeinflusst, die mit Vesikeln oder Abschnitten der Plasmamembran verbunden sind, die mit dem Pipettenglas verbunden sind und nicht unter Spannung stehen.
Diese Methode lässt sich leicht für die Untersuchung anderer nukleotidsensitiver Ionenkanäle verwenden. CFTR ähnelt strukturell der akzessorischen Sulfonylharnstoffrezeptor-Untereinheit von KATP30,31. Wie K,ATP, wird auch das CFTR-Gating durch Nukleotidbindung gesteuert, was es zu einem offensichtlichen zukünftigen Ziel unserer Methodemacht 7. Purinerge P2X-Rezeptoren sind Ionenkanäle, die von extrazellulärem ATP9 gesteuert werden. TNP-ATP wirkt als Antagonist für P2X-Rezeptoren32,33. Daher ist es für die Untersuchung der P2X-Aktivierung nicht nützlich, obwohl es in Wettbewerbsassays mit P2X-Agonisten verwendet werden kann. Alternativ können auch andere fluoreszierende ATP-Derivate mit ausreichender spektraler Überlappung mit der ANAP-Emission verwendet werden, um die Aktivierung zu untersuchen. Alexa-647-ATP ist ein fluoreszierender P2X-Agonist34. Das berechnete R0 zwischen Alexa-647 und ANAP beträgt ~85 Å, was bedeutet, dass eine direkte Bindung an P2X zu einer erheblichen Abschreckung von ANAP führen sollte, die in den Kanal eingebaut ist. Ein derart langes R0 führt jedoch auch zu einer Abschreckung von Alexa-647-ATP, die an benachbarte Untereinheiten gebunden ist, und erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass eine unspezifische Nukleotidbindung zu FRET führt. Da die Ligandenbindungsstelle in P2X-Rezeptoren extrazellulär ist, würden Bindungsmessungen an intakten Zellen, in Ganzzell-Spannungsklemmen oder in Outside-Out-Membranpatches durchgeführt. Unsere Methode kann auch erweitert werden, um die Bindung und Aktivierung von elektrogenen und nicht-elektrogenen Transportern und Pumpen zu untersuchen, die für ihren Reaktionszyklus von ATP abhängig sind, sowie von G-Protein-gekoppelten P2Y-Rezeptoren. Obwohl wir diese Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP) entwickelt haben, kann derselbe Ansatz verwendet werden, um die Bindung an praktisch jeden Rezeptor zu untersuchen, für den ein geeigneter, fluoreszierender Ligand identifiziert wurde.

Mehrere wichtige Proteinklassen werden direkt durch die Ligandenbindung reguliert. Diese reichen von löslichen Enzymen bis hin zu in Membranen eingebetteten Proteinen, einschließlich Rezeptor-Tyrosinkinasen, G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) und Ionenkanälen. GPCRs und Kanäle machen ~34% bzw. ~15% aller aktuellen Wirkstoffziele aus 1,2. Daher besteht ein erhebliches biochemisches und medizinisches Interesse an der Entwicklung von Methoden, die mechanistische Einblicke in Ligand-Rezeptor-Interaktionen liefern. Herkömmliche Methoden zur Messung der Ligandenbindung, einschließlich Photoaffinitätsmarkierung und Radioligandenbindungsstudien, erfordern große Mengen an teilweise gereinigtem Protein und werden in der Regel unter nicht-physiologischen Bedingungen und Zeitskalen durchgeführt. Eine ideale Methode würde nur geringe Mengen an Protein benötigen, könnte an intakten Proteinen durchgeführt werden, die in einer Zell- oder Membranumgebung exprimiert werden, könnte in Echtzeit überwacht werden und wäre mit dem direkten Auslesen der Proteinfunktion kompatibel.
Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist eine Methode, die die Nähe zwischen zwei fluoreszenzmarkierten Molekülen detektiert3. FRET tritt auf, wenn ein angeregter Donor-Fluorophor Energie auf strahlungsfreie Weise auf ein Akzeptormolekül (typischerweise einen anderen Fluorophor) überträgt. Die Energieübertragung führt zu einer Abschreckung der Donorfluoreszenzemission und einer Sensibilisierung der Akzeptoremission (wenn es sich bei dem Akzeptor um einen Fluorophor handelt). Die Übertragungseffizienz ist abhängig von der 6. Potenz des Abstands zwischen dem Donor und dem Akzeptor. Darüber hinaus müssen sich Donor und Akzeptor in unmittelbarer Nähe befinden (in der Regel weniger als 10 nm), damit FRET auftreten kann. Daher kann FRET genutzt werden, um die direkte Bindung zwischen einem fluoreszenzmarkierten Proteinrezeptor und einem fluoreszierenden Liganden zu messen.
Verschiedene Proteine werden durch die Bindung von intrazellulären oder extrazellulären Adenin-Nukleotiden (ATP, ADP, AMP, cAMP) reguliert oder aktiviert. Viele Transporterproteine benötigen ATP-Hydrolyse für ihren Reaktionszyklus, darunter ATP-bindende Kassettentransporter und P-Typ-ATPasen wie die Na+/K+-Pumpe 4,5. ATP-sensitive K+ (KATP)-Kanäle, der Mukoviszidose-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) und zyklisch-nukleotidregulierte Kanäle sind allesamt Ionenkanäle, die durch die Bindung intrazellulärer Adenin-Nukleotide gesteuert werden, wodurch sie äußerst empfindlich auf Veränderungen des zellulären Stoffwechsels und der Signaltransduktion reagieren 6,7,8. Purinerge P2X- und P2Y-Rezeptoren reagieren auf Veränderungen des extrazellulären ATP, das als Neurotransmitter oder als Folge einer Gewebeschädigung freigesetzt werden kann9. Wir haben einen FRET-basierten Assay zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Membranproteine in Echtzeit entwickelt. Wir haben diese Methode bereits angewendet, um die Nukleotidbindung anK-ATP-Kanäle 10,11 zu untersuchen.
Um die Nukleotidbindung über FRET zu messen, muss ein Protein von Interesse zunächst mit einem Fluorophor markiert werden. Die fluoreszierende Markierung muss ortsspezifisch in das interessierende Protein eingefügt werden, so dass sie nahe genug an der Ligandenbindungsstelle liegt, damit FRET auftreten kann, wobei besonders darauf zu achten ist, dass die Markierung die Gesamtstruktur und -funktion des Proteins nicht beeinträchtigt. Um dies zu erreichen, verwenden wir eine von Chatterjee et al. entwickelte Technik, bei der eine fluoreszierende, nicht-kanonische Aminosäure (l-3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropion; ANAP) am gewünschten Standort12. Wir messen die Nukleotidbindung als FRET zwischen ANAP-markiertem Protein und fluoreszierenden Trinitrophenyl (TNP)-Nukleotidderivaten (Abbildung 1A). Das Emissionsspektrum von ANAP überschneidet sich mit dem Absorptionsspektrum von TNP-Nukleotiden, eine Bedingung, die für das Auftreten von FRET erforderlich ist (Abbildung 1B). Hier skizzieren wir zwei verschiedene Arten von Bindungsexperimenten. Im ersten Fall wird die Nukleotidbindung an die intrazelluläre Seite von ANAP-markiertenK-ATP-Kanälen in Zellen gemessen, die durch Beschallung befreit wurden, wobei anhaftende Fragmente der Plasmamembran auf einem Glasdeckglas10,11,13,14 zurückbleiben.
Bei der zweiten Methode wird die Nukleotidbindung an ANAP-markierte KATP-Kanäle in einem Membranfeld unter Spannungsklemme gemessen, was die gleichzeitige Messung von Ionenströmen und Fluoreszenz ermöglicht. Durch die Kombination dieser beiden experimentellen Ansätze können Änderungen in der Bindung direkt mit Änderungen der Kanalfunktion11 korreliert werden. Typische Ergebnisse, mögliche Fallstricke und Datenanalysen werden diskutiert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

Wir haben eine Methode entwickelt, um die Bindung von Adenin-Nukleotiden an intakte, funktionelle Transmembranrezeptoren in einer zellulären oder membranartigen Umgebung zu messen. Diese Methode kombiniert die Expression von Proteinen, die mit der fluoreszierenden nicht-kanonischen Aminosäure ANAP markiert sind, und FRET zwischen ANAP und fluoreszierenden (Trinitrophenyl)-Nukleotidderivaten. Wir präsentieren Beispiele für die Bindung von Nukleotiden an ANAP-markierte KATP-Ionenkanäle , gemessen in unüberdachten Plasmamembranen und exzidierten, von innen nach außen gerichteten Membranpflastern unter Spannungsklemme. Letzteres ermöglicht die gleichzeitige Messung der Ligandenbindung und des Kanalstroms, ein direktes Auslesen der Proteinfunktion. Die Datenverarbeitung und -analyse wird ausführlich diskutiert, zusammen mit potenziellen Fallstricken und Artefakten. Diese Methode liefert reichhaltige mechanistische Einblicke in das ligandenabhängige Gating vonK-ATP-Kanälen und kann leicht für die Untersuchung anderer Nukleotid-regulierter Proteine oder anderer Rezeptoren angepasst werden, für die ein geeigneter fluoreszierender Ligand identifiziert werden kann.

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Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Da ATP ein wichtiger zellulärer Botenstoff ist, haben wir eine Methode entwickelt, mit der wir die Bindung von ATP an seine Rezeptoren mit hoher Präzision messen können. Mit Hilfe von FRET zwischen Nukleotidderivaten und fluoreszenzmarkierten Proteinen können wir die Nukleotidbindung an intakte funktionelle Rezeptoren in Echtzeit und mit ausgezeichneter räumlicher Auflösung verfolgen. Wir verwenden diese Methode, um die Auswirkungen des zellulären Stoffwechsels auf den ATP-sensitiven Kaliumkanal zu verstehen, der an bestimmten Formen von Diabetes beteiligt ist.Um ein Experiment ohne Dach durchzuführen, verwenden Sie zunächst eine Pinzette, um ein kleines Fragment von einem Deckglas mit transfizierten Zellen zu brechen, und spülen Sie das Fragment mit PBS ab. Wenn das Deckglas mit Polylysin vorbeschichtet ist, legen Sie das Fragment auf den Boden einer 35-Millimeter-Schale mit zwei Millilitern PBS und halten Sie ein Drei-Millimeter-Sonden-Ultraschallgerät drei bis fünf Millimeter über die Probe, das 200 bis 500 Millisekunden lang mit 50 Watt und 20 bis 40 % Amplitude pulsiert, um die Zellen zu öffnen. Wenn die Deckgläser nicht vorbeschichtet sind, tauchen Sie das Fragment nach dem Spülen mit PBS etwa 30 Sekunden lang in ein Röhrchen mit 0,1 % Poly-L-Lysin, bevor Sie die Zellen mit kurzer Beschallung wie gezeigt abdecken.Übertragen Sie das beschallte Fragment in eine abgedeckte 35-Millimeter-Schale mit Glasboden, die zwei Milliliter Badelösung enthält, und montieren Sie die Schale auf ein inverses Mikroskop, das mit einem 60-fachen Wasserimmersionsobjektiv mit hoher numerischer Apertur ausgestattet ist. Stellen Sie sicher, dass der Kameraanschluss des Mikroskops mit einem Spektrographen in Reihe mit einer hochempfindlichen CCD-Kamera verbunden ist, und verwenden Sie eine Peristaltikpumpe, um die Badekammer mit Puffer mit einer Durchflussrate von 0,5 bis einem Milliliter Puffer pro Minute zu perfundieren. Um Membranfragmente ohne Dach zu identifizieren, die den ANAP-markierten Kanal exprimieren, sehen Sie sich die Probe an, um Membranen mit fluoreszierenden Kanälen zu finden.Greifen Sie die Spektrometermaske teilweise zwischen den Kameraanschluss des Mikroskops und den Spektrographen ein. Der Schatten der Maske erscheint auf dem Kamerabild. Erfassen Sie ein Hellfeld- und Fluoreszenzbild der Membran ohne Dach, um die Auswahl des interessierenden Bereichs für die Analyse zu ermöglichen.Bringen Sie die Spitze des Mikrovolumen-Perfusionssystems in die Nähe der nicht überdachten Membran. Um ein Bild der ANAP-Fluoreszenz zu erhalten, wird die Membran mit einer 385-Nanometer-LED durch einen 390/18-Nanometer-Bandpass-Anregungsfilter und einen 416-Nanometer-Kantendichroitoidfilter angeregt, wobei das emittierte Licht durch einen 400-Nanometer-Langpass-Emissionsfilter gesammelt wird. Setzen Sie die Spektrometermaske ein und stellen Sie sicher, dass das emittierte Licht durchgelassen wird.Richten Sie den interessierenden Bereich am Schlitz der Spektrometermaske aus. Setzen Sie die Spektrometergitter ein. Wenn die Gitter angebracht sind, wird das vom Spektrometer gebeugte Licht auf den Chip der CCD-Kamera projiziert, um Spektralbilder zu erzeugen.Die Bilder behalten räumliche Informationen in der Y-Dimension bei. Die X-Dimension wird durch die Wellenlänge ersetzt. Während Sie mit nukleotidfreier Pufferlösung perfundieren, erhalten Sie eine oder mehrere 0,1- bis zehnsekündige Belichtungen zur nachgeschalteten Korrektur und Normalisierung der Daten, die während des restlichen Experiments gesammelt wurden.Als Nächstes wenden Sie eine Reihe von TNP-ATP-Konzentrationen in der Badlösung an, um eine Konzentrationsreaktionskurve zu erstellen, und durchbluten Sie jede Lösung mindestens eine Minute lang, um sicherzustellen, dass ein stationärer Zustand erreicht wird, und erhalten Sie eine Exposition für jede Konzentration. Waschen Sie nach jeder Konzentration das TNP-ATP mindestens eine Minute lang mit nukleotidfreier Badlösung aus, bevor Sie ein Belichtungsbild nach der Behandlung aufnehmen. Um ein Patch-Clamp-Fluorometrie-Experiment durchzuführen, ziehen Sie zunächst Patchpipetten aus dickwandigen Borosilikatglaskapillaren auf einen Widerstand von 1,5 bis 2,5 Megaohm, wenn sie mit Pipettenlösung gefüllt sind.Übertragen Sie anschließend ein Deckglas mit transfizierten Zellen in eine 35-Millimeter-Schale mit Glasboden und zwei Millilitern Badelösung und montieren Sie die Schale auf das inverse Mikroskop. Durchströmen Sie die Badekammer mit Badelösung und identifizieren Sie eine Zelle, die ANAP-markierte Kanäle exprimiert. Üben Sie sanften Überdruck auf eine Patch-Pipette aus und legen Sie die Pipette in eine Badekammer.Drücken Sie die Pipette gegen die Membran der Zelle und saugen Sie sanft ab, um eine Gigaohm-Abdichtung zu erreichen. Um das Pflaster zu entfernen, bewegen Sie den Pipettenhalter schnell von der gepflasterten Zelle weg. Bringen Sie die Spitze der Patch-Pipette in die Nähe der Spitze des Perfusionssystems und überprüfen Sie, ob sich das Pflaster innerhalb des Schlitzes der Spektrometermaske befindet.Wenden Sie dann TNP ATP an und sammeln Sie Bildspektren. In diesen Bildern ist ein typisches Membranfragment einer HEK293T Zelle zu sehen, das ATP-sensitive Kaliumkanäle exprimiert, die mit orange fluoreszierendem Protein markiert sind. In diesem Spektralbild von ANAP-markierten ATP-sensitiven Kaliumkanälen in einer unüberdachten Membran einer HEK293T Zelle, die fünf mikromolaren TNP-ATP ausgesetzt war, können zwei Regionen hoher Intensität beobachtet werden, die der Spitzenemission von ANAP und TNP ATP entsprechen.Ein endgültiges Spektrum kann erhalten werden, indem das gemittelte Hintergrundspektrum vom gemittelten Spektrum des interessierenden Bereichs subtrahiert wird. Hier kann die Abnahme der maximalen ANAP-Fluoreszenz nach Mehrfachbelichtung beobachtet werden. Die maximale Fluoreszenz aus mehreren Belichtungen in Abwesenheit von TNP ATP wurde an einen einzigen exponentiellen Zerfall angepasst.Diese Daten wurden dann verwendet, um Photobleaching-Artefakte zu korrigieren. In dieser Arbeit werden repräsentative Spektralbilder einer Membran ohne Dach gezeigt, die von einer Zelle erhalten wurde, die ANAP-markierte ATP-sensitive Kaliumkanäle in Abwesenheit und Anwesenheit von TNP-ATP exprimiert. Die Betrachtung der korrigierten Emissionsspektren zeigt eine klare Trennung zwischen Donor- und Akzeptor-Fluoreszenz-Emission.In dieser Abbildung sind repräsentative Ströme und Spektren von ANAP-markierten ATP-sensitiven Kaliumkanälen aus einem typischen Patch-Clamp-Fluorometrie-Experiment dargestellt. Die Emissionsspektren werden für Hintergrund und Ausbleichen korrigiert, wie dies für unüberdachte Membranen gezeigt wurde. Achten Sie bei den Kontrollen darauf, dass das Fluoreszenzsignal spezifisch für Ihren Rezeptor ist.Stellen Sie sicher, dass Ihre Fülle schnell, effizient und vollständig ist, und halten Sie Ihre Belichtungen so kurz wie möglich. Diese Methode beantwortet Fragen zur Rezeptorbelegung und wie sie mit der Funktion zusammenhängt. Andere FRET-Techniken, die mit einem ähnlichen Aufbau verwendet werden, können ligandeninduzierte Bestätigungsänderungen im Rezeptor untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Verfahren zum Visualisieren und Analysieren Membran interagierender Proteine ​​durch Transmissionselektronenmikroskopie

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

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Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Messung der Trans-Plasma Membran Elektronentransport durch C2C12 Myotubes

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Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

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Erfassung und Identifizierung von RNA-bindende Proteine mit Click-Chemie-gestützte RNA-Interaktom erfassen (CARIC) Strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Überwachung von GPCR---Arrestin1/2-Interaktionen in Echtzeit-Lebenssystemen zur Beschleunigung der Arzneimittelentdeckung

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...