Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

ברצוננו להודות לראול טרון אקספוזיטו על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה על ידי מועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BB/R002517/1; MCP ו-FMA) וקרן Wellcome (203731/Z/16/A; SGU)

<ol>
	<li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success.">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters.">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li><li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases:+excitement+continues.">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li><li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNG+and+HCN+channels:+two+peas,+one+pod.">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li><li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+coupling+between+CFTR's+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations.">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li><li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1:+A+Mechanistic+Model.">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li><li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors.">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li><li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K(+)+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding.">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103 (2019).</li><li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K++channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry.">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775 (2020).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane.">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+'cell+cortices'+for+light+and+electron+microscopy.">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li><li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase/tRNA+expression+and+engineered+eRF1.">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li><li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature.">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).</li><li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions.">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li><li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding,+gating,+affinity+and+efficacy:+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors.">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry.">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels.">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).</li><li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels.">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels.">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry.">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K(+)+channels.">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li><li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization.">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance.">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li><li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction.">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li><li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels.">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li><li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel.">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).</li><li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1,+P2X3,+and+heteromeric+P2X2/3+receptors.">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li><li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization.">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פיתחנו שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד בזמן אמת לחלבוני ממברנה שלמים. השיטה שלנו מתבססת על מספר טכניקות מבוססות אחרות, כולל תיוג חלבונים עם ANAP באמצעות דיכוי קודון עצירה ענבר 12, הסרת קירוי תאים 14, ופלואורומטריית מהדק מתח/PCF19,20,21,22,23,24,25. הסינתזה של גישות אלה מאפשרת מדידה של קשירת נוקלאוטידים ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. ואכן, בעבודתנו הקודמת הצלחנו להבחין בין אתרי קישור שונים על אותו קומפלקס חלבונים באמצעות גישה זו10,11. חשוב לציין כי ניתן ליישם טכניקה זו ישירות על כמויות קטנות של חלבון בסביבה תאית בתנאים המשמרים את תפקוד החלבון. השימוש בשיטת הקשירה שלנו בשילוב עם קריאה ישירה ואלקטרופיזיולוגית של זרמי תעלות יונים מאפשר לנו לקבל תובנות עשירות על היסודות המולקולריים של ערוץגאטינג 11.
מכיוון שספקטרומטרים הם ציוד מעבדה לא סטנדרטי, ניתן לנטר את עוצמת ANAP גם בבידוד יחסי באמצעות מסנני פסים. איור 5B מתאר את התכונות הספקטרליות של שני מסננים כאלה. מסנן הפס 470/10 ננומטר מסנן ביעילות את אות הפלואורסצנטיות מ-TNP-ATP וחופף היטב לשיא הפלואורסצנטיות של ANAP. עם זאת, שיא ההעברה של מסנן זה הוא רק סביב 50%, מה שעלול להקשות על קבלת אותות טובים מממברנות עמומות (או בכתמי קרום נכרתו תחת מהדק מתח). אפשרות נוספת היא מסנן פסים של 460/60 ננומטר. יש מעט יותר חפיפה בין מסנן 460/60 ננומטר לבין כף הרגל של שיא הפליטה TNP-ATP בהשוואה למסנן 470/10 ננומטר. עם זאת, לפס 460/60 ננומטר יש העברה של 90-95% על פני טווח רחב של שיא ANAP, אשר צפוי להגביר את אות הפלואורסצנטיות.
ANAP הוא פלואורופוררגיש לסביבה 12,26,27. שיא הפליטה ותפוקת הקוונטים משתנים בהתאם לאתר ההתאגדות של החלבון המעניין ועשויים להשתנות כאשר החלבון משנה קונפורמציה. שינויים כאלה יהיו ברורים באופן מיידי מספקטרום הפליטה, אך לא יהיו ברורים כל כך כאשר עוצמת ANAP נמדדת באמצעות מסננים. בכל מקרה, נדרשות בקרות מתאימות כדי להוכיח שהאות הפלואורסצנטי אינו משתנה בגלל שינויים בסביבה המקומית סביב ANAP בעקבות קשירת הנוקלאוטידים. ניסויי בקרה עם נוקלאוטידים לא מסומנים יכולים לעזור לוודא שכל שינוי בעוצמת ANAP הוא תוצאה של FRET בין ANAP לנוקלאוטידים TNP. TNP-נוקלאוטידים יכולים להיקשר באופן לא ספציפי לממברנות שמקורן בתאים לא נגועים (לקרום הפלזמה או לחלבוני הממברנה המקומיים)10. אנו מכמתים את הכריכה כגזירה בפלואורסצנטיות של התורם, מכיוון שאות זה הוא ספציפי לערוץ המסומן. עם זאת, אנו ממליצים לבצע ניסויי בקרה נוספים עבור כל זוג אגוניסטים/קולטנים, למשל מוטציה באתר קשירת הנוקלאוטידים אם ידוע, כדי לוודא שהשינוי בפלואורסצנטיות של התורם הוא אכן תוצאה של קשירה ישירה לקולטןהמסומן 11. לבסוף, מומלץ לעבוד עם מבנים המכילים תג חלבון פלואורסצנטי בנוסף לתווית ANAP. זה עוזר להבדיל בין פלואורסצנטיות קולטן מסומן לבין רקע / אוטופלואורסצנטיות. ניתן להבדיל בין פלואורסצנטיות רקע לבין ANAP על ידי שיא וצורה של ספקטרום פליטה10, אך קביעות כאלה יכולות להיות קשות מאוד כאשר משתמשים רק בערכות סינון. בנוסף, ניתן לזהות תאים וקרומים לא מקורים המבטאים קולטנים פלואורסצנטיים באמצעות תג החלבון הפלואורסצנטי מבלי לעורר ANAP ולהסתכן בהלבנה מוגזמת.
ברבות מרישומי ה-PCF שלנו ראינו שיא שלילי חזק בספקטרום שלנו בריכוזי TNP-ATP גבוהים (איור 4C). שיא שלילי זה הוא תוצר של פרוטוקול חיסור הרקע שלנו. איור 4D מראה תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של פיפטת טלאי שנחשפה ל-1 mM TNP-ATP. ניתן להבחין בצל בקצה הפיפטה, הנובע מהרחקת TNP-ATP מנפח דפנות הפיפטה, הניכרת ביותר במישור המיקוד. התמונה הספקטרלית באיור 4E מראה פס כהה, המתאים לצל הזה. כאשר אזור מעל או מתחת לפס כהה זה משמש לחיסור רקע, הוא מפיק שיא שלילי. חשוב לציין כי שיא זה התרחש בטווח אורכי גל המתאים לפליטת TNP-ATP ולא השפיע על המדידות שלנו של מרוות ANAP.
המגבלה העיקרית של הניסויים שלנו הייתה בהשגת ביטוי הולם של קרום פלזמה של מבנים המתויגים על ידי ANAP כדי למדוד פלואורסצנטיות. בדרך כלל היה קל יותר לרכוש ספקטרום איכותי מממברנות לא מקורות, מאשר ב-PCF, בשל גודלן הגדול יותר ויכולתנו לסרוק במהירות צלחת שלמה של ממברנות לא מקורות, בניגוד ל-PCF שם ניתן לקבל טלאים רק אחד בכל פעם. בניסויים שלנו, הנתונים מממברנות לא מקורות, ומניסויי PCF היו דומים אך לא שווי ערך (איור 6)11. עם זאת, אין סיבה אפריורית מדוע זו צריכה להיות תצפית אוניברסלית מכיוון שחלבונים בפיפטת טלאי עשויים להיות במצב תפקודי שונה מאלה שבממברנות לא מקורות.
כאן, נעשו ניסיונות למקסם את הביטוי של המבנים המתויגים ANAP שלנו, במיוחד הורדת טמפרטורת תרבית התא ל 33 ° C10,11,16. מניסיוננו, הניסיון לזהות אתרים בחלבון שבהם ANAP יהיה תחליף שמרני לא הניב באופן עקבי מבנים שהתבטאו היטב. הייתה לנו הצלחה רבה יותר בסריקה שיטתית של אזורי חלבון שלמים עבור אתרי שילוב ANAP וסינון מועמדים לביטוי פני שטח10. מערכת התיוג ANAP פועלת גם בביציות Xenopus laevis, המאפשרת כריתה של מדבקות קרום גדולות בהרבה, ובכך מגבירה את האות לרעש26,27,28.
בעוד שרמות ביטוי גדולות יותר צפויות לגרום לאותות בהירים יותר, מספר הערוצים המינימלי הדרוש למדידת פלואורסצנטיות תלוי במספר גורמים, כולל בהירות הפלואורופור, מידת ההלבנה, עוצמת אור העירור ומישור המיקוד. בתיאוריה, ניתן לבצע הערכות על ידי מתאם בין עוצמת הפלואורסצנטיות לבין זרם הערוץ כפי שהוכח בעבר28,29. עם זאת, מהימנותם של אומדנים כאלה דורשת ידע מסוים על המוליכות החד-ערוצית ועל ההסתברות הגלויה של הערוץ. בנוסף לגורמים המפורטים לעיל, האות הפלואורסצנטי יושפע גם מתעלות הקשורות לשלפוחיות או חלקים של קרום הפלזמה הדבוקים לזכוכית פיפטה שאינם תחת מהדק מתח.
שיטה זו מותאמת בקלות לחקר תעלות יונים אחרות הרגישות לנוקלאוטידים. CFTR דומה מבחינה מבנית לתת-היחידה של קולטן סולפונילאוריאה של KATP30,31. כמו KATP CFTR GATING נשלט על ידי קשירת נוקלאוטידים, מה שהופך אותו למטרה עתידית ברורה של שיטה7 שלנו. קולטני P2X פורינרגיים הם תעלות יונים המגודרות על ידי ATP9 חוץ-תאי. TNP-ATP פועל כאנטגוניסט לקולטני P2X32,33. לכן, זה לא יהיה שימושי לחקר הפעלת P2X, אם כי ניתן להשתמש בו במבחני תחרות עם אגוניסטים P2X. לחלופין, נגזרות ATP פלואורסצנטיות אחרות עם חפיפה ספקטרלית מספקת עם פליטת ANAP עשויות לשמש לחקר ההפעלה. Alexa-647-ATP הוא אגוניסט P2X פלואורסצנטי34. R0 המחושב בין Alexa-647 ו- ANAP הוא ~ 85 Å, מה שאומר שקשירה ישירה ל- P2X אמורה לגרום לרוויה משמעותית של ANAP המשולב בתעלה. עם זאת, R0 ארוך כזה יגרום גם למרווה מ-Alexa-647-ATP הקשור לתת-יחידות שכנות ויגדיל את הסבירות שקשירת נוקלאוטידים לא ספציפיים תגרום ל-FRET. מכיוון שאתר קשירת הליגנד בקולטני P2X הוא חוץ-תאי, מדידות הקשירה יבוצעו על תאים שלמים, במהדק מתח של כל התא, או בכתמי קרום חיצוניים. ניתן להרחיב את השיטה שלנו גם לחקר קשירה והפעלה של טרנספורטרים ומשאבות אלקטרוגניים ולא אלקטרוגניים התלויים ב-ATP עבור מחזור התגובה שלהם, כמו גם קולטני P2Y מצומדים לחלבון G. לבסוף, למרות שפיתחנו שיטה זו למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), ניתן להשתמש באותה גישה כדי לחקור קשירה כמעט לכל קולטן שעבורו זוהה ליגנד פלואורסצנטי מתאים.

מספר סוגים חשובים של חלבון מווסתים ישירות על ידי קשירת ליגנד. אלה נעים בין אנזימים מסיסים לחלבונים משובצים בקרום, כולל קולטן טירוזין קינאזות, קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) ותעלות יונים. GPCRs וערוצים מהווים ~34% ו~15% מכלל יעדי התרופות הנוכחיים, בהתאמה 1,2. לכן, קיים עניין ביוכימי ורפואי רב בפיתוח שיטות המספקות תובנות מכניסטיות לגבי אינטראקציות ליגנד-קולטן. שיטות מסורתיות למדידת קשירת ליגנדים, כולל תיוג זיקת אור ומחקרי קשירת רדיוליגנד, דורשות כמויות גדולות של חלבון מטוהר חלקית ומבוצעות בדרך כלל בתנאים לא פיזיולוגיים ובסקאלות זמן. שיטה אידיאלית תדרוש כמויות קטנות בלבד של חלבון, תוכל להתבצע על חלבונים שלמים המבוטאים בסביבה תאית או ממברנה, תוכל להיות מנוטרת בזמן אמת, ותהיה תואמת לקריאות ישירות של תפקוד החלבון.
Förster resonance energy transfer (FRET) היא שיטה המזהה את הקרבה בין שתי מולקולות המתויגות באופן פלואורסצנטי3. FRET מתרחש כאשר פלואורופור תורם נרגש מעביר אנרגיה באופן לא קרינתי למולקולת קבלה (בדרך כלל פלואורופור אחר). העברת אנרגיה גורמת למרווה של פליטת הפלואורסצנטיות של התורם ולרגישות של הפליטה המקבלת (אם המקבל הוא פלואורופור). יעילות ההעברה תלויהבחזקת 6 של המרחק בין התורם למקבל. יתר על כן, התורם והמקבל חייבים להיות בקרבת מקום (בדרך כלל פחות מ -10 ננומטר) כדי ש- FRET יתרחש. ככזה, ניתן לנצל את FRET כדי למדוד את הקישור הישיר בין קולטן חלבון המסומן באופן פלואורסצנטי לבין ליגנד פלואורסצנטי.
מספר חלבונים שונים מווסתים או מופעלים על ידי קשירת נוקלאוטידים אדנין תוך-תאיים או חוץ-תאיים (ATP, ADP, AMP, cAMP). חלבוני טרנספורטר רבים זקוקים להידרוליזה של ATP עבור מחזור התגובה שלהם, כולל מובילי קלטות קושרי ATP ו-ATPases מסוג P כמו משאבת Na+/K+ 4,5. תעלות K+ (K ATP) רגישותל-ATP, וסת ההולכה הטרנסממברנה של סיסטיק פיברוזיס (CFTR) ותעלות מווסתות נוקלאוטידים מחזוריות הן כולן תעלות יונים המגודרות על ידי קשירה של נוקלאוטידים אדנין תוך-תאיים, מה שהופך אותם לרגישים להפליא לשינויים בחילוף החומרים התאי ובהעברת אותות 6,7,8. קולטני P2X ו-P2Y פורינרגיים מגיבים לשינויים ב-ATP חוץ-תאי, שיכול להשתחרר כמוליך עצבי או כתוצאה מנזק לרקמות9. פיתחנו בדיקה מבוססת FRET למדידת קשירת נוקלאוטידים אדנין לחלבוני ממברנה בזמן אמת. בעבר יישמנו שיטה זו כדי לחקור קשירת נוקלאוטידים לתעלות KATP 10,11.
כדי למדוד קשירת נוקלאוטידים באמצעות FRET, חלבון מעניין חייב להיות מתויג תחילה עם פלואורופור. התג הפלואורסצנטי חייב להיות מוכנס לחלבון המעניין אותו כך שיהיה קרוב מספיק לאתר קשירת הליגנד כדי ש-FRET יתרחש, תוך הקפדה מיוחדת על כך שהתג לא ישפיע על המבנה הכללי של החלבון ותפקודו. כדי להשיג זאת, אנו משתמשים בטכניקה שפותחה על ידי Chatterjee et al., באמצעות דיכוי סטופ-קודון ענבר כדי להחדיר חומצת אמינו לא קנונית פלואורסצנטית (l-3-(6-acetylnaphthalen-2-ylamino)-2-aminopropionic; ANAP) באתר הרצוי12. אנו מודדים קשירת נוקלאוטידים כ-FRET בין חלבון המסומן בתווית ANAP לבין נגזרות נוקלאוטידים פלואורסצנטיים של טריניטרופניל (TNP) (איור 1A). ספקטרום הפליטה של ANAP חופף לספקטרום הספיגה של TNP-נוקלאוטידים, תנאי הכרחי להתרחשות FRET (איור 1B). כאן אנו מתארים שני סוגים שונים של ניסוי מחייב. בראשון, קשירת נוקלאוטידים לצד התוך-תאי של תעלות KATP המסומנות על ידי ANAP נמדדת בתאים שלא כוסו על ידי סוניקציה והותירו שברים דבקים של קרום פלזמה על מכסה זכוכית10,11,13,14.
בשיטה השנייה, קשירת נוקלאוטידים לתעלות KATP המסומנות על ידי ANAP נמדדת בטלאי קרום תחת מהדק מתח, מה שמאפשר מדידה בו זמנית של זרמים יוניים ופלואורסצנטיים. על ידי שילוב שתי גישות ניסיוניות אלה, שינויים בקשירה יכולים להיות בקורלציה ישירה עם שינויים בפונקציית ערוץ11. תוצאות אופייניות, מלכודות פוטנציאליות וניתוח נתונים נדונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

פיתחנו שיטה למדידת קשירה של נוקלאוטידים אדנין לקולטנים טרנסממברנליים שלמים ופונקציונליים בסביבה תאית או ממברנה. שיטה זו משלבת ביטוי של חלבונים המתויגים עם חומצת האמינו הפלואורסצנטית הלא קנונית ANAP, ו- FRET בין ANAP ונגזרות נוקלאוטיד פלואורסצנטיות (trinitrophenyl). אנו מציגים דוגמאות של קשירת נוקלאוטידים לתעלות יון KATP המתויגות על ידי ANAP שנמדדו בקרומי פלזמה לא מקורים ובכתמי קרום שנכרתו מבפנים החוצה תחת מהדק מתח. האחרון מאפשר מדידות בו זמנית של קשירת ליגנד וזרם ערוץ, קריאה ישירה של תפקוד החלבון. טיפול וניתוח נתונים נדונים בהרחבה, יחד עם מלכודות וחפצים. שיטה זו מספקת תובנות מכניסטיות עשירות לגבי ה-gating תלוי הליגנד של תעלותK ATP וניתן להתאים אותה בקלות לחקר חלבונים אחרים המווסתים נוקלאוטידים או כל קולטן שעבורו ניתן לזהות ליגנד פלואורסצנטי מתאים.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

פרוטוקול זה מציג שיטה למדידת קשירת אדנין נוקלאוטיד לקולטנים בזמן אמת בסביבה תאית. הקישור נמדד כהעברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET) בין נגזרות נוקלאוטידים של טריניטרופניל לבין חלבון המסומן בחומצת אמינו פלואורסצנטית לא קנוני.

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

מכיוון ש-ATP הוא שליח תאי חשוב, פיתחנו שיטה המאפשרת לנו למדוד את קשירת ה-ATP לקולטנים שלו בדיוק גבוה. באמצעות FRET בין נגזרות נוקלאוטידים וחלבונים מתויגים פלואורסצנטית, אנו יכולים לעקוב אחר קשירת נוקלאוטידים לקולטנים פונקציונליים שלמים בזמן אמת וברזולוציה מרחבית מצוינת. אנו משתמשים בשיטה זו כדי להבין את ההשפעות של חילוף החומרים התאי על תעלת האשלגן הרגישה ל-ATP, אשר מעורבת בצורות מסוימות של סוכרת.כדי לערוך ניסוי בממברנה ללא גגות, השתמשו תחילה בזוג מלקחיים כדי לשבור שבר קטן מחליק כיסוי עם תאים נגועים ושטפו את המקטע עם PBS. אם החלקת הכיסוי מצופה מראש בפוליליזין, הניחו את השבר בתחתית צלחת 35 מילימטר המכילה שני מיליליטר PBS והחזיקו סוניק בדיקה של שלושה מילימטרים שלושה עד חמישה מילימטרים מעל הדגימה, פועם בעוצמה של 50 וואט ומשרעת של 20% עד 40% למשך 200 עד 500 אלפיות השנייה כדי לפתוח את גג התאים. אם החלקות הכיסוי אינן מצופות מראש, לאחר שטיפה עם PBS, טבלו את השבר בצינור המכיל 0.1% פולי-L-ליזין למשך כ-30 שניות לפני שתפרקו את קירוי התאים עם סוניקציה קצרה כפי שהודגם בהדגמה.מעבירים את השבר הסוני לצלחת זכוכית מכוסה תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ומרכיבים את הצלחת על מיקרוסקופ הפוך המצויד ביעד טבילה במים בעל מפתח נומרי גבוה פי 60. בדקו שיציאת המצלמה של המיקרוסקופ מחוברת לספקטרוגרף בסדרות עם מצלמת CCD בעלת רגישות גבוהה והשתמשו במשאבה פריסטלטית כדי לחורר את תא האמבטיה עם חיץ בקצב זרימה של 0.5 עד מיליליטר חיץ לדקה. כדי לזהות שברי קרום לא מקורים המבטאים את התעלה המסומנת ANAP, עיין בדגימה כדי לאתר ממברנות עם תעלות פלואורסצנטיות.הפעילו חלקית את מסיכת הספקטרומטר בין יציאת המצלמה במיקרוסקופ לבין הספקטרוגרף. צל המסכה יופיע על תמונת המצלמה. לרכוש שדה בהיר תמונה פלואורסצנטית של הממברנה unroofed כדי לאפשר בחירה של האזור של עניין לניתוח.קרבו את קצה מערכת הזילוח למיקרו-נפח לקרום הלא מקורה. כדי לקבל תמונה של פלואורסצנטיות ANAP, לעורר את הממברנה עם LED 385 ננומטר דרך מסנן עירור מעבר פס 390/18 ננומטר ודיכרואית קצה 416 ננומטר, איסוף האור הנפלט דרך מסנן פליטה 400 ננומטר ארוך. הפעילו את מסיכת הספקטרומטר וודאו שהאור הנפלט עובר דרכה.יישר את אזור העניין עם החריץ של מסיכת הספקטרומטר. הפעילו את גרגרי הספקטרומטר. עם הגרגרים במקומם, האור המפוזר על ידי הספקטרומטר יוקרן על השבב של מצלמת CCD כדי להפיק תמונות ספקטרליות.התמונות ישמרו מידע מרחבי בממד Y. ממד X יוחלף באורך גל. תוך כדי התעסקות עם תמיסת חיץ ללא נוקלאוטידים, קבל חשיפה אחת או יותר של 0.1 עד עשר שניות לתיקון במורד הזרם ולנורמליזציה של הנתונים שנאספו לאורך שאר הניסוי.לאחר מכן, יש למרוח טווח של ריכוזי TNP ATP בתמיסת אמבטיה כדי לקבוע עקומת תגובת ריכוז, תוך ערבוב כל תמיסה למשך דקה אחת לפחות כדי להבטיח הגעה למצב יציב ולקבל חשיפה לכל ריכוז. לאחר כל ריכוז, שטפו את TNP ATP בתמיסת אמבטיה נטולת נוקלאוטידים למשך דקה אחת לפחות לפני קבלת תמונת חשיפה לאחר הטיפול. כדי לבצע ניסוי פלואורומטריה מהדק טלאי, תחילה משוך פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט עבים בעלי דופן להתנגדות של 1.5 עד 2.5 מגה-אוהם כאשר הם מלאים בתמיסת פיפטה.לאחר מכן, להעביר כיסוי להחליק עם תאים נגועים לתוך צלחת זכוכית תחתית 35 מ"מ המכילה שני מיליליטר של תמיסת אמבטיה ולהרכיב את הצלחת על המיקרוסקופ ההפוך. יש לנקב את תא האמבטיה בתמיסת אמבטיה ולזהות תא המבטא תעלות מסומנות ANAP. הפעילו לחץ חיובי עדין על פיפטת טלאי והניחו את הפיפטה בתא אמבטיה.לחץ על פיפטה כנגד קרום התא והחל יניקה עדינה כדי להשיג אטם ג'יגה-אוהם. כדי להסיר את המדבקה, הרחיקו במהירות את מחזיק פיפטה מהתא המתוקן. קרבו את קצה פיפטת המדבקה לקצה מערכת הזילוח, ובדקו שהמדבקה נמצאת בתוך החריץ של מסיכת הספקטרומטר.לאחר מכן החל TNP ATP ואסוף ספקטרום תמונה. בתמונות אלה ניתן להבחין בשבר קרום טיפוסי ללא גג מתא HEK293T המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות בחלבון פלואורסצנטי כתום. בתמונה ספקטרלית זו של תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בקרום לא מקורה מתא HEK293T שנחשף לחמישה מיקרו-טוחנים TNP ATP, ניתן לראות שני אזורים בעוצמה גבוהה המתאימים לשיא הפליטה של ANAP ו-TNP ATP.ניתן לקבל ספקטרום סופי על ידי חיסור ספקטרום הרקע הממוצע מהאזור הממוצע של ספקטרום העניין. כאן, ניתן לראות את הירידה בפלואורסצנטיות שיא ANAP לאחר חשיפות מרובות. שיא הפלואורסצנטיות ממספר חשיפות בהיעדר TNP ATP הותאם לדעיכה מעריכית אחת.נתונים אלה שימשו לאחר מכן לתיקון ממצאי פוטו-הלבנה. כאן מוצגות תמונות ספקטרליות מייצגות מקרום לא מקורה המתקבל מתא המבטא תעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP בהיעדר ונוכחות TNP ATP. התבוננות בספקטרום הפליטה המתוקן מגלה הפרדה ברורה בין הפליטה הפלואורסצנטית של התורם למקבל.באיור זה מוצגים זרמים מייצגים וספקטרום מתעלות אשלגן רגישות ל-ATP המתויגות כ-ANAP מניסוי פלואורומטריה טיפוסי של מהדק טלאי. ספקטרום הפליטה מתוקן עבור רקע והלבנה כפי שהודגם עבור ממברנות ללא קירוי. היזהר עם פקדים כדי לוודא שהאות הפלואורסצנטי ספציפי לקולטן שלך.ודאו שהשפע שלכם מהיר, יעיל ושלם ושמרו על חשיפות קצרות ככל האפשר. שיטה זו עונה על שאלות לגבי תפוסת קולטנים וכיצד היא קשורה לתפקוד. טכניקות FRET אחרות המשמשות עם מערך דומה יכולות לחקור שינויים אישור הנגרמים על ידי ליגנד בקולטן.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

מדידת הטרנס-פלזמה ממברנה אלקטרון תעבורה על-ידי C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

מעקב GPCR-β-arrestin1/2 אינטראקציות בזמן אמת מערכות חיים כדי להאיץ את גילוי הסמים

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...