Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Si ringrazia Raul Terron Exposito per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato dal Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/R002517/1; MCP e FMA) e il Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Abbiamo sviluppato un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina in tempo reale alle proteine di membrana intatte. Il nostro metodo si basa su diverse altre tecniche consolidate, tra cui l'etichettatura delle proteine con ANAP utilizzando la soppressione del codone di arresto ambrato 12, lo scoperchio delle cellule 14 e la fluorometria a morsetto di tensione / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . La sintesi di questi approcci consente la misurazione del legame nucleotidico con un'elevata risoluzione spaziale e temporale. Infatti, nel nostro lavoro precedente, siamo stati in grado di distinguere tra diversi siti di legame sullo stesso complesso proteico usando questo approccio10,11. È importante sottolineare che questa tecnica può essere applicata direttamente a piccole quantità di proteine in un ambiente cellulare in condizioni che preservano la funzione proteica. L'utilizzo del nostro metodo di legame in combinazione con la lettura elettrofisiologica diretta delle correnti dei canali ionici ci consente di ottenere informazioni approfondite sulle basi molecolari del canale gating11.
Poiché gli spettrometri sono un'apparecchiatura di laboratorio non standard, l'intensità ANAP può anche essere monitorata in relativo isolamento utilizzando filtri passa-banda. La Figura 5B illustra le proprietà spettrali di due di questi filtri. Il filtro passa banda 470/10 nm scherma efficacemente il segnale di fluorescenza da TNP-ATP e si sovrappone bene alla fluorescenza ANAP di picco. Tuttavia, la trasmittanza di picco di questo filtro è solo del 50% circa, il che può rendere difficile ottenere buoni segnali da membrane deboli (o in patch di membrana asportate sotto morsetto di tensione). Un'altra opzione è un filtro passa banda 460/60 nm. C'è una sovrapposizione leggermente maggiore tra il filtro 460/60 nm e il piede del picco di emissione TNP-ATP rispetto al filtro 470/10 nm. Tuttavia, il passaggio di banda 460/60 nm ha una trasmittanza del 90-95% su un ampio intervallo del picco ANAP, che dovrebbe aumentare il segnale di emissione di fluorescenza.
ANAP è un fluoroforo 12,26,27 sensibile all'ambiente. L'emissione di picco e la resa quantica variano a seconda del sito di incorporazione sulla proteina di interesse e possono cambiare quando la proteina cambia conformazione. Tali cambiamenti sarebbero immediatamente evidenti dagli spettri di emissione, ma non sarebbero altrettanto evidenti quando l'intensità ANAP viene misurata usando filtri. In ogni caso, sono necessari controlli appropriati per dimostrare che il segnale di fluorescenza non varia a causa dei cambiamenti nell'ambiente locale intorno all'ANAP successivi al legame nucleotidico. Esperimenti di controllo con nucleotidi non marcati possono aiutare a verificare che eventuali cambiamenti nell'intensità di ANAP siano il risultato di FRET tra nucleotidi ANAP e TNP. I nucleotidi TNP possono legarsi in modo non specifico alle membrane derivate da cellule non trasfettate (alla membrana plasmatica o alle proteine native della membrana)10. Quantifichiamo il legame come un decremento nella fluorescenza del donatore, poiché questo segnale è specifico per il canale etichettato. Tuttavia, raccomandiamo di eseguire ulteriori esperimenti di controllo per ciascuna coppia agonista/recettore, ad esempio mutando il sito di legame nucleotidico se noto, per verificare che il cambiamento nella fluorescenza del donatore sia realmente il risultato del legame diretto al recettore marcato11. Infine, si raccomanda di lavorare con costrutti che contengono un tag proteico fluorescente oltre all'etichetta ANAP. Questo aiuta a differenziare la fluorescenza del recettore marcato dallo sfondo / autofluorescenza. La fluorescenza di fondo può essere distinta dall'ANAP dal picco e dalla forma degli spettri di emissione10, ma tali determinazioni possono essere molto difficili quando vengono utilizzati solo set di filtri. Inoltre, le cellule e le membrane senza tetto che esprimono recettori fluorescenti possono essere identificate utilizzando il tag proteico fluorescente senza dover eccitare l'ANAP e rischiare un eccessivo fotosbiancamento.
In molti dei nostri record PCF, abbiamo osservato un forte picco negativo nei nostri spettri ad alte concentrazioni di TNP-ATP (Figura 4C). Questo picco negativo è un artefatto del nostro protocollo di sottrazione dello sfondo. La Figura 4D mostra immagini fluorescenti e in campo chiaro di una pipetta patch esposta a 1 mM TNP-ATP. È evidente un'ombra sulla punta della pipetta, risultante dall'esclusione di TNP-ATP dal volume delle pareti della pipetta, che è più evidente all'interno del piano di messa a fuoco. L'immagine spettrale nella Figura 4E mostra una banda scura, corrispondente a questa ombra. Quando una regione sopra o sotto questa banda scura viene utilizzata per la sottrazione dello sfondo, produce un picco negativo. È importante sottolineare che questo picco si è verificato su un intervallo di lunghezze d'onda corrispondente all'emissione di TNP-ATP e non ha influenzato le nostre misurazioni della tempra ANAP.
La principale limitazione dei nostri esperimenti è stata quella di ottenere un'adeguata espressione della membrana plasmatica di costrutti marcati con ANAP per misurare la fluorescenza. In genere era più facile acquisire spettri di alta qualità da membrane non coperte che in PCF, grazie alle loro dimensioni maggiori e alla nostra capacità di scansionare rapidamente un intero piatto di membrane non coperte, a differenza del PCF dove i cerotti possono essere ottenuti solo uno alla volta. Nei nostri esperimenti, i dati delle membrane senza tetto e degli esperimenti PCF erano simili ma non equivalenti (Figura 6) 11. Tuttavia, non vi è alcuna ragione a priori per cui questa dovrebbe essere un'osservazione universale poiché le proteine in una pipetta patch possono essere in uno stato funzionale diverso da quelle nelle membrane senza tetto.
Qui, sono stati fatti tentativi per massimizzare l'espressione dei nostri costrutti marcati ANAP, in particolare abbassando la temperatura della coltura cellulare a 33 ° C10,11,16. Nella nostra esperienza, il tentativo di identificare i siti nella proteina in cui ANAP sarebbe una sostituzione conservativa non ha portato costantemente a costrutti che si esprimevano bene. Abbiamo avuto più successo scansionando sistematicamente intere regioni proteiche per i siti di incorporazione ANAP e selezionando i candidati per l'espressione superficiale10. Il sistema di marcatura ANAP funziona anche negli ovociti di Xenopus laevis, che consente di asportare patch di membrana molto più grandi, aumentando così il segnale al rumore26,27,28.
Mentre ci si aspetta che livelli di espressione più elevati si traducano in segnali più luminosi, il numero minimo di canali richiesto per misurare la fluorescenza dipende da diversi fattori, tra cui la luminosità del fluoroforo, il grado di fotosbiancamento, l'intensità della luce di eccitazione e il piano di messa a fuoco. In teoria, le stime potrebbero essere fatte correlando l'intensità della fluorescenza e la corrente del canale come è stato mostrato in precedenza28,29. Tuttavia, l'affidabilità di tali stime richiede una certa conoscenza della conduttanza a canale singolo e della probabilità aperta del canale. Oltre ai fattori sopra elencati, il segnale di fluorescenza sarà influenzato anche da canali associati a vescicole o sezioni della membrana plasmatica attaccate al vetro della pipetta che non sono sotto morsetto di tensione.
Questo metodo è facilmente adattabile allo studio di altri canali ionici sensibili ai nucleotidi. CFTR è strutturalmente simile alla subunità accessoria del recettore della sulfonilurea di KATP30,31. Come il gating KATP CFTR è controllato dal legame nucleotidico, rendendolo un ovvio obiettivo futuro del nostro metodo7. I recettori purinergici P2X sono canali ionici controllati dall'ATP9 extracellulare. TNP-ATP agisce come antagonista per i recettori P2X32,33. Pertanto, non sarà utile per studiare l'attivazione P2X, sebbene possa essere utilizzato in saggi di competizione con agonisti P2X. In alternativa, altri derivati fluorescenti dell'ATP con sufficiente sovrapposizione spettrale con emissione ANAP possono essere utilizzati per studiare l'attivazione. Alexa-647-ATP è un agonista fluorescente P2X34. L'R0 calcolato tra Alexa-647 e ANAP è ~ 85 Å, il che significa che il legame diretto a P2X dovrebbe comportare una sostanziale tempra di ANAP incorporato nel canale. Tuttavia, un R0 così lungo comporterà anche la tempra da Alexa-647-ATP legato alle subunità vicine e aumenta la probabilità che il legame nucleotidico non specifico si traduca in FRET. Poiché il sito di legame del ligando nei recettori P2X è extracellulare, le misurazioni di legame verrebbero eseguite su cellule intatte, in morsetti di tensione dell'intera cellula o in patch di membrana esterne. Il nostro metodo può anche essere esteso allo studio del legame e dell'attivazione di trasportatori e pompe elettrogenici e non elettrogeni che dipendono dall'ATP per il loro ciclo di reazione e dei recettori P2Y accoppiati a proteine G. Infine, anche se abbiamo sviluppato questo metodo per misurare il legame nucleotidico dell'adenina (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), lo stesso approccio può essere utilizzato per studiare il legame praticamente a qualsiasi recettore per il quale è stato identificato un ligando fluorescente adatto.

Diverse importanti classi di proteine sono direttamente regolate dal legame del ligando. Questi vanno dagli enzimi solubili alle proteine incorporate nella membrana, tra cui il recettore tirosin-chinasi, i recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) e i canali ionici. I GPCR e i canali rappresentano ~ 34% e ~ 15% di tutti gli attuali bersagli farmacologici, rispettivamente 1,2. Pertanto, vi è un notevole interesse biochimico e medico nello sviluppo di metodi che forniscono intuizioni meccanicistiche sulle interazioni ligando-recettore. I metodi tradizionali per misurare il legame del ligando, tra cui l'etichettatura della fotoaffinità e gli studi sul legame del radioligando, richiedono grandi quantità di proteine parzialmente purificate e sono tipicamente eseguiti in condizioni e scale temporali non fisiologiche. Un metodo ideale richiederebbe solo piccole quantità di proteine, potrebbe essere eseguito su proteine intatte espresse in un ambiente cellulare o di membrana, potrebbe essere monitorato in tempo reale e sarebbe compatibile con letture dirette della funzione proteica.
Il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) è un metodo che rileva la vicinanza tra due molecole marcate con fluorescenza3. La FRET si verifica quando un fluoroforo donatore eccitato trasferisce energia in modo non radiativo a una molecola accettore (tipicamente un altro fluoroforo). Il trasferimento di energia provoca l'estinzione dell'emissione di fluorescenza del donatore e la sensibilizzazione dell'emissione dell'accettore (se l'accettore è un fluoroforo). L'efficienza di trasferimento dipende dalla 6apotenza della distanza tra il donatore e l'accettore. Inoltre, il donatore e l'accettore devono essere in prossimità (di solito meno di 10 nm) affinché si verifichi la FRET. Come tale, FRET può essere sfruttato per misurare il legame diretto tra un recettore proteico marcato fluorescentmente e un ligando fluorescente.
Diverse proteine diverse sono regolate o attivate legando nucleotidi adenina intracellulari o extracellulari (ATP, ADP, AMP, cAMP). Molte proteine trasportatrici richiedono l'idrolisi dell'ATP per il loro ciclo di reazione, compresi i trasportatori di cassette leganti l'ATP e le ATPasi di tipo P come la pompa Na+/K+ 4,5. I canali K+ (K ATP) sensibiliall'ATP, il regolatore della conduttanza transmembrana della fibrosi cistica (CFTR) e i canali regolati dai nucleotidi ciclici sono tutti canali ionici che sono controllati dal legame dei nucleotidi adenina intracellulari, rendendoli squisitamente sensibili ai cambiamenti nel metabolismo cellulare e nella trasduzione del segnale 6,7,8. I recettori purinergici P2X e P2Y rispondono ai cambiamenti nell'ATP extracellulare, che può essere rilasciato come neurotrasmettitore o come risultato di danni tissutali9. Abbiamo sviluppato un saggio basato su FRET per la misura del legame dei nucleotidi adenina alle proteine di membrana in tempo reale. Abbiamo precedentemente applicato questo metodo per studiare il legame nucleotidico ai canali KATP 10,11.
Per misurare il legame nucleotidico tramite FRET, una proteina di interesse deve prima essere marcata con un fluoroforo. Il tag fluorescente deve essere inserito in modo specifico nella proteina di interesse in modo che sia abbastanza vicino al sito di legame del ligando perché si verifichi la FRET, con particolare attenzione per garantire che il tag non influenzi la struttura e la funzione generale della proteina. Per fare ciò, impieghiamo una tecnica sviluppata da Chatterjee et al., utilizzando la soppressione del codone di arresto ambrato per inserire un amminoacido fluorescente non canonico (l-3-(6-acetilnaftalene-2-ilammino)-2-amminopropionico; ANAP) nel sito desiderato12. Misuriamo il legame nucleotidico come FRET tra proteine marcate con ANAP e derivati nucleotidici fluorescenti del trinitrofenile (TNP) (Figura 1A). Lo spettro di emissione per ANAP si sovrappone allo spettro di assorbanza dei nucleotidi TNP, una condizione necessaria affinché si verifichi la FRET (Figura 1B). Qui delineiamo due diversi tipi di esperimento di legame. Nel primo, il legame nucleotidico al lato intracellulare dei canali KATP marcati con ANAP viene misurato in cellule che sono state scoperte dalla sonicazione lasciando frammenti aderenti di membrana plasmatica su un vetrino di copertura10,11,13,14.
Nel secondo metodo, il legame nucleotidico ai canali KATP marcati con ANAP viene misurato in un patch di membrana sotto morsetto di tensione, consentendo la misurazione simultanea delle correnti ioniche e della fluorescenza. Combinando questi due approcci sperimentali, i cambiamenti nel legame possono essere direttamente correlati con i cambiamenti nella funzione del canale11. Vengono discussi i risultati tipici, le potenziali insidie e l'analisi dei dati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

Abbiamo sviluppato un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori transmembrana intatti e funzionali in un ambiente cellulare o di membrana. Questo metodo combina l'espressione di proteine marcate con l'amminoacido fluorescente non canonico ANAP e FRET tra ANAP e derivati nucleotidici fluorescenti (trinitrofenili). Presentiamo esempi di legame nucleotidico a canali ionici KATP marcati con ANAP misurati in membrane plasmatiche senza tetto e patch di membrana asportate e inside-out sotto morsetto di tensione. Quest'ultimo consente misurazioni simultanee del legame del ligando e della corrente del canale, una lettura diretta della funzione proteica. Il trattamento e l'analisi dei dati sono ampiamente discussi, insieme a potenziali insidie e artefatti. Questo metodo fornisce ricche intuizioni meccanicistiche sul gating ligando-dipendente dei canali KATP e può essere facilmente adattato allo studio di altre proteine regolate da nucleotidi o di qualsiasi recettore per il quale può essere identificato un ligando fluorescente adatto.

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Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Questo protocollo presenta un metodo per misurare il legame dei nucleotidi adenina ai recettori in tempo reale in un ambiente cellulare. Il legame è misurato come trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) tra derivati del nucleotide trinitrofenile e proteine marcate con un amminoacido fluorescente non canonico.

Misurare il legame nucleotidico a proteine di membrana intatte e funzionali in tempo reale

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Poiché l'ATP è un importante messaggero cellulare, abbiamo sviluppato un metodo che ci consente di misurare il legame dell'ATP ai suoi recettori con alta precisione. Utilizzando FRET tra derivati nucleotidici e proteine marcate fluorescentmente, possiamo monitorare il legame nucleotidico ai recettori funzionali intatti in tempo reale e con un'eccellente risoluzione spaziale. Usiamo questo metodo per comprendere gli effetti del metabolismo cellulare sul canale del potassio sensibile all'ATP, che è implicato in alcune forme di diabete.Per impostare un esperimento di membrana senza tetto, utilizzare prima un paio di pinze per rompere un piccolo frammento da un vetrino di copertura con cellule trasfettate e sciacquare il frammento con PBS. Se il vetrino di copertura è pre-rivestito con polilisina, posizionare il frammento sul fondo di un piatto da 35 millimetri contenente due millilitri di PBS e tenere un sonicatore a sonda da tre millimetri da tre a cinque millimetri sopra il campione, che pulsa a 50 watt e da 20 a 40% di ampiezza per 200-500 millisecondi per aprire il tetto delle celle. Se i vetrini di copertura non sono pre-rivestiti, dopo il risciacquo con PBS, immergere il frammento in un tubo contenente lo 0,1% di poli-L-lisina per circa 30 secondi prima di aprire le celle con una breve sonicazione come dimostrato.Trasferire il frammento sonicato in un piatto di vetro coperto da 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione da bagno e montare il piatto su un microscopio invertito dotato di un obiettivo ad immersione in acqua 60x ad alta apertura numerica. Verificare che la porta della telecamera del microscopio sia collegata a uno spettrografo in serie con una camera CCD ad alta sensibilità e utilizzare una pompa peristaltica per perfondere la camera da bagno con tampone a una portata da 0,5 a un millilitro di tampone al minuto. Per identificare frammenti di membrana senza tetto che esprimono il canale marcato ANAP, visualizzare il campione per individuare membrane con canali fluorescenti.Inserire parzialmente la maschera dello spettrometro tra la porta della telecamera sul microscopio e lo spettrografo. L'ombra della maschera apparirà sull'immagine della fotocamera. Acquisire un'immagine di campo luminoso e fluorescenza della membrana non coperta per consentire la selezione della regione di interesse per l'analisi.Avvicinare la punta del sistema di perfusione a microvolume alla membrana non coperta. Per acquisire un'immagine della fluorescenza ANAP, eccitare la membrana con un LED a 385 nanometri attraverso un filtro di eccitazione passa banda 390/18 nanometri e un bordo dicroico a 416 nanometri, raccogliendo la luce emessa attraverso un filtro di emissione longpass a 400 nanometri. Attivare la maschera dello spettrometro e assicurarsi che la luce emessa venga attraversata.Allineare la regione di interesse con la fessura della maschera dello spettrometro. Attivare le griglie dello spettrometro. Con le griglie in posizione, la luce diffratta dallo spettrometro verrà proiettata sul chip della camera CCD per produrre immagini spettrali.Le immagini manterranno le informazioni spaziali nella dimensione Y. La dimensione X verrà sostituita con la lunghezza d'onda. Durante la fusione con la soluzione tampone priva di nucleotidi, ottenere una o più esposizioni da 0,1 a dieci secondi per la correzione a valle e la normalizzazione dei dati raccolti durante il resto dell'esperimento.Quindi, applicare un intervallo di concentrazioni di TNP ATP nella soluzione di bagno per stabilire una curva di risposta alla concentrazione, perfondendo ciascuna soluzione per almeno un minuto per garantire che venga raggiunto uno stato stazionario e ottenere un'esposizione per ciascuna concentrazione. Dopo ogni concentrazione, lavare il TNP ATP con una soluzione di bagno priva di nucleotidi per almeno un minuto prima di acquisire un'immagine di esposizione post-trattamento. Per eseguire un esperimento di fluorometria patch-clamp, prima tirare pipette patch da capillari di vetro borosilicato a parete spessa a una resistenza da 1,5 a 2,5 megaohm quando riempite con soluzione di pipetta.Quindi, trasferire un vetrino di copertura con cellule trasfettate in un piatto di vetro da 35 millimetri contenente due millilitri di soluzione da bagno e montare il piatto sul microscopio invertito. Perfondere la camera da bagno con la soluzione da bagno e identificare una cellula che esprime canali marcati ANAP. Applicare una leggera pressione positiva su una pipetta patch e posizionare la pipetta in una camera da bagno.Premere la pipetta contro la membrana della cella e applicare un'aspirazione delicata per ottenere una tenuta gigaohm. Per asportare il cerotto, allontanare rapidamente il portapipette dalla cella rattoppata. Avvicinare la punta della pipetta del cerotto alla punta del sistema di perfusione e verificare che il cerotto si trovi all'interno della fessura della maschera dello spettrometro.Quindi applicare TNP ATP e raccogliere spettri di immagine. In queste immagini, si può osservare un tipico frammento di membrana senza tetto proveniente da una cellula HEK293T che esprime canali del potassio sensibili all'ATP marcati con proteina fluorescente arancione. In questa immagine spettrale dei canali del potassio sensibili all'ATP marcati ANAP in una membrana senza tetto da una cellula HEK293T esposta a cinque micromolari TNP ATP, si possono osservare due regioni di alta intensità che corrispondono al picco di emissione di ANAP e TNP ATP.Uno spettro finale può essere ottenuto sottraendo lo spettro di fondo medio dallo spettro medio della regione di interesse. Qui si può osservare la riduzione del picco di fluorescenza ANAP dopo esposizioni multiple. Il picco di fluorescenza da diverse esposizioni in assenza di TNP ATP è stato adattato a un singolo decadimento esponenziale.Questi dati sono stati poi utilizzati per correggere gli artefatti fotosbiancanti. Qui vengono mostrate immagini spettrali rappresentative da una membrana senza tetto ottenute da una cellula che esprime canali del potassio sensibili all'ATP marcati ANAP in assenza e la presenza di TNP ATP. L'osservazione degli spettri di emissione corretti rivela una netta separazione tra l'emissione fluorescente del donatore e dell'accettore.In questa figura, vengono mostrate correnti e spettri rappresentativi dei canali del potassio sensibili all'ATP marcati con ANAP da un tipico esperimento di fluorometria patch-clamp. Gli spettri di emissione sono corretti per lo sfondo e lo sbiancamento come dimostrato per le membrane senza tetto. Prestare attenzione ai controlli per verificare che il segnale fluorescente sia specifico per il recettore.Assicurati che la tua profusione sia veloce, efficiente e completa e mantieni le tue esposizioni il più brevi possibile. Questo metodo risponde alle domande sull'occupazione del recettore e su come si relaziona alla funzione. Altre tecniche FRET utilizzate con una configurazione simile possono sondare i cambiamenti di conferma indotti dal ligando nel recettore.

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