Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
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우수한 기술 지원을 해주신 Raul Terron Exposito에게 감사드립니다. 이 연구는 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회(BB/R002517/1; MCP 및 FMA) 및 Wellcome Trust(203731/Z/16/A; SGU)

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저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 손상되지 않은 막 단백질에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정하는 방법을 개발했습니다. 우리의 방법은 호박색 정지 코돈 억제 12, 세포 지붕 제거14 및 전압 클램프 형광 측정법 / PCF 19,20,21,22,23,24,25를 사용하여 ANAP로 단백질을 표지하는 것을 포함하여 몇 가지 다른 확립 된 기술을 기반으로합니다. 이러한 접근법의 합성은 높은 공간 및 시간 분해능으로 뉴클레오티드 결합의 측정을 가능하게 합니다. 실제로, 우리의 이전 연구에서, 우리는이 접근법10,11을 사용하여 동일한 단백질 복합체 상의 상이한 결합 부위를 구별 할 수 있었다. 중요하게도, 이 기술은 단백질 기능을 보존하는 조건 하에서 세포 환경에서 소량의 단백질에 직접 적용될 수 있다. 이온 채널 전류의 직접적인 전기생리학적 판독과 함께 당사의 결합 방법을 사용하면 채널 게이팅11의 분자 토대에 대한 풍부한 통찰력을 얻을 수 있습니다.
분광계는 비표준 실험실 장비이기 때문에 대역 통과 필터를 사용하여 상대적으로 격리된 상태에서 ANAP 강도를 모니터링할 수도 있습니다. 도 5b 는 2개의 이러한 필터들의 스펙트럼 특성들을 도시한다. 470/10nm 대역 통과 필터는 TNP-ATP의 형광 신호를 효과적으로 차단하고 피크 ANAP 형광과 잘 겹칩니다. 그러나 이 필터의 피크 투과율은 약 50%에 불과하므로 희미한 멤브레인(또는 전압 클램프 하에서 절제된 멤브레인 패치)에서 좋은 신호를 얻기 어려울 수 있습니다. 또 다른 옵션은 460/60nm 대역 통과 필터입니다. 460/60 nm 필터와 470/10 nm 필터에 비해 TNP-ATP 방출 피크의 발 사이에는 약간 더 많은 겹침이 있습니다. 그러나 460/60nm 대역 통과는 광범위한 ANAP 피크에 걸쳐 90-95%의 투과율을 가지며, 이는 형광 방출 신호를 증가시킬 것으로 예상됩니다.
ANAP는 환경에 민감한 형광단 12,26,27입니다. 피크 방출 및 양자 수율은 관심 단백질의 결합 부위에 따라 달라지며 단백질의 형태가 변함에 따라 변할 수 있습니다. 이러한 변화는 방출 스펙트럼에서 즉시 분명하지만 필터를 사용하여 ANAP 강도를 측정할 때는 명확하지 않습니다. 어쨌든, 뉴클레오티드 결합 이후 ANAP 주변의 국소 환경의 변화로 인해 형광 신호가 변하지 않는다는 것을 입증하기 위해서는 적절한 제어가 필요합니다. 표지되지 않은 뉴클레오티드를 사용한 대조 실험은 ANAP 강도의 변화가 ANAP와 TNP-뉴클레오티드 사이의 FRET의 결과인지 확인하는 데 도움이 될 수 있습니다. TNP-뉴클레오타이드는 형질감염되지 않은 세포에서 유래한 세포막(원형질막 또는 천연 막 단백질)에 비특이적으로 결합할 수 있습니다.10. 우리는 결합을 도너 형광의 감소로 정량화하는데, 이 신호는 표지된 채널에 특이적이기 때문입니다. 그러나 각 작용제/수용체 쌍에 대해 추가 제어 실험(예: 알려진 경우 뉴클레오티드 결합 부위 돌연변이)을 수행하여 공여체 형광의 변화가 실제로 표지된 수용체11에 직접 결합한 결과인지 확인하는 것이 좋습니다. 마지막으로, ANAP 라벨 외에 형광 단백질 태그를 포함하는 구조물로 작업하는 것이 좋습니다. 이는 표지된 수용체 형광을 배경/자가형광과 구별하는 데 도움이 됩니다. 배경 형광은 방출 스펙트럼(10)의 피크 및 형상에 의해 ANAP와 구별될 수 있지만, 이러한 결정은 필터 세트만이 사용될 때 매우 어려울 수 있다. 또한 형광 수용체를 발현하는 세포 및 지붕이 없는 막은 ANAP를 자극하고 과도한 광표백의 위험 없이 형광 단백질 태그를 사용하여 식별할 수 있습니다.
많은 PCF 기록에서 우리는 높은 TNP-ATP 농도에서 스펙트럼에서 강한 음의 피크를 관찰했습니다(그림 4C). 이 음의 피크는 배경 빼기 프로토콜의 인공물입니다. 그림 4D 는 1mM TNP-ATP에 노출된 패치 피펫의 명시야 및 형광 이미지를 보여줍니다. 피펫 팁의 그림자는 피펫 벽의 부피에서 TNP-ATP를 제외했기 때문에 분명하며, 이는 초점면 내에서 가장 분명합니다. 그림 4E 의 스펙트럼 이미지는 이 그림자에 해당하는 어두운 띠를 보여줍니다. 이 어두운 띠 위 또는 아래 영역을 배경 빼기에 사용하면 음의 피크가 생성됩니다. 중요하게도, 이 피크는 TNP-ATP 방출에 해당하는 파장 범위에서 발생했으며 ANAP 담금질 측정에 영향을 미치지 않았습니다.
우리 실험의 주요 한계는 형광을 측정하기 위해 ANAP 태그 구조의 적절한 원형질막 발현을 얻는 데 있었습니다. 패치를 한 번에 하나씩만 얻을 수 있는 PCF와 달리 PCF보다 지붕이 없는 멤브레인에서 고품질 스펙트럼을 얻는 것이 일반적으로 더 쉬웠는데, 이는 크기가 더 크고 지붕이 없는 멤브레인의 전체 접시를 빠르게 스캔할 수 있기 때문입니다. 우리의 실험에서, 지붕이 없는 멤브레인과 PCF 실험의 데이터는 유사했지만 동등하지는 않았습니다(그림 6)11. 그러나 패치 피펫의 단백질이 지붕이 없는 막의 단백질과 다른 기능 상태에 있을 수 있기 때문에 이것이 보편적인 관찰이 되어야 하는 선험적 이유는 없습니다.
여기서, 당사의 ANAP-태깅된 구축물의 발현을 최대화하기 위한 시도가 이루어졌으며, 특히 세포 배양 온도를 33°C10,11,16으로 낮추었다. 우리의 경험에 비추어 볼 때, ANAP가 보존적 치환이 될 단백질의 부위를 확인하려는 시도는 일관되게 잘 발현되는 구조를 초래하지 않았습니다. 우리는 ANAP 통합 부위에 대해 전체 단백질 영역을 체계적으로 스캔하고 표면 발현10에 대한 후보를 스크리닝하는 데 더 많은 성공을 거두었습니다. ANAP 라벨링 시스템은 Xenopus laevis 난모세포에서도 작동하여 훨씬 더 큰 멤브레인 패치를 절제할 수 있으므로 신호 대 잡음26,27,28이 증가합니다.
발현 수준이 높을수록 신호가 더 밝아질 것으로 예상되지만, 형광을 측정하는 데 필요한 최소 채널 수는 형광단의 밝기, 광표백 정도, 여기광의 강도 및 초점면을 비롯한 여러 요인에 따라 달라집니다. 이론적으로, 이전에 표시된 바와 같이 형광 강도와 채널 전류를 연관시킴으로써 추정할 수 있습니다28,29. 그러나 이러한 추정치의 신뢰성을 위해서는 단일 채널 컨덕턴스와 채널의 개방 확률에 대한 지식이 필요합니다. 위에 나열된 요인 외에도 형광 신호는 소포와 관련된 채널 또는 전압 클램프가 아닌 피펫 유리에 부착된 원형질막 섹션의 영향을 받습니다.
이 방법은 다른 뉴클레오티드에 민감한 이온 채널의 연구에 쉽게 적용됩니다. CFTR은 구조적으로KATP30,31의 부속 설포닐우레아 수용체 서브유닛과 유사하다. KATP CFTR 게이팅과 마찬가지로 뉴클레오티드 결합에 의해 제어되므로 우리 방법7의 명백한 미래 목표가 됩니다. 퓨린성 P2X 수용체는 세포외 ATP9에 의해 개폐되는 이온 채널입니다. TNP-ATP는 P2X 수용체32,33에 대한 길항제로 작용합니다. 따라서 P2X 작용제와의 경쟁 분석에 사용될 수 있지만 P2X 활성화를 연구하는 데는 유용하지 않습니다. 대안적으로, ANAP 방출과 충분한 스펙트럼 중첩을 갖는 다른 형광 ATP 유도체가 활성화 연구에 사용될 수 있다. Alexa-647-ATP는 형광 P2X 작용제(34)이다. Alexa-647과 ANAP 사이의 계산된R0 는 ~85 Å이며, 이는 P2X에 대한 직접 결합이 채널에 통합된 ANAP의 상당한 담금질을 초래해야 함을 의미합니다. 그러나 이러한 긴R0은 또한 Alexa-647-ATP에서 이웃 서브유닛으로 결합하는 퀀칭을 초래하고 비특이적 뉴클레오티드 결합이 FRET를 초래할 가능성을 증가시킵니다. P2X 수용체의 리간드 결합 부위는 세포 외이기 때문에 결합 측정은 손상되지 않은 세포, 전체 세포 전압 클램프 또는 외부 막 패치에서 수행됩니다. 우리의 방법은 또한 G 단백질 결합 P2Y 수용체뿐만 아니라 반응 주기에 ATP에 의존하는 전기성 및 비전기적 수송체 및 펌프의 결합 및 활성화를 연구하기 위해 확장될 수 있습니다. 마지막으로, 아데닌 뉴클레오티드 결합(TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP)을 측정하기 위해 이 방법을 개발했지만, 적합한 형광 리간드가 확인된 거의 모든 수용체에 대한 결합을 연구하는 데 동일한 접근 방식을 사용할 수 있습니다.

단백질의 몇 가지 중요한 부류는 리간드 결합에 의해 직접 조절됩니다. 여기에는 수용성 효소에서 수용체 티로신 키나아제, G 단백질 결합 수용체(GPCR) 및 이온 채널을 포함한 막 내장 단백질에 이르기까지 다양합니다. GPCR과 채널은 현재 모든 약물 표적의 ~34% 및 ~15%를 각각차지합니다 1,2. 따라서 리간드-수용체 상호 작용에 대한 기계론적 통찰력을 제공하는 방법을 개발하는 데 상당한 생화학적 및 의학적 관심이 있습니다. 광친화성 표지 및 방사성 리간드 결합 연구를 포함한 리간드 결합 측정을 위한 전통적인 방법은 다량의 부분적으로 정제된 단백질을 필요로 하며 일반적으로 비생리학적 조건 및 시간 척도 하에서 수행됩니다. 이상적인 방법은 소량의 단백질만 필요로 하고, 세포 또는 막 환경에서 발현되는 온전한 단백질에 대해 수행할 수 있고, 실시간으로 모니터링할 수 있으며, 단백질 기능의 직접 판독과 호환됩니다.
Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 형광 태그가 부착된 두 분자3 사이의 근접성을 감지하는 방법입니다. FRET는 여기된 기증자 형광단이 비방사 방식으로 수용체 분자(일반적으로 다른 형광단)에 에너지를 전달할 때 발생합니다. 에너지 전달은 공여체 형광 방출의 소멸 및 수용체 방출의 감작을 초래합니다(수용체가 형광단인 경우). 전달 효율은 공여체와 수용체 사이의 거리의6승에 의존한다. 또한 FRET가 발생하려면 기증자와 수용자가 근접(보통 10nm 미만)에 있어야 합니다. 따라서 FRET는 형광 표지된 단백질 수용체와 형광 리간드 사이의 직접적인 결합을 측정하는 데 활용될 수 있습니다.
몇몇 상이한 단백질은 세포내 또는 세포외 아데닌 뉴클레오티드(ATP, ADP, AMP, cAMP)에 결합하여 조절되거나 활성화된다. 많은 수송체 단백질은 ATP 결합 카세트 수송체 및 Na+/K+ 펌프 4,5와 같은 P형 ATPase를 포함하여 반응 주기를 위해 ATP 가수분해를 필요로 합니다. ATP-민감성 K+ (KATP) 채널, 낭포성 섬유증 막횡단 전도도 조절제(CFTR) 및 고리형 뉴클레오티드 조절 채널은 모두 세포내 아데닌 뉴클레오티드의 결합에 의해 개폐되는 이온 채널로, 세포 대사 및 신호 전달의 변화에 매우 민감합니다 6,7,8 . 퓨린성 P2X 및 P2Y 수용체는 세포외 ATP의 변화에 반응하며, 이는 신경전달물질로 방출되거나 조직 손상으로 인해 방출될 수 있다9. 우리는 막 단백질에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정하기 위한 FRET 기반 분석법을 개발했습니다. 우리는 이전에 KATP 채널10,11에 대한 뉴클레오티드 결합을 연구하기 위해 이 방법을 적용했습니다.
FRET를 통한 뉴클레오티드 결합을 측정하려면 먼저 관심 단백질에 형광단을 부착해야 합니다. 형광 태그는 FRET가 발생할 수 있는 리간드 결합 부위에 충분히 가깝도록 관심 단백질에 부위 특이적으로 삽입되어야 하며, 태그가 단백질의 전체 구조와 기능에 영향을 미치지 않도록 특별한 주의를 기울여야 합니다. 이를 달성하기 위해 우리는 호박색 정지 코돈 억제를 사용하여 형광 비표준 아미노산(l-3-(6-아세틸나프탈렌-2-일아미노)-2-아미노프로피온산; ANAP)를 원하는 사이트12에 배치한다. 우리는 ANAP 표지 단백질과 형광 트리니트로페닐(TNP) 뉴클레오티드 유도체 사이의 FRET로 뉴클레오티드 결합을 측정합니다(그림 1A). ANAP의 방출 스펙트럼은 FRET가 발생하는 데 필요한 조건인 TNP-뉴클레오티드의 흡광도 스펙트럼과 겹칩니다(그림 1B). 여기서는 두 가지 유형의 결합 실험에 대해 간략하게 설명합니다. 첫 번째로, ANAP 표지된 KATP 채널의 세포내 측면에 대한 뉴클레오티드 결합은 초음파 처리에 의해 지붕이 없는 세포에서 측정되어 유리 커버 슬립10,11,13,14 상에 원형질막의 부착성 단편을 남긴다.
두 번째 방법에서는 전압 클램프 하에서 멤브레인 패치에서 ANAP 표지된 KATP 채널에 대한 뉴클레오티드 결합을 측정하여 이온 전류와 형광을 동시에 측정할 수 있습니다. 이들 두 가지 실험적 접근법을 결합함으로써, 결합의 변화는 채널 함수(11)의 변화와 직접적으로 상관될 수 있다. 일반적인 결과, 잠재적 함정 및 데이터 분석에 대해 설명합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

우리는 세포 또는 막 환경에서 손상되지 않은 기능적 막횡단 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드의 결합을 측정하는 방법을 개발했습니다. 이 방법은 ANAP와 형광(트리니트로페닐) 뉴클레오티드 유도체 사이에 형광 비표준 아미노산 ANAP와 FRET로 태그된 단백질의 발현을 결합합니다. 우리는 지붕이 없는 원형질막에서 측정된 ANAP 태그가 부착된 KATP 이온 채널에 대한 뉴클레오티드 결합의 예를 제시하고 전압 클램프 하에서 절제된 내부 멤브레인 패치를 제시합니다. 후자는 리간드 결합과 채널 전류를 동시에 측정하여 단백질 기능을 직접 판독할 수 있습니다. 데이터 처리 및 분석은 잠재적인 함정 및 인공물과 함께 광범위하게 논의됩니다. 이 방법은 KATP 채널의 리간드 의존성 게이팅에 대한 풍부한 기계론적 통찰력을 제공하며 다른 뉴클레오티드-조절된 단백질 또는 적합한 형광 리간드가 확인될 수 있는 임의의 수용체의 연구에 용이하게 적용될 수 있다.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

이 프로토콜은 세포 환경에서 실시간으로 수용체에 대한 아데닌 뉴클레오티드 결합을 측정하는 방법을 제시합니다. 결합은 트리니트로페닐 뉴클레오티드 유도체와 비표준 형광 아미노산으로 표지된 단백질 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)로 측정됩니다.

온전한 기능성 막 단백질에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 측정

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

ATP는 중요한 세포 메신저이기 때문에 우리는 수용체에 대한 ATP 결합을 매우 정밀하게 측정할 수 있는 방법을 개발했습니다. 뉴클레오티드 유도체와 형광 태그가 부착된 단백질 사이에 FRET를 사용하여 온전한 기능적 수용체에 대한 뉴클레오티드 결합을 실시간으로 우수한 공간 분해능으로 모니터링할 수 있습니다. 우리는 이 방법을 사용하여 특정 형태의 당뇨병과 관련된 ATP 민감성 칼륨 채널에 대한 세포 대사의 영향을 이해합니다.지붕이 없는 멤브레인 실험을 설정하려면 먼저 한 쌍의 집게를 사용하여 형질감염된 세포가 있는 커버 슬립에서 작은 조각을 부수고 PBS로 조각을 헹굽니다. 커버 슬립이 폴리리신으로 사전 코팅된 경우 2밀리리터의 PBS가 들어 있는 35mm 접시의 바닥에 조각을 놓고 샘플 위의 3mm 프로브 초음파 처리기를 3-5mm 위로 잡고 200-500밀리초 동안 50와트 및 20-40% 진폭으로 펄스하여 셀의 지붕을 뜯습니다. 커버 슬립이 미리 코팅되지 않은 경우 PBS로 헹군 후 0.1% 폴리-L-라이신이 들어있는 튜브에 조각을 약 30 초 동안 담그고 간단한 초음파 처리로 세포를 지붕을 뜯습니다.초음파 처리 된 조각을 2 밀리리터의 목욕 용액이 들어있는 덮인 유리 바닥 35 밀리미터 접시로 옮기고 높은 수치 조리개 60x 침수 대물렌즈가 장착 된 도립 현미경에 접시를 장착합니다. 현미경의 카메라 포트가 고감도 CCD 카메라와 직렬로 분광기에 연결되어 있는지 확인하고 연동 펌프를 사용하여 분당 0.5-1밀리리터의 버퍼 유속으로 버퍼로 욕조 챔버를 관류합니다. ANAP 표지 채널을 발현하는 지붕이 없는 멤브레인 단편을 식별하려면 샘플을 보고 형광 채널이 있는 멤브레인을 찾습니다.현미경의 카메라 포트와 분광기 사이의 분광계 마스크를 부분적으로 맞춥니다. 마스크의 그림자가 카메라 이미지에 나타납니다. 지붕이 없는 멤브레인의 명시야 및 형광 이미지를 획득하여 분석을 위한 관심 영역을 선택할 수 있습니다.마이크로볼륨 관류 시스템의 끝을 지붕이 없는 멤브레인에 가까이 가져옵니다. ANAP 형광 이미지를 획득하려면 390/18 나노미터 대역 통과 여기 필터와 416 나노미터 에지 이색성을 통해 385 나노미터 LED로 멤브레인을 여기시키고 400 나노미터 롱패스 방출 필터를 통해 방출된 빛을 수집합니다. 분광계 마스크를 끼우고 방출된 빛이 통과하는지 확인합니다.관심 영역을 분광계 마스크의 슬릿에 맞춥니다. 분광계 격자를 작동시킵니다. 격자가 제자리에 있으면 분광계에 의해 회절된 빛이 CCD 카메라의 칩에 투사되어 스펙트럼 이미지를 생성합니다.이미지는 Y 차원의 공간 정보를 유지합니다. X 차원은 파장으로 바뀝니다. 뉴클레오티드 없는 완충 용액으로 관류하는 동안, 실험의 나머지 부분에 걸쳐 수집된 데이터의 다운스트림 보정 및 정규화를 위해 하나 이상의 0.1 내지 10초 노출을 수득한다.다음으로, 수조 용액에 다양한 TNP ATP 농도를 적용하여 농도 반응 곡선을 설정하고, 각 용액을 최소 1분 동안 관류하여 정상 상태에 도달하고 각 농도에 대한 노출을 얻습니다. 각 농축 후, 처리 후 노출 이미지를 획득하기 전에 적어도 1분 동안 뉴클레오티드 없는 목욕 용액으로 TNP ATP를 세척합니다. 패치 클램프 형광 측정 실험을 수행하려면 먼저 피펫 용액으로 채워질 때 두꺼운 벽으로 둘러싸인 붕규산 유리 모세관에서 패치 피펫을 1.5-2.5메가옴의 저항으로 당깁니다.다음으로, 형질주입된 세포가 있는 커버 슬립을 2밀리리터의 수조 용액이 들어 있는 유리 바닥 35mm 접시에 옮기고 접시를 도립 현미경에 장착합니다. 목욕 용액으로 목욕 챔버를 관류하고 ANAP 표지 채널을 발현하는 세포를 식별합니다. 패치 피펫에 부드러운 양압을 가하고 피펫을 욕조 챔버에 넣습니다.피펫을 세포의 멤브레인에 대고 부드럽게 흡입하여 기가옴 밀봉을 달성합니다. 패치를 절제하려면 피펫 홀더를 패치된 셀에서 빠르게 멀리 옮깁니다. 패치 피펫의 끝을 관류 시스템의 끝 부분에 가깝게 가져오고 패치가 분광계 마스크의 슬릿 내에 있는지 확인합니다.그런 다음 TNP ATP를 적용하고 이미지 스펙트럼을 수집합니다. 이 이미지에서 주황색 형광 단백질로 태그된 ATP 민감성 칼륨 채널을 발현하는 HEK293T 세포의 전형적인 지붕이 없는 막 단편을 관찰할 수 있습니다. 5 마이크로몰 TNP ATP에 노출된 HEK293T 세포로부터의 지붕이 없는 막에서 ANAP 태그된 ATP 민감성 칼륨 채널의 이러한 스펙트럼 이미지에서, ANAP 및 TNP ATP의 피크 방출에 상응하는 고강도의 2개의 영역이 관찰될 수 있다.최종 스펙트럼은 평균화된 관심 영역 스펙트럼으로부터 평균화된 배경 스펙트럼을 뺀 것에 의해 얻어질 수 있다. 여기서, 다중 노출 후 피크 ANAP 형광의 감소가 관찰될 수 있다. TNP ATP가 없는 상태에서 여러 번의 노출로 인한 피크 형광은 단일 지수 붕괴에 적합했습니다.그런 다음 이 데이터를 사용하여 광표백 아티팩트를 수정했습니다. 여기서, TNP ATP의 부재 및 존재 하에서 ANAP 태깅된 ATP 민감성 칼륨 채널을 발현하는 세포로부터 얻어진 지붕이 없는 막으로부터의 대표적인 스펙트럼 이미지가 도시된다. 보정된 방출 스펙트럼을 관찰하면 공여체와 수용체 형광 방출 사이의 명확한 분리가 나타납니다.이 그림에는 일반적인 패치 클램프 형광 측정 실험에서 ANAP 태그가 지정된 ATP 민감성 칼륨 채널의 대표 전류 및 스펙트럼이 표시됩니다. 방출 스펙트럼은 지붕이 없는 멤브레인에 대해 입증된 바와 같이 배경 및 표백에 대해 보정됩니다. 형광 신호가 수용체에 특이적인지 확인하기 위해 컨트롤에 주의하십시오.풍부함이 빠르고 효율적이며 완전한지 확인하고 노출을 가능한 한 짧게 유지하십시오. 이 방법은 수용체 점유 및 기능과 어떤 관련이 있는지에 대한 질문에 답합니다. 유사한 설정으로 사용되는 다른 FRET 기술은 수용체에서 리간드 유도 확인 변화를 조사할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

비계 리포좀을 사용하여 근위 지질 단백질 - 단백질 상호 작용을 재구성<em&gt; 체외</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

연구

생화학

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

무선 표지 된 GTP 결합을 통한 G- 단백질 결합 수용체 신호 측정

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

공동 침강에 의한 F-actin에 대한 단백질 결합 측정

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

C2C12 Myotubes에 의해 트랜스-플라즈마 막 전자 전송 측정

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

인지질 단백질 Annexin a 2 석 영 공명 기를 사용 하 여 지원 되는 고체 지질 Bilayers에 바인딩의 바인딩 역학 공부 되는 낭비 적인 Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

캡처 클릭 화학 기반 RNA 위하여를 사용 하 여 RNA 의무적인 단백질의 포착 (CARIC) 전략

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Polyacrylamide 젤에 단백질의 형광은 얼룩

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

약물 발견을 가속화하기 위해 실시간 생활 시스템에서 GPCR-β-arrestin1/2 상호 작용 모니터링

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...