Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Agradecemos a Raul Terron Exposito pela excelente assistência técnica. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa em Biotecnologia e Ciências Biológicas (BB/R002517/1; MCP e FMA) e Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

1. Preparação das lamínulas
NOTA: Essas etapas devem ocorrer em uma capa estéril de cultura de tecidos. As quantidades são dadas para a preparação de 10 pratos.
<ol><li>Coloque dez lâminas de vidro de borossilicato autoclavadas de 30 mm individualmente em dez placas estéreis de 35 mm não tratadas e enxágue uma vez com 2 mL de água destilada estéril.</li>
	<li>Diluir 1 mL de solução de poli-L-lisina a 0,1% p/v em água destilada estéril até um volume total de 10 mL (concentração final de 0,01% p/v). Misture bem, em seguida, pipetar 1 mL em cada tampa e incubar à temperatura ambiente por 20 min.</li>
	<li>Aspirar a poli-L-lisina e lavar duas vezes cada lamínula com pelo menos 2 mL de água destilada estéril. Deixe até secar completamente, ou seja, pelo menos 3 h.</li>
</ol>2. Semeadura de células HEK-293T
NOTA: Essas etapas devem ocorrer em uma capa de cultura de tecidos. As células HEK-293T foram escolhidas por seu baixo background atual e facilidade de crescimento em cultura. Este protocolo pode ser adaptado a outros tipos celulares.
<ol><li>Enxaguar um frasco T75 confluente 80-90% de células HEK-293T uma vez com 12 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes de incubar com 2 mL de tripsina por 2-5 min, ou até que as células estejam totalmente destacadas e quase completamente dissociadas.</li>
	<li>Ressuspender as células adicionando 10 mL de meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. Pipetar suavemente contra o fundo do balão para quebrar os aglomerados de células restantes.</li>
	<li>Adicionar 2 mL de DMEM suplementado ao número desejado de placas de 35 mm contendo lamínulas revestidas. Adicionar 100 μL de células ressuspensas a cada prato. Incubar durante a noite a 37 °C.</li>
</ol>3. Transfecção
NOTA: Essas etapas devem ocorrer em uma capa de cultura de tecidos. São dadas quantidades para a transfecção de 10 pratos. Para a incorporação ANAP sítio-específica, o códon de DNA na posição destinada à marcação deve ser substituído pelo códon de parada âmbar (TAG). Este construto é co-transfectado com dois plasmídeos: pANAP e peRF1-E55D12,15. A pANAP codifica várias cópias de um par de tRNA/tRNA sintetase específico da ANAP. Na presença de ANAP, a transfecção desse plasmídeo produz RNAt carregado com ANAP que reconhece o códon âmbar. peRF1-E55D codifica um fator de liberação ribossomal negativo dominante que aumenta o rendimento da proteína marcada com ANAP de comprimento total.
<ol><li>Preparar um tubo de 1,5 mL com 10 μg de pANAP, 10 μg de peRF1-E55D e DNA para a construção destinada à marcação com ANAP. Levar a um volume final de 500 μL com DMEM não suplementado.</li>
	<li>Num tubo separado, preparar 3 μL de reagente de transfecção à base de lípidos (ver Tabela de Materiais) para cada 1 μg de ADN e levar a um volume final de 500 μL com DMEM não suplementado.</li>
	<li>Combinar as misturas de DNA e reagentes de transfecção em um único tubo e incubar por 20 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 400 μL do estoque de 1 mM ANAP (sal de trifluoroacetato em NaOH 30 mM) a 20 mL de DMEM suplementado para uma concentração final de 20 μM ANAP. Substitua a mídia antiga das células chapeadas por 2 mL da mídia contendo ANAP por prato.</li>
	<li>Pipetar 10% da mistura de transfecção de DNA em cada prato. Incubar a 33 °C durante 2-4 dias antes das experiências. A incubação a 33 °C retarda a divisão celular e aumenta o rendimento de proteína por célula16.</li>
</ol>4. Experimentos com membranas sem telhado
<ol><li>Use um par de pinças para quebrar uma tampa com células transfectadas em fragmentos menores.</li>
	<li>Siga um dos procedimentos abaixo para destedilhar as células.<ol><li>Se estiver usando lamínulas pré-revestidas, enxágue um fragmento com PBS e, em seguida, coloque-o no fundo de uma placa de 35 mm contendo 2 mL de PBS. Sonicar brevemente usando um sonicador de sonda (50 W, 20%-40% de amplitude, sonda de 3 mm) posicionado 3-5 mm acima da amostra para destelhar as células e deixar para trás fragmentos aderentes da membrana plasmática (Figura 2A,C). NOTA: A potência, a duração e a altura da sonda do sonicador acima da amostra podem ser variadas para obter um alto rendimento de membranas destelhadas sem desnudar completamente a lamínula.</li>
		<li>Se não estiver usando lamínulas de cobertura pré-revestidas, enxágue um fragmento de lamínula de cobertura com PBS e, em seguida, mergulhe em um tubo contendo 0,1% p/v de poli-L-lisina por ~30 s antes de sonicar brevemente (como na etapa 4.2.1) para destelhar as células e deixar para trás fragmentos de membrana plasmática destelhados/parcialmente destelhados (Figura 2A,C,D). Demonstrou-se que exposições breves à poli-L-lisina melhoram a aderência à lamínula13.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o fragmento sonicado em uma placa de 35 mm com fundo de vidro contendo 2 mL de solução de banho e monte em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em água de 60x NA. A porta da câmera do microscópio é conectada a um espectrógrafo em série com uma câmera CCD de alta sensibilidade. Perfundir a câmara de banho (0,5 – 1 mL/min) com tampão utilizando bomba peristáltica. A composição do tampão irá variar dependendo da proteína em estudo. NOTA: Se o usuário não tiver acesso a um objetivo com uma longa distância de trabalho, pode ser impossível focar nos fragmentos de membrana destelhados devido à altura extra do deslizamento da tampa. Uma alternativa é semear células diretamente em pratos com fundos de vidro de poli-L-lisina (veja Tabela de Materiais para um exemplo). Isso também reduzirá possíveis aberrações na imagem associadas ao foco através de dois pedaços de vidro. Essas aberrações não afetam a forma dos espectros adquiridos.</li>
	<li>Identificar fragmentos de membrana sem telhado expressando o canal marcado com ANAP procurando fluorescência do canal (Figura 2C,D). NOTA: Recomenda-se o uso de uma etiqueta fluorescente adicional (onde o espectro de emissão é distinguível do espectro de emissão ANAP) para ajudar a identificar membranas sem telhado contendo a proteína de interesse. Os experimentos na Figura 2C,D foram realizados em canais marcados com ANAP com etiquetas de proteína fluorescente C-terminal.</li>
	<li>Acople parcialmente a máscara do espectrômetro (aumente ~10%) entre a porta da câmera no microscópio e o espectrógrafo. A sombra da máscara aparecerá na imagem da câmera. Alinhe a membrana sem teto com a máscara do espectrômetro, ajustando o estágio do microscópio. Adquira uma imagem de campo brilhante e fluorescência da membrana sem telhado. Estes serão usados para selecionar uma região de interesse para análise.</li>
	<li>Aproximar a ponta do sistema de perfusão de microvolume da membrana destelhada. NOTA: Para reduzir a fluorescência de fundo, a saída do sistema de perfusão foi substituída por uma ponta personalizada feita de vidro borossilicato.</li>
	<li>Para obter imagens dos espectros de fluorescência, excite a membrana com um LED de 385 nm através de um filtro de excitação passa-banda de 390/18 nm e um dicroico de borda de 416 nm. Coletar a luz emitida através de um filtro de emissão passa-longa de 400 nm (Figura 2B).</li>
	<li>Acione a máscara do espectrômetro e certifique-se de que a luz emitida seja passada. Acione as grades do espectrômetro (300 ranhuras/mm). Com as grades instaladas, a luz difratada pelo espectrômetro será projetada no chip da câmera CCD para produzir imagens espectrais (Figura 3A). Essas imagens retêm informações espaciais na dimensão y . A dimensão x é substituída pelo comprimento de onda.</li>
	<li>Opcionalmente, se a proteína de interesse for marcada com uma proteína fluorescente, adquira uma imagem espectral da proteína fluorescente usando o conjunto de filtros apropriado.</li>
	<li>Tome uma ou mais exposições de 0,1-10 s no início do experimento enquanto perfunde a solução tampão livre de nucleotídeo. Estes serão utilizados para corrigir e normalizar os dados ao longo do resto da experiência (ver secção 5 abaixo). NOTA: A escolha do tempo de exposição dependerá do nível de expressão alcançado, do brilho do fluoróforo e da ótica. O tempo de exposição deve ser escolhido para maximizar o sinal e minimizar a taxa de clareamento observada. O intervalo de tempo de exposição indicado no ponto 4.10 é adequado para medições de ligação ao equilíbrio, mas pode ser útil para medir alterações cinéticas mais lentas10. A capacidade de usar tempos de exposição curtos para rastrear cinética mais rápida será limitada pelos níveis de expressão de proteínas e fotoclareamento, em vez de hardware.</li>
	<li>Aplicar uma faixa de concentrações de TNP-ATP (geralmente preparado em solução de banho) para estabelecer uma curva de concentração-resposta. Perfundir cada solução durante pelo menos 1 min para garantir que seja atingido um estado estacionário e lavar cada concentração com solução de banho durante, pelo menos, 1 min. NOTA: É importante garantir que o sistema de perfusão possa atingir rapidamente o equilíbrio (Figura 2E) e atingir a concentração local correta de TNP-ATP (Figura 2F).</li>
	<li>Tomar uma exposição (com a mesma duração utilizada na etapa 4.10) em cada concentração e no final de cada washout.</li>
</ol>5. Análise espectral
NOTA: Estas instruções são escritas para uso com o código de análise "pcf.m", que pode ser encontrado no GitHub. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Código adicional e alternativo pode ser encontrado em https://github.com/smusher/KATP_paper_201911. Descrevemos aqui as operações realizadas pelo software para que o usuário possa criar seu próprio código ou optar por analisar os dados manualmente.
<ol><li>Inicie o programa de análise digitando o nome do programa ("pcf") na linha de comando.</li>
	<li>Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivos para ROI", selecione os nomes de arquivo associados às imagens de campo brilhante e fluorescência da membrana destelhada. Um prompt aparecerá na linha de comando para digitar o nome do arquivo de saída.</li>
	<li>Digite o nome do arquivo e pressione enter.</li>
	<li>Quando o software exibir as imagens de campo brilhante e fluorescência, selecione uma região de interesse (ROI) na imagem espectral correspondente à localização do fragmento de membrana sem telhado ou do patch excisado (ver secção 6) seguindo as instruções do software. Selecione uma região de fundo na mesma imagem espectral (representando a mesma faixa de comprimento de onda da ROI) correspondente a uma seção de deslizamento de cobertura ou placa sem membrana conectada (Figura 3A). O software solicitará que você clique na parte superior do ROI e pressione Enter, clique na parte inferior do ROI e pressione Enter e, em seguida, repita esse processo para a região de fundo.</li>
	<li>Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivo para o espectro FP", selecione o nome do arquivo associado ao espectro de proteína fluorescente (FP) (etapa opcional 4.9). Se nenhum espectro FP foi adquirido, selecione um arquivo de espectro diferente. O espectro FP serve como controle de qualidade para distinguir entre proteína marcada e fluorescência de fundo.</li>
	<li>Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivos para análise", selecione todos os arquivos correspondentes aos espectros ANAP (das etapas 4.10 a 4.12), incluindo os arquivos necessários para a correção da água sanitária.</li>
	<li>Quando uma caixa de diálogo de arquivo/pasta aberta for aberta com o prompt: "Selecionar arquivos para coleta de branqueamento", selecione o subconjunto de arquivos da etapa 5.6 correspondente aos espectros iniciais adquiridos em solução livre de nucleotídeos no início do experimento ou espectros adquiridos durante as lavagens em solução livre de nucleotídeo a serem usados para correção (das etapas 4.10 a 4.12).</li>
	<li>Média de linha de cada imagem para produzir espectros, ou seja, média da intensidade de todos os pixels na dimensão y de uma ROI ou região de fundo em cada comprimento de onda. (Figura 3B). Subtraia o espectro de fundo médio resultante do espectro médio adquirido da ROI para remover a fluorescência e a fluorescência de fundo do TNP-ATP não ligado (Figura 3C). Essas etapas são executadas automaticamente pelo software.</li>
	<li>Determine a intensidade da ANAP para cada exposição calculando a média da intensidade de uma janela de 5 nm centrada em torno do pico ANAP dos espectros subtraídos (tipicamente ~470 nm, mas pode variar dependendo do microambiente local do resíduo ANAP). NOTA: A Figura 3D mostra 6 espectros obtidos a partir de exposições consecutivas de 10 s de um fragmento de membrana sem telhado expressando canais marcados com ANAP. O inset mostra a intensidade média do pico de cada espectro. O software irá encontrar automaticamente o comprimento de onda de pico no primeiro espectro adquirido e usar esse valor em todo o espectro. A intensidade será calculada automaticamente pelo software.</li>
	<li>Normalizar as intensidades de PANA para cada experimento dividindo a intensidade de ANAP de uma dada exposição (F) pela intensidade de ANAP da primeira exposição da série temporal, que foi tomada na etapa 4.10 (Fmax). Novamente, o software executa esses cálculos automaticamente.</li>
	<li>Execute as etapas abaixo para obter dados.<ol><li>Para corrigir o fotoclareamento ANAP, primeiro ajuste um único decaimento exponencial, (F/Fmax) = A*exp(-t/τ)+(1-A), onde t é o tempo de exposição cumulativo, τ é a constante de tempo e A é a amplitude) para as etapas intermediárias de lavagem entre as aplicações de TNP-ATP ou para múltiplas exposições iniciais tomadas antes da lavagem com TNP-ATP (Figura 3D, inserção). NOTA: O software exibirá esse ajuste e solicitará que ele seja aceito ou rejeitado. Se o ajuste for rejeitado, outra oportunidade será fornecida para selecionar arquivos para correção de clareamento.</li>
		<li>Divida os espectros ANAP normalizados (na etapa 5.10) pelo valor previsto do ajuste exponencial da etapa 5.11.1 em cada ponto de tempo (Figura 3E). NOTA: Para o exemplo mostrado, a fluorescência de pico normalizada observada em 50 s é de 0,65 e a fluorescência prevista a partir do ajuste exponencial é de 0,64. Para corrigir o clareamento, divida o valor observado (0,65, Figura 3E inset, círculo vazio) pelo valor previsto (0,64, Figura 3E inset, linha tracejada) para produzir o valor corrigido (~1, Figura 3E inset, círculo colorido). Se a correção do clareamento for adequada, a intensidade da PANA de todas as exposições adquiridas na ausência de nucleotídeos deve ser aproximadamente igual (Figura 3E). Esses cálculos são realizados automaticamente pelo software.</li>
		<li>Obter a saída como uma imagem plotando os dados e uma planilha com abas contendo os espectros brutos, espectros subtraídos, espectros corrigidos para fotobranqueamento e os dados de pico para cada arquivo para que análises adicionais possam ser realizadas.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Experimentos de fluorometria patch-clamp
<ol><li>Puxe pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato de paredes espessas para uma resistência de 1,5 MΩ a 2,5 MΩ quando preenchidas com solução de pipeta. A composição da solução da pipeta varia de acordo com a proteína em estudo.</li>
	<li>Transfira uma lamínula com células transfectadas para uma placa de 35 mm com fundo de vidro contendo 2 mL de solução de banho e monte em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em água de 60x de alto NA. Perfundir a câmara de banho (0,5 – 1 mL/min) com solução de banho com bomba peristáltica. Quanto à solução de pipeta, a solução de banho irá variar dependendo da proteína em estudo.</li>
	<li>Identificar uma célula que expresse canais marcados com ANAP procurando fluorescência na membrana celular.</li>
	<li>Encha uma pipeta de remendo com solução de pipeta. Aplique uma pressão positiva suave na pipeta e coloque na câmara de banho. Pressione a pipeta contra a membrana da célula e aplique uma sucção suave para obter uma vedação GΩ (Figura 4A).</li>
	<li>Excise o adesivo movendo rapidamente o suporte da pipeta para longe da célula (Figura 4A). NOTA: A excisão do adesivo desta forma deve formar um adesivo de dentro para fora, com os domínios citosólicos da proteína expostos ao sistema de perfusão. Se a localização do sítio de ligação de nucleotídeos em estudo não for citosólica, será necessário usar adesivos externos ou gravações de células inteiras para realizar experimentos de PCF.</li>
	<li>Aproximar a ponta da pipeta do remendo da ponta do sistema de perfusão e verificar se o remendo está dentro da fenda da máscara do espectrômetro (Figura 4A).</li>
	<li>Aplicar TNP-ATP e espectros de imagem como nas etapas 4.10-4.12, enquanto simultaneamente registra a resposta da corrente iônica à aplicação de nucleotídeos. OBS: O vidro da pipeta pode introduzir aberrações espaciais e reflexos nas imagens adquiridas. No entanto, essas aberrações não afetarão a forma dos espectros adquiridos e a luz de excitação refletida é facilmente separada da fluorescência usando o espectrógrafo ou um filtro de emissão passa-longa.</li>
	<li>Analise os espectros. Os espectros obtidos a partir de manchas excisadas podem exibir subtração excessiva da fluorescência não ligada do TNP-ATP devido à exclusão do TNP-ATP do vidro da pipeta do remendo (Figura 4C-E). Essa subtração excessiva não afeta o espectro de emissão da ANAP e, portanto, pode ser ignorada. NOTA: Como o sinal de fluorescência em manchas excisadas será menor do que em membranas sem telhado, é importante usar um tempo de exposição que forneça sinal a ruído alto o suficiente sem clarear a ANAP muito rapidamente.</li>
</ol>

<ol>
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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels.">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).</li><li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels.">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels.">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry.">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K(+)+channels.">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li><li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization.">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance.">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li><li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction.">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li><li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels.">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li><li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel.">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).</li><li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1,+P2X3,+and+heteromeric+P2X2/3+receptors.">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li><li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization.">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Desenvolvemos um método para medir a ligação de adenina nucleotídica em tempo real a proteínas intactas da membrana. Nosso método baseia-se em várias outras técnicas estabelecidas, incluindo a marcação de proteínas com ANAP usando supressão de códon âmbar stop 12, destelhamento celular14 e fluorometria voltage-clamp/PCF 19,20,21,22,23,24,25 . A síntese dessas abordagens permite a mensuração da ligação de nucleotídeos com alta resolução espacial e temporal. De fato, em nosso trabalho anterior, conseguimos distinguir entre diferentes sítios de ligação no mesmo complexo proteico usando essa abordagem10,11. É importante ressaltar que essa técnica pode ser aplicada diretamente a pequenas quantidades de proteína em um ambiente celular em condições que preservem a função proteica. O uso de nosso método de ligação em conjunto com a leitura eletrofisiológica direta de correntes de canais iônicos nos permite obter informações ricas sobre os fundamentos moleculares do fechamento de canais11.
Como os espectrômetros são equipamentos de laboratório fora do padrão, a intensidade da ANAP também pode ser monitorada em relativo isolamento usando filtros passa-faixa. A Figura 5B mostra as propriedades espectrais de dois desses filtros. O filtro passa-banda de 470/10 nm filtra efetivamente o sinal de fluorescência do TNP-ATP e se sobrepõe bem com a fluorescência ANAP de pico. No entanto, o pico de transmitância deste filtro é de apenas cerca de 50%, o que pode dificultar a obtenção de bons sinais de membranas escuras (ou em remendos de membrana excisados sob pinça de tensão). Outra opção é um filtro passa-banda de 460/60 nm. Há um pouco mais de sobreposição entre o filtro de 460/60 nm e o pé do pico de emissão de TNP-ATP em comparação com o filtro de 470/10 nm. No entanto, a passagem de banda de 460/60 nm tem uma transmitância de 90-95% em uma ampla faixa do pico ANAP, o que seria esperado para aumentar o sinal de emissão de fluorescência.
A ANAP é um fluoróforo ambientalmente sensível 12,26,27. O pico de emissão e o rendimento quântico variam dependendo do local de incorporação na proteína de interesse, podendo mudar à medida que a proteína muda de conformação. Tais mudanças seriam imediatamente evidentes a partir dos espectros de emissão, mas não seriam tão óbvias quando a intensidade ANAP é medida usando filtros. Em qualquer caso, controles apropriados são necessários para demonstrar que o sinal de fluorescência não varia devido a mudanças no ambiente local ao redor da ANAP subsequentes à ligação de nucleotídeos. Experimentos de controle com nucleotídeos não marcados podem ajudar a verificar que quaisquer mudanças na intensidade da ANAP são o resultado de FRET entre os nucleotídeos ANAP e TNP. Os nucleotídeos TNP podem ligar-se não especificamente às membranas derivadas de células não transfectadas (seja à membrana plasmática ou às proteínas da membrana nativa)10. Quantificamos a ligação como um decremento na fluorescência do doador, pois este sinal é específico do canal marcado. No entanto, recomendamos a realização de experimentos de controle adicionais para cada par agonista/receptor, por exemplo, mutando o sítio de ligação de nucleotídeos, se conhecido, para verificar se a mudança na fluorescência do doador é realmente o resultado da ligação direta ao receptor marcado11. Finalmente, recomenda-se trabalhar com construções que contenham uma etiqueta de proteína fluorescente além do rótulo ANAP. Isso ajuda a diferenciar a fluorescência do receptor marcado do fundo/autofluorescência. A fluorescência de fundo pode ser distinguida da ANAP pelo pico e forma dos espectros de emissão10, mas tais determinações podem ser muito difíceis quando apenas conjuntos de filtros são usados. Além disso, células e membranas sem teto expressando receptores fluorescentes podem ser identificadas usando o tag de proteína fluorescente sem ter que excitar ANAP e correr o risco de fotoclareamento excessivo.
Em muitos de nossos registros de PCF, observamos um forte pico negativo em nossos espectros em altas concentrações de TNP-ATP (Figura 4C). Esse pico negativo é um artefato do nosso protocolo de subtração de fundo. A Figura 4D mostra imagens fluorescentes e de campo claro de uma pipeta de remendo exposta a 1 mM TNP-ATP. Uma sombra na ponta da pipeta é evidente, resultante da exclusão do TNP-ATP do volume das paredes da pipeta, que é mais evidente dentro do plano de foco. A imagem espectral da Figura 4E mostra uma faixa escura, correspondente a essa sombra. Quando uma região acima ou abaixo dessa faixa escura é usada para subtração de fundo, ela produz um pico negativo. É importante ressaltar que esse pico ocorreu em uma faixa de comprimento de onda correspondente à emissão de TNP-ATP e não afetou nossas medidas de extinção da ANAP.
A principal limitação de nossos experimentos foi a obtenção da expressão adequada na membrana plasmática de construtos marcados com ANAP para medir fluorescência. Era geralmente mais fácil adquirir espectros de alta qualidade a partir de membranas sem telhado do que em PCF, devido ao seu tamanho maior e à nossa capacidade de escanear rapidamente um prato inteiro de membranas destelhadas, ao contrário do PCF, onde os adesivos só podem ser obtidos um de cada vez. Em nossos experimentos, os dados de membranas sem teto e experimentos de PCF foram semelhantes, mas não equivalentes (Figura 6)11. No entanto, não há nenhuma razão a priori para que esta seja uma observação universal, pois as proteínas em uma pipeta de remendo podem estar em um estado funcional diferente daquelas em membranas sem teto.
Aqui, tentativas têm sido feitas para maximizar a expressão de nossos construtos marcados com ANAP, em particular reduzindo a temperatura de cultura celular para 33 °C10,11,16. Em nossa experiência, a tentativa de identificar locais na proteína em que a PANA seria uma substituição conservadora não resultou consistentemente em construtos que expressassem bem. Tivemos mais sucesso na varredura sistemática de regiões inteiras de proteínas para sítios de incorporação de ANAP e triagem de candidatos para expressão de superfície10. O sistema de marcação ANAP também funciona em ovócitos de Xenopus laevis, o que permite a excisão de remendos de membrana muito maiores, aumentando o sinal para o ruído26,27,28.
Enquanto níveis maiores de expressão devem resultar em sinais mais brilhantes, o número mínimo de canais necessários para medir a fluorescência depende de vários fatores, incluindo o brilho do fluoróforo, o grau de fotoclareamento, a intensidade da luz de excitação e o plano de foco. Teoricamente, as estimativas poderiam ser feitas correlacionando-se a intensidade da fluorescência e a corrente do canal, como já demonstradoanteriormente28,29. No entanto, a confiabilidade de tais estimativas requer algum conhecimento da condutância de canal único e da probabilidade aberta do canal. Além dos fatores listados acima, o sinal de fluorescência também será afetado por canais associados a vesículas ou seções da membrana plasmática presas ao vidro da pipeta que não estão sob pinça de tensão.
Este método é prontamente adaptado ao estudo de outros canais iônicos nucleotídeos-sensíveis. A CFTR é estruturalmente semelhante à subunidade do receptor acessório de sulfonilureia do KATP30,31. Assim como o KATP, O CFTR é controlado pela ligação de nucleotídeos, tornando-se um alvo futuro óbvio do nosso método7. Os receptores P2X purinérgicos são canais iônicos ligados por ATP extracelular9. O TNP-ATP atua como antagonista dos receptores P2X32,33. Portanto, não será útil para estudar a ativação do P2X, embora possa ser usado em ensaios de competição com agonistas do P2X. Alternativamente, outros derivados fluorescentes de ATP com sobreposição espectral suficiente com emissão ANAP podem ser usados para estudar a ativação. Alexa-647-ATP é um agonista P2X fluorescente34. O R0 calculado entre Alexa-647 e ANAP é ~85 Å, o que significa que a ligação direta ao P2X deve resultar em supressão substancial do ANAP incorporado ao canal. No entanto, um R0 tão longo também resultará na extinção de Alexa-647-ATP ligado a subunidades vizinhas e aumenta a probabilidade de que a ligação de nucleotídeos não específicos resulte em FRET. Como o sítio de ligação do ligante nos receptores P2X é extracelular, as medidas de ligação seriam realizadas em células intactas, em pinça de voltagem de célula inteira ou em adesivos de membrana externos. Nosso método também pode ser estendido para estudar a ligação e ativação de transportadores e bombas eletrogênicas e não-eletrogênicas que dependem de ATP para seu ciclo de reação, bem como receptores P2Y acoplados à proteína G. Finalmente, embora tenhamos desenvolvido este método para medir a ligação de adenina nucleotídica (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), a mesma abordagem pode ser usada para estudar a ligação a praticamente qualquer receptor para o qual um ligante fluorescente adequado tenha sido identificado.

Várias classes importantes de proteínas são diretamente reguladas pela ligação do ligante. Estes variam de enzimas solúveis a proteínas embutidas na membrana, incluindo receptores tirosina quinases, receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e canais iônicos. Os GPCRs e canais respondem por ~34% e ~15% de todos os alvos atuais de drogas, respectivamente 1,2. Portanto, há um considerável interesse bioquímico, bem como médico no desenvolvimento de métodos que forneçam insights mecanísticos sobre as interações ligante-receptor. Métodos tradicionais para medir a ligação de ligantes, incluindo estudos de marcação por fotoafinidade e ligação a radioligantes, requerem grandes quantidades de proteína parcialmente purificada e são tipicamente realizados sob condições não fisiológicas e escalas de tempo. Um método ideal exigiria apenas pequenas quantidades de proteína, poderia ser realizado em proteínas intactas expressas em um ambiente celular ou de membrana, poderia ser monitorado em tempo real e seria compatível com leituras diretas da função proteica.
A transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é um método que detecta a proximidade entre duas moléculas marcadas fluorescentemente3. O FRET ocorre quando um fluoróforo de doador excitado transfere energia de forma não radiativa para uma molécula receptora (normalmente outro fluoróforo). A transferência de energia resulta na supressão da emissão de fluorescência do doador e sensibilização da emissão do receptor (se o receptor for um fluoróforo). A eficiência da transferência depende da6ª potência da distância entre o doador e o receptor. Além disso, o doador e o receptor devem estar próximos (geralmente menos de 10 nm) para que o FRET ocorra. Como tal, o FRET pode ser explorado para medir a ligação direta entre um receptor de proteína fluorescentemente marcado e um ligante fluorescente.
Várias proteínas diferentes são reguladas ou ativadas pela ligação de nucleotídeos de adenina intracelulares ou extracelulares (ATP, ADP, AMP, cAMP). Muitas proteínas transportadoras requerem hidrólise de ATP para seu ciclo de reação, incluindo transportadores de de ligação a ATP e ATPases do tipo P, como a bomba Na+/K+ 4,5. Os canais de K+ sensíveis ao ATP (KATP), o regulador de condutância transmembrana da fibrose cística (CFTR) e os canais regulados por nucleotídeos cíclicos são canais iônicos que são limitados pela ligação de nucleotídeos de adenina intracelular, tornando-os extremamente sensíveis a mudanças no metabolismo celular e transdução de sinal 6,7,8. Os receptores P2X e P2Y purinérgicos respondem a alterações no ATP extracelular, que pode ser liberado como neurotransmissor ou como resultado de dano tecidual9. Desenvolvemos um ensaio baseado em FRET para a medição da ligação de adenina nucleotídica a proteínas de membrana em tempo real. Aplicamos previamente este método para estudar a ligação de nucleotídeos a canaisde K ATP 10,11.
Para medir a ligação de nucleotídeos via FRET, uma proteína de interesse deve primeiro ser marcada com um fluoróforo. A etiqueta fluorescente deve ser inserida especificamente na proteína de interesse, de modo que esteja perto o suficiente do local de ligação do ligante para que o FRET ocorra, com especial cuidado para garantir que a etiqueta não afete a estrutura e a função gerais da proteína. Para isso, empregamos uma técnica desenvolvida por Chatterjee et al., usando supressão de stop-codon âmbar para inserir um aminoácido fluorescente não canônico (l-3-(6-acetilnaftaleno-2-ilamino)-2-aminopropiônico; ANAP) no local desejado12. Medimos a ligação de nucleotídeos como FRET entre a proteína marcada com ANAP e derivados nucleotídicos trinitrofenil (TNP) fluorescentes (Figura 1A). O espectro de emissão da ANAP sobrepõe-se ao espectro de absorbância dos nucleotídeos de TNP, condição necessária para que ocorra o FRET (Figura 1B). Aqui descrevemos dois tipos diferentes de experimento de ligação. No primeiro, a ligação de nucleotídeos ao lado intracelular dos canais deK ATP marcados com ANAP é medida em células que foram destelhadas por sonicação, deixando fragmentos aderidos da membrana plasmática sobre uma lamínula de cobertura de vidro10,11,13,14.
No segundo método, a ligação de nucleotídeos a canais KATP marcados com ANAP é medida em um patch de membrana sob pinça de tensão, permitindo a medição simultânea de correntes iônicas e fluorescência. Combinando essas duas abordagens experimentais, mudanças na ligação podem ser diretamente correlacionadas com mudanças na função do canal11. Resultados típicos, armadilhas potenciais e análise de dados são discutidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

Desenvolvemos um método para medir a ligação de nucleotídeos de adenina a receptores transmembrana intactos e funcionais em um ambiente celular ou de membrana. Este método combina a expressão de proteínas marcadas com o aminoácido fluorescente não canônico ANAP, e FRET entre ANAP e derivados nucleotídicos fluorescentes (trinitrofenil). Apresentamos exemplos de ligação de nucleotídeos a canais iônicos KATP marcados com ANAP, medidos em membranas plasmáticas sem teto e remendos de membrana excisados de dentro para fora sob pinça de tensão. Este último permite medições simultâneas da ligação do ligante e da corrente do canal, uma leitura direta da função da proteína. O tratamento e a análise dos dados são discutidos extensivamente, juntamente com possíveis armadilhas e artefatos. Este método fornece informações mecanicistas ricas sobre o gating ligante-dependente de canais deK ATP e pode ser facilmente adaptado ao estudo de outras proteínas nucleotídeos-reguladas ou qualquer receptor para o qual um ligante fluorescente adequado pode ser identificado.

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Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Este protocolo apresenta um método para medir a ligação de adenina nucleotídica a receptores em tempo real em ambiente celular. A ligação é medida como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre derivados de nucleotídeos trinitrofenila e proteínas marcadas com um aminoácido fluorescente não canônico.

Medindo a ligação de nucleotídeos a proteínas de membrana intactas e funcionais em tempo real

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Como o ATP é um importante mensageiro celular, desenvolvemos um método que nos permite medir a ligação do ATP aos seus receptores com alta precisão. Usando FRET entre derivados de nucleotídeos e proteínas marcadas fluorescentemente, podemos monitorar a ligação de nucleotídeos a receptores funcionais intactos em tempo real e com excelente resolução espacial. Usamos este método para entender os efeitos do metabolismo celular sobre o canal de potássio sensível ao ATP, que está implicado em certas formas de diabetes.Para montar um experimento de membrana sem teto, primeiro use um par de pinças para quebrar um pequeno fragmento de uma tampa com células transfectadas e enxaguar o fragmento com PBS. Se a tampa for pré-revestida com polilisina, coloque o fragmento no fundo de uma placa de 35 milímetros contendo dois mililitros de PBS e segure um sonicador de sonda de três milímetros três a cinco milímetros acima da amostra, pulsando a 50 watts e 20 a 40% de amplitude por 200 a 500 milissegundos para destedilhar as células. Se as lamínulas da tampa não forem pré-revestidas, após o enxágue com PBS, mergulhe o fragmento em um tubo contendo poli-L-lisina a 0,1% por cerca de 30 segundos antes de destelhar as células com breve sonicação, conforme demonstrado.Transfira o fragmento sonicado para um fundo de vidro coberto de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução de banho e monte o prato em um microscópio invertido equipado com uma objetiva de imersão em água de alta abertura numérica 60x. Verifique se a porta da câmera do microscópio está conectada a um espectrógrafo em série com uma câmera CCD de alta sensibilidade e use uma bomba peristáltica para perfundir a câmara de banho com tampão a uma taxa de fluxo de 0,5 a um mililitro de tampão por minuto. Para identificar fragmentos de membrana sem telhado expressando o canal marcado com ANAP, visualize a amostra para localizar membranas com canais fluorescentes.Acople parcialmente a máscara do espectrômetro entre a porta da câmera no microscópio e o espectrógrafo. A sombra da máscara aparecerá na imagem da câmera. Adquira uma imagem de campo brilhante e fluorescência da membrana descoberta para permitir a seleção da região de interesse para análise.Aproximar a ponta do sistema de perfusão de microvolume da membrana destelhada. Para obter uma imagem de fluorescência ANAP, excite a membrana com um LED de 385 nanômetros através de um filtro de excitação de passagem de banda de 390/18 nanômetros e um dicroico de borda de 416 nanômetros, coletando a luz emitida através de um filtro de emissão passa-longa de 400 nanômetros. Acione a máscara do espectrômetro e certifique-se de que a luz emitida seja passada.Alinhe a região de interesse com a fenda da máscara do espectrômetro. Acione as grades do espectrômetro. Com as grades no lugar, a luz difratada pelo espectrômetro será projetada no chip da câmera CCD para produzir imagens espectrais.As imagens reterão informações espaciais na dimensão Y. A dimensão X será substituída pelo comprimento de onda. Durante a perfusão com solução tampão livre de nucleotídeos, obtenha uma ou mais exposições de 0,1 a dez segundos para correção a jusante e normalização dos dados coletados ao longo do restante do experimento.Em seguida, aplique uma faixa de concentrações de TNP ATP na solução de banho para estabelecer uma curva de resposta à concentração, perfundindo cada solução por pelo menos um minuto para garantir que um estado estacionário seja atingido e obter uma exposição para cada concentração. Após cada concentração, lave o TNP ATP com solução de banho livre de nucleotídeos por pelo menos um minuto antes de adquirir uma imagem de exposição pós-tratamento. Para realizar um experimento de fluorometria patch-clamp, primeiro puxe pipetas de remendo de capilares de vidro borossilicato de paredes espessas para uma resistência de 1,5 a 2,5 megaohms quando preenchidas com solução de pipeta.Em seguida, transfira uma tampa com células transfectadas para uma placa de fundo de vidro de 35 milímetros contendo dois mililitros de solução de banho e monte a placa no microscópio invertido. Perfundir a câmara de banho com solução de banho e identificar uma célula expressando canais marcados com ANAP. Aplique uma pressão positiva suave em uma pipeta de remendo e coloque a pipeta em uma câmara de banho.Pressione a pipeta contra a membrana da célula e aplique uma sucção suave para obter uma vedação gigaohm. Para excisar o adesivo, mova rapidamente o suporte da pipeta para longe da célula remendada. Aproximar a ponta da pipeta do remendo da ponta do sistema de perfusão e verificar se o adesivo está dentro da fenda da máscara do espectrômetro.Em seguida, aplique TNP ATP e colete espectros de imagem. Nessas imagens, um fragmento típico de membrana sem telhado de uma célula HEK293T expressando canais de potássio sensíveis ao ATP marcados com proteína fluorescente laranja pode ser observado. Nesta imagem espectral de canais de potássio sensíveis a ATP marcados com ANAP em uma membrana descoberta de uma célula HEK293T exposta a cinco TNP ATP micromolares, duas regiões de alta intensidade podem ser observadas que correspondem ao pico de emissão de ANAP e TNP ATP.Um espectro final pode ser obtido subtraindo-se o espectro de fundo médio da região média do espectro de interesse. Aqui, pode-se observar a redução do pico de fluorescência da ANAP após múltiplas exposições. O pico de fluorescência de várias exposições na ausência de TNP ATP foi ajustado a um único decaimento exponencial.Esses dados foram então utilizados para correção dos artefatos de fotoclareamento. Aqui, imagens espectrais representativas de uma membrana sem telhado obtidas de uma célula expressando canais de potássio sensíveis a ATP marcados com ANAP na ausência e na presença de TNP ATP são mostradas. A observação dos espectros de emissão corrigidos revela uma separação clara entre a emissão fluorescente doadora e aceptora.Nesta figura, correntes representativas e espectros de canais de potássio sensíveis a ATP marcados com ANAP de um experimento típico de fluorometria patch-clamp são mostrados. Os espectros de emissão são corrigidos para fundo e branqueamento, como demonstrado para membranas sem telhado. Tome cuidado com os controles para verificar se o sinal fluorescente é específico para o seu receptor.Certifique-se de que sua profusão seja rápida, eficiente e completa e mantenha suas exposições o mais curtas possível. Este método responde a perguntas sobre a ocupação do receptor e como ele se relaciona com a função. Outras técnicas de FRET usadas com uma configuração semelhante podem sondar alterações confirmacionais induzidas pelo ligante no receptor.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Usando andaime lipossomas para reconstituir interações proteína-proteína Lipid-proximal<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Bioquímica

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Medição da sinalização do receptor acoplado à proteína G via ligação GTP marcada com rádio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Medir a ligação da proteína à actina F por co-sedimentação

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Medição de perfis Biomolecular DSC com ligantes termolábeis para caracterizar rapidamente de dobramento e vinculação de interações

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-Plasma da membrana, transporte de elétrons por Myotubes de C2C12 de medição

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...