Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Рауля Террона Экспосито за отличную техническую помощь. Эта работа финансировалась Научно-исследовательским советом по биотехнологии и биологическим наукам (BB/R002517/1; MCP и FMA) и Wellcome Trust (203731/Z/16/A; СГУ)

<ol>
	<li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success.">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters.">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li><li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases:+excitement+continues.">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li><li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNG+and+HCN+channels:+two+peas,+one+pod.">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li><li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+coupling+between+CFTR's+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations.">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li><li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1:+A+Mechanistic+Model.">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li><li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors.">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li><li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K(+)+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding.">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103 (2019).</li><li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K++channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry.">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775 (2020).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane.">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+'cell+cortices'+for+light+and+electron+microscopy.">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li><li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase/tRNA+expression+and+engineered+eRF1.">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li><li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature.">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).</li><li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions.">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li><li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding,+gating,+affinity+and+efficacy:+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors.">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry.">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels.">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).</li><li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels.">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels.">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry.">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K(+)+channels.">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li><li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization.">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance.">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li><li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction.">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li><li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels.">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li><li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel.">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).</li><li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1,+P2X3,+and+heteromeric+P2X2/3+receptors.">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li><li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization.">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li></ol>

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Мы разработали метод измерения связывания адениновых нуклеотидов в режиме реального времени с интактными мембранными белками. Наш метод основан на нескольких других известных методах, включая маркировку белков с помощью ANAP с использованием подавления янтарного стоп-кодона 12, раскрытие клеток 14 и флуорометрию с зажимом напряжения / PCF 19,20,21,22,23,24,25 . Синтез этих подходов позволяет измерять связывание нуклеотидов с высоким пространственным и временным разрешением. Действительно, в нашей предыдущей работе мы смогли различать разные сайты связывания на одном и том же белковом комплексе, используя этот подход10,11. Важно отметить, что этот метод может быть непосредственно применен к небольшим количествам белка в клеточной среде в условиях, которые сохраняют функцию белка. Использование нашего метода связывания в сочетании с прямым электрофизиологическим считыванием токов ионных каналов позволяет нам получить богатое представление о молекулярных основах стробированияканалов 11.
Поскольку спектрометры являются нестандартным лабораторным оборудованием, интенсивность ANAP также можно контролировать в относительной изоляции с помощью полосовых фильтров. На рисунке 5B показаны спектральные свойства двух таких фильтров. Полосовой фильтр 470/10 нм эффективно отсеивает флуоресцентный сигнал от TNP-ATP и хорошо перекрывается с пиковой флуоресценцией ANAP. Однако пиковый коэффициент пропускания этого фильтра составляет всего около 50%, что может затруднить получение хороших сигналов от тусклых мембран (или в вырезанных мембранных пятнах под напряжением). Другой вариант — полосовой фильтр 460/60 нм. По сравнению с фильтром 470/10 нм между фильтром 460/60 нм и нижней частью пика излучения TNP-ATP наблюдается несколько большее перекрытие. Однако полоса пропускания 460/60 нм имеет коэффициент пропускания 90-95% в широком диапазоне пика ANAP, что, как ожидается, усилит сигнал флуоресцентного излучения.
ANAP является экологически чувствительным флуорофором 12,26,27. Пиковое излучение и квантовый выход варьируются в зависимости от места включения в интересующий белок и могут изменяться по мере изменения конформации белка. Такие изменения будут сразу видны из спектров излучения, но не будут столь очевидными при измерении интенсивности ANAP с использованием фильтров. В любом случае, необходимы соответствующие средства контроля, чтобы продемонстрировать, что сигнал флуоресценции не изменяется из-за изменений в локальной среде вокруг ANAP после связывания нуклеотидов. Контрольные эксперименты с немечеными нуклеотидами могут помочь проверить, что любые изменения интенсивности ANAP являются результатом FRET между ANAP и TNP-нуклеотидами. TNP-нуклеотиды могут неспецифически связываться с мембранами, полученными из нетрансфицированных клеток (либо с плазматической мембраной, либо с нативными мембранными белками)10. Мы количественно определяем связывание как уменьшение флуоресценции донора, поскольку этот сигнал специфичен для меченого канала. Тем не менее, мы рекомендуем проводить дополнительные контрольные эксперименты для каждой пары агонист/рецептор, например, мутировать сайт связывания нуклеотидов, если он известен, чтобы убедиться, что изменение донорской флуоресценции действительно является результатом прямого связывания с меченым рецептором11. Наконец, рекомендуется работать с конструкциями, содержащими флуоресцентную белковую метку в дополнение к метке ANAP. Это помогает дифференцировать флуоресценцию меченого рецептора от фоновой/автофлуоресценции. Фоновую флуоресценцию можно отличить от ANAP по пику и форме спектровизлучения 10, но такие определения могут быть очень затруднены, когда используются только наборы фильтров. Кроме того, клетки и непокрытые мембраны, экспрессирующие флуоресцентные рецепторы, могут быть идентифицированы с помощью флуоресцентной белковой метки без необходимости возбуждать ANAP и подвергаться риску чрезмерного фотообесцвечивания.
Во многих наших записях PCF мы наблюдали сильный отрицательный пик в наших спектрах при высоких концентрациях TNP-ATP (рис. 4C). Этот отрицательный пик является артефактом нашего протокола фонового вычитания. На рисунке 4D показаны яркопольные и флуоресцентные изображения патч-пипетки, подвергшейся воздействию 1 мМ ТНП-АТФ. На кончике пипетки видна тень, возникающая в результате исключения ТНП-АТФ из объема стенок пипетки, что наиболее заметно в плоскости фокуса. Спектральное изображение на рисунке 4E показывает темную полосу, соответствующую этой тени. Когда область выше или ниже этой темной полосы используется для вычитания фона, она дает отрицательный пик. Важно отметить, что этот пик произошел в диапазоне длин волн, соответствующем излучению TNP-ATP, и не повлиял на наши измерения гашения ANAP.
Основным ограничением наших экспериментов было получение адекватной экспрессии плазматической мембраны конструкций, меченных ANAP, для измерения флуоресценции. Как правило, было легче получить высококачественные спектры из непокрытых мембран, чем в PCF, из-за их большего размера и нашей способности быстро сканировать всю тарелку непокрытых мембран, в отличие от PCF, где патчи могут быть получены только по одному. В наших экспериментах данные из непокрытых мембран и экспериментов с PCF были аналогичными, но не эквивалентными (рис. 6)11. Тем не менее, нет априорной причины, по которой это должно быть универсальным наблюдением, поскольку белки в пластырной пипетке могут находиться в другом функциональном состоянии, чем белки в непокрытых мембранах.
Здесь были предприняты попытки максимизировать экспрессию наших ANAP-меченных конструкций, в частности, понизить температуру клеточной культуры до 33 ° C10,11,16. По нашему опыту, попытка идентифицировать участки в белке, на которых ANAP был бы консервативной заменой, не всегда приводила к конструкциям, которые хорошо экспрессировались. Мы добились большего успеха в систематическом сканировании целых белковых областей на наличие сайтов включения ANAP и скрининге кандидатов на поверхностную экспрессию10. Система маркировки ANAP также работает в ооцитах Xenopus laevis, что позволяет иссекать гораздо большие мембранные участки, тем самым увеличивая соотношение сигнал/шум26,27,28.
В то время как ожидается, что более высокие уровни экспрессии приведут к более ярким сигналам, минимальное количество каналов, необходимых для измерения флуоресценции, зависит от нескольких факторов, включая яркость флуорофора, степень фотообесцвечивания, интенсивность возбуждающего света и плоскость фокусировки. Теоретически оценки могут быть сделаны путем корреляции интенсивности флуоресценции и тока канала, как было показано ранее28,29. Однако надежность таких оценок требует определенных знаний об одноканальной проводимости и открытой вероятности канала. В дополнение к факторам, перечисленным выше, на сигнал флуоресценции также будут влиять каналы, связанные с везикулами или участками плазматической мембраны, прилипшими к стеклу пипетки, которые не находятся под напряжением.
Этот метод легко адаптируется для изучения других нуклеотид-чувствительных ионных каналов. CFTR структурно сходен с субъединицей вспомогательного рецептора сульфонилмочевины KATP30,31. Как и KATP, CFTR стробирование контролируется связыванием нуклеотидов, что делает его очевидной будущей мишенью нашего метода7. Пуринергические P2X-рецепторы представляют собой ионные каналы, управляемые внеклеточным АТФ9. TNP-ATP действует как антагонист рецепторов P2X32,33. Следовательно, он не будет полезен для изучения активации P2X, хотя его можно использовать в конкурентных анализах с агонистами P2X. В качестве альтернативы для изучения активации могут быть использованы другие флуоресцентные производные АТФ с достаточным спектральным перекрытием с излучением ANAP. Alexa-647-ATP является флуоресцентным агонистом P2X34. Расчетный R0 между Alexa-647 и ANAP составляет ~ 85 Å, что означает, что прямое связывание с P2X должно привести к существенному гашению ANAP, включенного в канал. Однако такой длинный R0 также приведет к гашению Alexa-647-АТФ, связанного с соседними субъединицами, и увеличивает вероятность того, что неспецифическое связывание нуклеотидов приведет к FRET. Поскольку сайт связывания лиганда в рецепторах P2X является внеклеточным, измерения связывания будут выполняться на интактных клетках, в зажиме напряжения всей клетки или в наружных мембранных пятнах. Наш метод также может быть расширен для изучения связывания и активации электрогенных и неэлектрогенных транспортеров и насосов, которые зависят от АТФ для своего реакционного цикла, а также P2Y-рецепторов, связанных с G-белком. Наконец, несмотря на то, что мы разработали этот метод для измерения связывания адениновых нуклеотидов (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP), тот же подход может быть использован для изучения связывания практически с любым рецептором, для которого был идентифицирован подходящий флуоресцентный лиганд.

Несколько важных классов белка напрямую регулируются связыванием лигандов. Они варьируются от растворимых ферментов до белков, встроенных в мембрану, включая рецепторные тирозинкиназы, рецепторы, связанные с G-белком (GPCR), и ионные каналы. GPCR и каналы составляют ~ 34% и ~ 15% всех текущих мишеней для лекарств, соответственно 1,2. Таким образом, существует значительный биохимический, а также медицинский интерес к разработке методов, которые обеспечивают механистическое понимание взаимодействия лиганд-рецептор. Традиционные методы измерения связывания лигандов, включая фотоаффинную маркировку и исследования связывания радиолигандов, требуют большого количества частично очищенного белка и обычно выполняются в нефизиологических условиях и временных масштабах. Идеальный метод требовал бы только небольших количеств белка, мог бы быть выполнен на интактных белках, экспрессируемых в клеточной или мембранной среде, мог бы контролироваться в режиме реального времени и был бы совместим с прямыми показаниями функции белка.
Резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) — это метод, который обнаруживает близость между двумя флуоресцентно меченными молекулами3. FRET возникает, когда возбужденный донорный флуорофор передает энергию безызлучательным образом молекуле-акцептору (обычно другому флуорофору). Перенос энергии приводит к гашению донорного флуоресцентного излучения и сенсибилизации акцепторного излучения (если акцептором является флуорофор). Эффективность переноса зависит от6-й степени расстояния между донором и акцептором. Кроме того, донор и акцептор должны находиться в непосредственной близости (обычно менее 10 нм) для возникновения FRET. Таким образом, FRET может быть использован для измерения прямого связывания между флуоресцентно меченным белковым рецептором и флуоресцентным лигандом.
Несколько различных белков регулируются или активируются путем связывания внутриклеточных или внеклеточных адениновых нуклеотидов (АТФ, АДФ, АМФ, цАМФ). Многие белки-транспортеры требуют гидролиза АТФ для своего реакционного цикла, включая АТФ-связывающие кассетные транспортеры и АТФазы P-типа, такие как насос Na+/K+ 4,5. АТФ-чувствительные К+ (КАТФ) каналы, трансмембранный регулятор проводимости муковисцидоза (CFTR) и циклично-нуклеотидные регулируемые каналы — все это ионные каналы, которые управляются связыванием внутриклеточных адениновых нуклеотидов, что делает их чрезвычайно чувствительными к изменениям клеточного метаболизма и сигнальной трансдукции 6,7,8 . Пуринергические рецепторы P2X и P2Y реагируют на изменения внеклеточного АТФ, который может высвобождаться в виде нейротрансмиттера или в результате повреждения тканей9. Мы разработали анализ на основе FRET для измерения связывания адениновых нуклеотидов с мембранными белками в режиме реального времени. Ранее мы уже применяли этот метод для изучения связывания нуклеотидов с каналами КАТФ 10,11.
Чтобы измерить связывание нуклеотидов через FRET, интересующий белок должен быть сначала помечен флуорофором. Флуоресцентная метка должна быть вставлена в интересующий белок таким образом, чтобы она находилась достаточно близко к сайту связывания лиганда для возникновения FRET, с особой осторожностью, чтобы гарантировать, что метка не влияет на общую структуру и функцию белка. Для этого мы используем метод, разработанный Чаттерджи и др., с использованием подавления янтарного стоп-кодона для вставки флуоресцентной неканонической аминокислоты (l-3- (6-ацетилнафталин-2-иламино)-2-аминопропионовая; ANAP) на нужном участке12. Мы измеряем связывание нуклеотидов как FRET между меченным ANAP белком и флуоресцентными производными тринитрофенила (TNP) нуклеотида (рис. 1A). Спектр излучения для ANAP перекрывается со спектром поглощения TNP-нуклеотидов, что является условием, необходимым для возникновения FRET (рис. 1B). Здесь мы опишем два разных типа эксперимента по связыванию. Во-первых, связывание нуклеотидов с внутриклеточной стороной меченых ANAP каналов KATP измеряется в клетках, которые были открыты ультразвуком, оставляя адгезивные фрагменты плазматической мембраны на стеклянном покровном листке10,11,13,14.
Во втором методе связывание нуклеотидов с мечеными ANAP каналами KATP измеряется в мембранном пластыре под зажимом напряжения, что позволяет одновременно измерять ионные токи и флуоресценцию. Комбинируя эти два экспериментальных подхода, изменения в связывании могут быть напрямую коррелированы с изменениями в функцииканала 11. Обсуждаются типичные результаты, потенциальные подводные камни и анализ данных.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

Мы разработали метод измерения связывания адениновых нуклеотидов с интактными функциональными трансмембранными рецепторами в клеточной или мембранной среде. Этот метод сочетает в себе экспрессию белков, меченных флуоресцентной неканонической аминокислотой ANAP, и FRET между ANAP и производными флуоресцентных (тринитрофенил) нуклеотидов. Мы представляем примеры связывания нуклеотидов с ионными каналами K ATP, меченнымиANAP , измеренными в непокрытых плазматических мембранах и иссеченных, вывернутых наизнанку мембранных пятнах под зажимом напряжения. Последний позволяет одновременно измерять связывание лиганда и ток канала, прямое считывание функции белка. Подробно обсуждаются обработка и анализ данных, а также потенциальные подводные камни и артефакты. Этот метод обеспечивает богатое механистическое понимание лиганд-зависимого стробирования каналов KАТФ и может быть легко адаптирован для изучения других белков, регулируемых нуклеотидами, или любого рецептора, для которого может быть идентифицирован подходящий флуоресцентный лиганд.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

В этом протоколе представлен метод измерения связывания адениновых нуклеотидов с рецепторами в режиме реального времени в клеточной среде. Связывание измеряется как резонансный перенос энергии Фёрстера (FRET) между производными тринитрофенилнуклеотидов и белком, меченным неканонической флуоресцентной аминокислотой.

Измерение связывания нуклеотидов с интактными функциональными мембранными белками в режиме реального времени

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Поскольку АТФ является важным клеточным мессенджером, мы разработали метод, который позволяет нам измерять связывание АТФ с его рецепторами с высокой точностью. Используя FRET между производными нуклеотидов и флуоресцентно меченными белками, мы можем контролировать связывание нуклеотидов с интактными функциональными рецепторами в режиме реального времени и с отличным пространственным разрешением. Мы используем этот метод, чтобы понять влияние клеточного метаболизма на чувствительный к АТФ калиевый канал, который участвует в определенных формах диабета.Чтобы провести эксперимент с мембраной без крыши, сначала используйте пару щипцов, чтобы вырвать небольшой фрагмент из покровного стекла с трансфицированными клетками и промыть фрагмент PBS. Если покровное стекло предварительно покрыто полилизином, поместите фрагмент на дно 35-миллиметровой тарелки, содержащей два миллилитра PBS, и держите ультразвуковой аппарат с трехмиллиметровым зондом на три-пять миллиметров над образцом, пульсирующий с мощностью 50 Вт и амплитудой от 20 до 40% в течение 200-500 миллисекунд, чтобы разблокировать ячейки. Если покровные шликеры не покрыты предварительным покрытием, после промывки PBS окуните фрагмент в пробирку, содержащую 0,1% поли-L-лизина, примерно на 30 секунд, прежде чем вскрывать клетки с помощью краткой обработки ультразвуком, как показано на рисунке.Перенесите обработанный ультразвуком фрагмент в покрытую стеклянным дном 35-миллиметровую тарелку, содержащую два миллилитра раствора для ванны, и установите чашку на инвертированный микроскоп, оснащенный объективом с высокой числовой апертурой и 60-кратным погружением в воду. Убедитесь, что порт камеры микроскопа подключен к спектрографу последовательно с высокочувствительной ПЗС-камерой, и используйте перистальтический насос для перфузии камеры ванны с буфером со скоростью потока от 0,5 до одного миллилитра буфера в минуту. Чтобы идентифицировать фрагменты мембраны без крыши, экспрессирующие меченый ANAP канал, просмотрите образец, чтобы найти мембраны с флуоресцентными каналами.Частично задействуйте маску спектрометра между портом камеры на микроскопе и спектрографом. Тень маски появится на изображении камеры. Получите яркое поле и флуоресцентное изображение непокрытой мембраны, чтобы можно было выбрать интересующую область для анализа.Поднесите наконечник микрообъемной перфузионной системы близко к непокрытой мембране. Чтобы получить изображение флуоресценции ANAP, возбуждайте мембрану 385-нанометровым светодиодом через 390/18-нанометровый полосовой фильтр возбуждения и 416-нанометровый краевой дихроичный, собирая излучаемый свет через 400-нанометровый длинночастотный эмиссионный фильтр. Включите маску спектрометра и убедитесь, что излучаемый свет пропускается.Совместите интересующую область с прорезью маски спектрометра. Задействуйте решетки спектрометра. Когда решетки установлены, свет, рассеиваемый спектрометром, будет проецироваться на чип ПЗС-камеры для получения спектральных изображений.Изображения сохранят пространственную информацию в измерении Y. Измерение X будет заменено длиной волны. При перфузии буферным раствором без нуклеотидов получите одно или несколько экспозиций от 0,1 до десяти секунд для последующей коррекции и нормализации данных, собранных в течение остальной части эксперимента.Затем нанесите диапазон концентраций ТНП АТФ в растворе ванны, чтобы установить кривую реакции на концентрацию, перфузируя каждый раствор в течение не менее одной минуты, чтобы обеспечить достижение устойчивого состояния и получить воздействие для каждой концентрации. После каждой концентрации промывайте АТФ ТНП раствором для ванны без нуклеотидов в течение не менее одной минуты, прежде чем получить изображение воздействия после обработки. Чтобы провести эксперимент с флуорометрией с пластырем, сначала вытащите пластырные пипетки из толстостенных капилляров из боросиликатного стекла до сопротивления от 1,5 до 2,5 мегаом при заполнении раствором пипетки.Затем перенесите покровное стекло с трансфицированными ячейками в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном, содержащую два миллилитра раствора для ванны, и установите чашку на перевернутый микроскоп. Перфузируйте камеру ванны раствором для ванны и определите клетку, экспрессирующую каналы, меченные ANAP. Слегка надавите на пластырь-пипетку и поместите пипетку в ванну.Прижмите пипетку к мембране клетки и аккуратно отсосите для достижения уплотнения в гигаом. Чтобы удалить пластырь, быстро отодвиньте держатель пипетки от заплатанной ячейки. Поднесите наконечник пластыря к кончику перфузионной системы и убедитесь, что пластырь находится в щели маски спектрометра.Затем нанесите ТНП АТФ и соберите спектры изображений. На этих изображениях можно наблюдать типичный фрагмент мембраны из клетки HEK293T, экспрессирующей чувствительные к АТФ калиевые каналы, помеченные оранжевым флуоресцентным белком. На этом спектральном изображении чувствительных к АТФ калиевых каналов, помеченных ANAP, в непокрытой мембране из клетки HEK293T, подвергшейся воздействию пяти микромолярных TNP ATP, можно наблюдать две области высокой интенсивности, которые соответствуют пиковому излучению ANAP и TNP АТФ.Окончательный спектр может быть получен путем вычитания усредненного фонового спектра из усредненной области спектра интереса. Здесь можно наблюдать снижение пиковой флуоресценции ANAP после многократного воздействия. Пиковая флуоресценция от нескольких воздействий в отсутствие ТНП АТФ была подогнана к одному экспоненциальному распаду.Затем эти данные были использованы для исправления артефактов фотообесцвечивания. Здесь показаны репрезентативные спектральные изображения с непокрытой мембраны, полученные из клетки, экспрессирующей чувствительные к АТФ калиевые каналы, меченные ANAP, в отсутствие и присутствии TNP ATP. Наблюдение за скорректированными спектрами излучения показывает четкое разделение между донорным и акцепторным флуоресцентным излучением.На этом рисунке показаны репрезентативные токи и спектры чувствительных к АТФ калиевых каналов, помеченных ANAP, из типичного эксперимента по флуорометрии с патч-зажимом. Спектры излучения скорректированы на фон и обесцвечивание, как показано для непокрытых мембран. Будьте осторожны с элементами управления, чтобы убедиться, что флуоресцентный сигнал специфичен для вашего рецептора.Убедитесь, что ваше изобилие быстрое, эффективное и полное, и держите экспозицию как можно короче. Этот метод отвечает на вопросы о занятости рецепторов и о том, как она связана с функцией. Другие методы FRET, используемые с аналогичной установкой, могут исследовать индуцированные лигандом подтверждающие изменения в рецепторе.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Используя строительные леса, липосом Развести липидами проксимальный белок-белковых взаимодействий<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Метод визуализации и анализа Мембранные белков, взаимодействующих с помощью просвечивающей электронной микроскопии

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Измерения транс плазмы мембраны переноса электронов, C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Мониторинг GPCR-я-arrestin1/2 Взаимодействия в режиме реального времени живых систем для ускорения обнаружения наркотиков

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...