Name: measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time
Uploaded: 2021-03-11T12:30:00
Duration: 8 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Raul Terron Exposito'ya mükemmel teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BB/R002517/1; MCP ve FMA) ve Wellcome Trust (203731/Z/16/A; SGU)

1. Kapak fişlerinin hazırlanması
NOT: Bu adımlar steril doku kültürü başlığında gerçekleştirilmelidir. 10 yemeğin hazırlanması için miktarlar verilir.
<ol><li>On otoklavlanmış, 30 mm borosilikat kapak camı kaymalarını ayrı ayrı on adet 35 mm işlenmemiş steril tabağa yerleştirin ve 2 mL steril, damıtılmış su ile bir kez durulayın.</li>
	<li>1 mL'lik %0,1'lik w/v poli-L-lizin çözeltisini steril, damıtılmış suya toplam 10 mL hacme kadar seyreltin (%0,01 w/v nihai konsantrasyon). İyice karıştırın, ardından her bir kapak kaymasına 1 mL pipet yapın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Poli-L-lizini aspire edin ve her kapak kaymasını en az 2 mL steril damıtılmış su ile iki kez yıkayın. Tamamen kuruyana kadar, yani en az 3 saat bekletin.</li>
</ol>2. HEK-293T hücrelerinin tohumlanması
NOT: Bu adımlar bir doku kültürü başlığında gerçekleşmelidir. HEK-293T hücreleri, düşük akımlı arka planları ve kültürde büyüme kolaylığı nedeniyle seçildi. Bu protokol diğer hücre tiplerine uyarlanabilir.
<ol><li>2-5 dakika boyunca 2 mL tripsin ile inkübe etmeden önce veya hücreler tamamen ayrılana ve neredeyse tamamen ayrışana kadar 12 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile% 80-90 oranında birleşen bir T75 HEK-293T hücresi şişesini durulayın.</li>
	<li>% 10 fetal sığır serumu, 100 U / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin ile desteklenmiş 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyerek hücreleri yeniden askıya alın. Kalan hücre kümelerini parçalamak için şişenin dibine nazikçe pipet yapın.</li>
	<li>Kaplamalı kapak fişleri içeren istenen sayıda 35 mm'lik tabağa 2 mL takviyeli DMEM ekleyin. Her çanağa 100 μL yeniden askıya alınmış hücre ekleyin. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
</ol>3. Transfeksiyon
NOT: Bu adımlar bir doku kültürü başlığında gerçekleşmelidir. 10 yemeğin transfeksiyonu için miktarlar verilir. Bölgeye özgü ANAP birleştirme için, etiketleme için amaçlanan konumdaki DNA kodonu amber (TAG) durdurma kodonu ile değiştirilmelidir. Bu yapı iki plazmid ile birlikte transfekte edilir: pANAP ve peRF1-E55D12,15. pANAP, ANAP'a özgü bir tRNA / tRNA sentetaz çiftinin birkaç kopyasını kodlar. ANAP varlığında, bu plazmidin transfeksiyonu, amber stop kodonunu tanıyan ANAP yüklü tRNA üretir. peRF1-E55D, tam uzunlukta, ANAP etiketli proteinin verimini artıran baskın bir negatif ribozomal salınım faktörünü kodlar.
<ol><li>ANAP ile etiketlemeye yönelik yapı için 10 μg pANAP, 10 μg peRF1-E55D ve DNA içeren 1,5 mL'lik bir tüp hazırlayın. Takviye edilmemiş DMEM ile 500 μL'lik son bir hacme getirin.</li>
	<li>Ayrı bir tüpte, her 1 μg DNA için 3 μL lipit bazlı transfeksiyon reaktifi ( Malzeme Tablosuna bakınız) hazırlayın ve takviye edilmemiş DMEM ile 500 μL'lik son bir hacme getirin.</li>
	<li>DNA ve transfeksiyon reaktif karışımlarını tek bir tüpte birleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.</li>
	<li>20 μM ANAP'ın nihai konsantrasyonu için 20 mL takviyeli DMEM'e 1 mM ANAP stoğunun 400 μL'sini (30 mM NaOH'da trifloroasetat tuzu) ekleyin. Kaplama hücrelerdeki eski ortamı, çanak başına 2 mL ANAP içeren ortamla değiştirin.</li>
	<li>DNA transfeksiyonunun% 10'unu pipet her bir kabın üzerine karıştırır. Deneylerden önce 2-4 gün boyunca 33 ° C'de inkübe edin. 33 ° C'de inkübasyon, hücre bölünmesini yavaşlatır ve hücre başına protein verimini arttırır16.</li>
</ol>4. Çatısız membran deneyleri
<ol><li>Transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasını daha küçük parçalara ayırmak için bir çift forseps kullanın.</li>
	<li>Çatı hücrelerini açmak için aşağıdaki prosedürlerden birini izleyin.<ol><li>Önceden kaplanmış kapak kaymaları kullanıyorsanız, bir parçayı PBS ile durulayın, ardından 2 mL PBS içeren 35 mm'lik bir kabın altına yerleştirin. Çatı hücrelerini açmak ve yapışkan plazma membran parçalarını geride bırakmak için numunenin 3-5 mm yukarısına yerleştirilmiş bir prob sonikatör (50 W,% 20 -% 40 genlik, 3 mm prob) kullanarak kısaca sonikleştirin (Şekil 2A, C). NOT: Numunenin üzerindeki Sonicator gücü, süresi ve prob yüksekliği, kapak kaymasını tamamen reddetmeden yüksek miktarda çatısız membran elde etmek için değiştirilebilir.</li>
		<li>Önceden kaplanmış kapak fişleri kullanmıyorsanız, bir kapak kayma parçasını PBS ile durulayın, daha sonra çatıdan arındırmak ve çatısız / kısmen çatısız plazma membran parçalarını geride bırakmak için kısaca sonikasyon yapmadan önce (adım 4.2.1'de olduğu gibi) ~ 30 s boyunca% 0.1 w / v poli-L-lizin içeren bir tüpe daldırın (Şekil 2A, C, D). Poli-L-lizine kısa süreli maruz kalmaların, kapak kayması13'e yapışmayı arttırdığı gösterilmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Sonikasyonlu parçayı 2 mL banyo çözeltisi içeren bir kapak cam tabanlı 35 mm tabağa yerleştirin ve yüksek NA, 60x suya daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopa monte edin. Mikroskobun kamera portu, yüksek hassasiyetli bir CCD kamera ile seri olarak bir spektrografa bağlanır. Banyo odasını (0,5 – 1 mL/dak) peristaltik bir pompa kullanarak tamponla perfüze edin. Tamponun bileşimi, incelenen proteine bağlı olarak değişecektir. NOT: Kullanıcının uzun çalışma mesafesine sahip bir hedefe erişimi yoksa, kapak kaymasının ekstra yüksekliği nedeniyle çatısız membran parçalarına odaklanmak imkansız olabilir. Bir alternatif, hücreleri doğrudan poli-L-lizin cam tabanlı tabaklara tohumlamaktır (bir örnek için Malzeme Tablosuna bakınız). Bu aynı zamanda iki cam parçasından odaklama ile ilişkili görüntüdeki potansiyel sapmaları da azaltacaktır. Bu sapmalar, elde edilen spektrumların şeklini etkilemez.</li>
	<li>Kanal floresansını arayarak ANAP etiketli kanalı ifade eden çatısız membran parçalarını tanımlayın (Şekil 2C,D). NOT: İlgilenilen proteini içeren çatısız membranların tanımlanmasına yardımcı olmak için ek bir floresan etiket (emisyon spektrumunun ANAP emisyon spektrumundan ayırt edilebildiği yerlerde) kullanılması önerilir. Şekil 2C,D'deki deneyler ANAP etiketli kanallarda C-terminal floresan protein etiketleri ile gerçekleştirilmiştir.</li>
	<li>Spektrometre maskesini mikroskop üzerindeki kamera portu ile spektrograf arasında kısmen devreye sokun. Maskenin gölgesi kamera görüntüsünde görünecektir. Mikroskop aşamasını ayarlayarak çatısız membranı spektrometre maskesiyle hizalayın. Çatısız membranın parlak bir alan ve floresan görüntüsünü elde edin. Bunlar, analiz için ilgilenilen bir bölgeyi seçmek için kullanılacaktır.</li>
	<li>Mikrohacim perfüzyon sisteminin ucunu çatısız membrana yaklaştırın. NOT: Arka plan floresansını azaltmak için, perfüzyon sisteminin çıkışı borosilikat camdan yapılmış özel bir uçla değiştirildi.</li>
	<li>Floresan spektrumlarını görüntülemek için, 390/18 nm bant geçişli uyarma filtresi ve 416 nm kenar dikroik aracılığıyla 385 nm LED ile membranı heyecanlandırın. Yayılan ışığı 400 nm uzun geçirgen emisyon filtresinden toplayın (Şekil 2B).</li>
	<li>Spektrometre maskesini takın ve yayılan ışığın içinden geçtiğinden emin olun. Spektrometre ızgaralarını (300 oluk/mm) takın. Izgaralar yerleştirildiğinde, spektrometre tarafından kırılan ışık, spektral görüntüler üretmek için CCD kameranın çipine yansıtılacaktır (Şekil 3A). Bu görüntüler uzamsal bilgileri y boyutunda tutar. X boyutu dalga boyu ile değiştirilir.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, ilgilenilen protein bir floresan proteini ile etiketlenmişse, uygun filtre setini kullanarak floresan proteininin spektral bir görüntüsünü elde edin.</li>
	<li>Nükleotid içermeyen tampon çözeltisini perfüzyon ederken deneyin başında bir veya daha fazla 0.1-10 s pozlama alın. Bunlar, denemenin geri kalanı boyunca verileri düzeltmek ve normalleştirmek için kullanılacaktır (aşağıdaki bölüm 5'e bakın). NOT: Pozlama süresinin seçimi, elde edilen ifade seviyesine, floroforun parlaklığına ve optiklere bağlı olacaktır. Maruz kalma süresi, sinyali en üst düzeye çıkarmak ve gözlemlenen ağartma oranını en aza indirmek için seçilmelidir. 4.10'da verilen maruz kalma süresi aralığı, denge bağlama ölçümleri için uygundur, ancak daha yavaş kinetik değişiklikleri ölçmek için yararlı olabilir10. Daha hızlı kinetiği izlemek için kısa pozlama sürelerini kullanma yeteneği, donanımdan ziyade protein ekspresyon seviyeleri ve fotobeyazlatma ile sınırlı olacaktır.</li>
	<li>Bir konsantrasyon-tepki eğrisi oluşturmak için bir dizi TNP-ATP konsantrasyonu (genellikle banyo çözeltisinde hazırlanır) uygulayın. Sabit bir duruma ulaşıldığından emin olmak için her çözeltiyi en az 1 dakika perfüze edin ve her konsantrasyonu en az 1 dakika boyunca banyo çözeltisi ile yıkayın. NOT: Perfüzyon sisteminin hızlı bir şekilde dengeye ulaşabilmesini (Şekil 2E) ve TNP-ATP'nin doğru yerel konsantrasyonunu (Şekil 2F) elde edebilmesini sağlamak önemlidir.</li>
	<li>Her konsantrasyonda ve her yıkamanın sonunda bir pozlama yapın (adım 4.10'da kullanılanla aynı sürede).</li>
</ol>5. Spektral analiz
NOT: Bu talimatlar, GitHub'da bulunan "pcf.m" analiz koduyla kullanılmak üzere yazılmıştır. https://github.com/mpuljung/spectra-analysis10. Ek ve alternatif kod https://github.com/smusher/KATP_paper_201911'de bulunabilir. Yazılım tarafından gerçekleştirilen işlemleri burada açıkladık, böylece kullanıcı kendi kodunu oluşturabilir veya verileri manuel olarak analiz etmeyi seçebilir.
<ol><li>Komut satırına programın adını ("pcf") yazarak analiz programını başlatın.</li>
	<li>"ROI için dosyaları seç" istemiyle açık bir dosya/klasör iletişim kutusu açıldığında, çatısız membranın parlak alan ve floresan görüntüleriyle ilişkili dosya adlarını seçin. Komut satırında çıktı dosyasının adını yazmak için bir istem görüntülenir.</li>
	<li>Dosya adını yazın ve enter tuşuna basın.</li>
	<li>Yazılım parlak alan ve floresan görüntüleri görüntülediğinde, yazılım istemlerini izleyerek çatısız membran parçasının veya eksize edilmiş yamanın konumuna karşılık gelen spektral görüntüde bir ilgi alanı (ROI) seçin (bkz. bölüm 6). Aynı spektral görüntüde (ROI'deki ile aynı dalga boyu aralığını temsil eden) bir arka plan bölgesi seçin, kapak kaymasının veya çanağın membran takılı olmayan bir bölümüne karşılık gelir (Şekil 3A). Yazılım, YG'nin Üst Kısmına tıklamanızı ve Enter tuşuna basmanızı, YG'nin altına tıklamanızı ve Enter tuşuna basmanızı ve ardından arka plan bölgesi için bu işlemi tekrarlamanızı isteyecektir.</li>
	<li>Açık bir dosya/klasör iletişim kutusu "FP Spektrumu için Dosya Seç" istemiyle açıldığında, floresan protein (FP) spektrumuyla ilişkili dosya adını seçin (isteğe bağlı adım 4.9). FP spektrumu alınmamışsa, farklı bir spektrum dosyası seçin. FP spektrumu, etiketli protein ve arka plan floresansı arasında ayrım yapmak için kalite kontrol görevi görür.</li>
	<li>"Select Files for Analyisis" istemiyle açık bir dosya/klasör iletişim kutusu açıldığında, ağartıcı düzeltmesi için gereken dosyalar da dahil olmak üzere ANAP spektrumlarına karşılık gelen tüm dosyaları (4.10 ila 4.12 arası adımlardan) seçin.</li>
	<li>"Ağartma Toplama için Dosyaları Seç" istemiyle açık bir dosya/klasör iletişim kutusu açıldığında, deneyin başında nükleotid içermeyen çözeltide elde edilen ilk spektrumlara karşılık gelen adım 5.6'daki dosyaların alt kümesini veya düzeltme için kullanılacak nükleotid içermeyen çözeltideki yıkamalar sırasında elde edilen spektrumları seçin (4.10'dan 4.12'ye kadar).</li>
	<li>Spektrum üretmek için her görüntünün çizgi ortalaması, yani her dalga boyundaki bir ROI veya arka plan bölgesinin y boyutundaki tüm piksellerin yoğunluğunun ortalaması. (Şekil 3B). Arka plan floresansını ve floresansını bağlanmamış TNP-ATP'den çıkarmak için ROI'den elde edilen ortalama arka plan spektrumunu ROI'den elde edilen ortalama spektrumdan çıkarın (Şekil 3C). Bu adımlar yazılım tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir.</li>
	<li>Çıkarılan spektrumun ANAP zirvesi etrafında ortalanmış 5 nm'lik bir pencerenin yoğunluğunun ortalamasını alarak her pozlama için ANAP yoğunluğunu belirleyin (tipik olarak ~ 470 nm, ancak ANAP kalıntısının yerel mikro ortamına bağlı olarak değişebilir). NOT: Şekil 3D , ANAP etiketli kanalları ifade eden çatısız bir membran parçasının ardışık 10 s pozlamalarından elde edilen 6 spektrumu göstermektedir. İç kısım, her spektrumun zirvesinin ortalama yoğunluğunu gösterir. Yazılım, elde edilen ilk spektrumdaki tepe dalga boyunu otomatik olarak bulacak ve bu değeri baştan sona kullanacaktır. Yoğunluk yazılım tarafından otomatik olarak hesaplanacaktır.</li>
	<li>Belirli bir maruziyetin (F) ANAP yoğunluğunu, adım 4.10'da (Fmax) atılan zaman serisindeki ilk maruziyetin ANAP yoğunluğuna bölerek her deney için ANAP yoğunluklarını normalleştirin. Yine, yazılım bu hesaplamaları otomatik olarak gerçekleştirir.</li>
	<li>Veri elde etmek için aşağıdaki adımları uygulayın.<ol><li>ANAP fotobeyazlatmayı düzeltmek için, önce tek bir üstel bozunum, (F / Fmax) = A * exp (-t / τ) + (1-A), burada t kümülatif maruz kalma süresidir, τ zaman sabitidir ve A genliktir) TNP-ATP uygulamaları arasındaki ara yıkama adımlarına veya TNP-ATP'de yıkamadan önce alınan çoklu ilk maruziyetlere (Şekil 3D, girinti). NOT: Yazılım bu uyumu görüntüleyecek ve kabul etmenizi veya reddetmenizi isteyecektir. Uyum reddedilirse, ağartma düzeltmesi için dosyaları seçmek için başka bir fırsat sağlanacaktır.</li>
		<li>Normalleştirilmiş (adım 5.10'da) ANAP spektrumlarını, her zaman noktasında adım 5.11.1'den üstel uyumun tahmin edilen değerine bölün (Şekil 3E). NOT: Gösterilen örnek için, 50 sn'de gözlenen normalleştirilmiş tepe floresanı 0.65'tir ve üstel uyumdan tahmin edilen floresan 0.64'tür. Ağartmayı düzeltmek için, düzeltilmiş değeri (~1, Şekil 3E girişi, renkli daire) üretmek için gözlemlenen değeri (0,65, Şekil 3E girişi, boş daire) tahmin edilen değere (0,64, Şekil 3E girişi, kesikli çizgi) bölün. Beyazlatma düzeltmesi yeterliyse, nükleotidlerin yokluğunda elde edilen tüm maruziyetlerden ANAP yoğunluğu yaklaşık olarak eşit olmalıdır (Şekil 3E). Bu hesaplamalar yazılım tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir.</li>
		<li>Çıktıyı, verileri çizen bir görüntü olarak ve ham spektrumları, çıkarılmış spektrumları, fotobeyazlatma için düzeltilmiş spektrumları ve her dosya için tepe verilerini içeren sekmeli bir elektronik tablo olarak elde edin, böylece daha fazla analiz yapılabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Yama-kelepçe florometri deneyleri
<ol><li>Yama pipetlerini kalın cidarlı borosilikat cam kılcal damarlardan pipet çözeltisi ile doldurulduğunda 1,5 MΩ ila 2,5 MΩ direnç gösterecek şekilde çekin. Pipet çözeltisinin bileşimi, incelenen proteine bağlı olarak değişecektir.</li>
	<li>Transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasını, 2 mL banyo çözeltisi içeren bir kapak camı tabanlı 35 mm'lik bir kabın üzerine aktarın ve yüksek NA, 60x suya daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskopa monte edin. Banyo odasını (0,5 – 1 mL/dak) peristaltik bir pompa kullanarak banyo solüsyonu ile perfüze edin. Pipet çözeltisine gelince, banyo çözeltisi incelenen proteine bağlı olarak değişecektir.</li>
	<li>Hücre zarında floresan arayarak ANAP etiketli kanalları eksprese eden bir hücreyi tanımlayın.</li>
	<li>Bir yama pipetini pipet çözeltisiyle doldurun. Pipete hafif pozitif basınç uygulayın ve banyo odasına yerleştirin. Pipetinizi hücrenin zarına bastırın ve GΩ sızdırmazlığı elde etmek için nazik emme uygulayın (Şekil 4A).</li>
	<li>Pipet tutucuyu hücreden hızla uzaklaştırarak yamayı tüketin (Şekil 4A). NOT: Yamanın bu şekilde eksize edilmesi, proteinin sitozolik alanları perfüzyon sistemine maruz kalacak şekilde içten dışa bir yama oluşturmalıdır. İncelenen nükleotid bağlanma bölgesinin yeri sitosolik değilse, PCF deneylerini gerçekleştirmek için dışardan dışarıya yamalar veya tüm hücre kayıtları kullanmak gerekecektir.</li>
	<li>Yama pipetinin ucunu perfüzyon sisteminin ucuna yaklaştırın ve yamanın spektrometre maskesinin yarığı içinde olup olmadığını kontrol edin (Şekil 4A).</li>
	<li>TNP-ATP ve görüntü spektrumlarını 4.10-4.12 adımlarındaki gibi uygularken, aynı anda nükleotid uygulamasına iyonik akım tepkisini kaydedin. NOT: Pipet camı, elde edilen görüntülerde uzamsal sapmalara ve yansımalara neden olabilir. Bununla birlikte, bu sapmalar elde edilen spektrumların şeklini etkilemeyecektir ve yansıyan uyarma ışığı, spektrograf veya uzun geçişli bir emisyon filtresi kullanılarak floresandan kolayca ayrılır.</li>
	<li>Spektrumları analiz edin. Eksize edilmiş yamalardan görüntülenen spektrumlar, TNP-ATP'nin yama pipetinin camından dışlanması nedeniyle bağlanmamış TNP-ATP floresansının aşırı çıkarılmasını gösterebilir (Şekil 4C-E). Bu aşırı çıkarma ANAP emisyon spektrumunu etkilemez ve bu nedenle göz ardı edilebilir. NOT: Eksize edilmiş yamalardaki floresan sinyali, çatısız membranlardan daha düşük olacağından, ANAP'ı çok hızlı bir şekilde ağartmadan yeterince yüksek sinyal-gürültü veren bir maruz kalma süresi kullanmak önemlidir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Garcia, M. L., Kaczorowski, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+find+a+pathway+for+therapeutic+success.">Ion channels find a pathway for therapeutic success.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5472-5474 (2016).</li><li>Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schioth, H. B., Gloriam, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trends+in+GPCR+drug+discovery:+new+agents,+targets+and+indications.">Trends in GPCR drug discovery: new agents, targets and indications.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (12), 829-842 (2017).</li><li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd edn. , (2006).</li><li>Higgins, C. F., Linton, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ATP+switch+model+for+ABC+transporters.">The ATP switch model for ABC transporters.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 11 (10), 918-926 (2004).</li><li>Toyoshima, C., Cornelius, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+crystal+structures+of+PII-type+ATPases:+excitement+continues.">New crystal structures of PII-type ATPases: excitement continues.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23 (4), 507-514 (2013).</li><li>Craven, K. B., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNG+and+HCN+channels:+two+peas,+one+pod.">CNG and HCN channels: two peas, one pod.</a> Annual Review of Physiology. 68, 375-401 (2006).</li><li>Csanady, L., Vergani, P., Gadsby, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strict+coupling+between+CFTR's+catalytic+cycle+and+gating+of+its+Cl-+ion+pore+revealed+by+distributions+of+open+channel+burst+durations.">Strict coupling between CFTR's catalytic cycle and gating of its Cl- ion pore revealed by distributions of open channel burst durations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (3), 1241-1246 (2010).</li><li>Vedovato, N., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nucleotide-Binding+Sites+of+SUR1:+A+Mechanistic+Model.">The Nucleotide-Binding Sites of SUR1: A Mechanistic Model.</a> Biophysical Journal. 109 (12), 2452-2460 (2015).</li><li>Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+the+Special+Issue+on+Purinergic+Receptors.">Introduction to the Special Issue on Purinergic Receptors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1051, 1-6 (2017).</li><li>Puljung, M., Vedovato, N., Usher, S., Ashcroft, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+mechanism+of+ATP-sensitive+K(+)+channels+explored+with+real-time+nucleotide+binding.">Activation mechanism of ATP-sensitive K(+) channels explored with real-time nucleotide binding.</a> Elife. 8, 41103 (2019).</li><li>Usher, S. G., Ashcroft, F. M., Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+inhibition+of+the+pancreatic+ATP-sensitive+K++channel+explored+with+patch-clamp+fluorometry.">Nucleotide inhibition of the pancreatic ATP-sensitive K+ channel explored with patch-clamp fluorometry.</a> Elife. 9, 52775 (2020).</li><li>Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+fluorescent+probe+in+mammalian+cells.">A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12540-12543 (2013).</li><li>Gordon, S. E., Senning, E. N., Aman, T. K., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transition+metal+ion+FRET+to+measure+short-range+distances+at+the+intracellular+surface+of+the+plasma+membrane.">Transition metal ion FRET to measure short-range distances at the intracellular surface of the plasma membrane.</a> Journal of General Physiology. 147 (2), 189-200 (2016).</li><li>Heuser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+production+of+'cell+cortices'+for+light+and+electron+microscopy.">The production of 'cell cortices' for light and electron microscopy.</a> Traffic. 1 (7), 545-552 (2000).</li><li>Schmied, W. H., Elsasser, S. J., Uttamapinant, C., Chin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+multisite+unnatural+amino+acid+incorporation+in+mammalian+cells+via+optimized+pyrrolysyl+tRNA+synthetase/tRNA+expression+and+engineered+eRF1.">Efficient multisite unnatural amino acid incorporation in mammalian cells via optimized pyrrolysyl tRNA synthetase/tRNA expression and engineered eRF1.</a> Journal of the American Chemical Society. 136 (44), 15577-15583 (2014).</li><li>Lin, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+Protein+Expression+in+HEK-293+Cells+by+Lowering+Culture+Temperature.">Enhancing Protein Expression in HEK-293 Cells by Lowering Culture Temperature.</a> PloS One. 10 (4), 0123562 (2015).</li><li>Usukura, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+unroofing+technique+for+atomic+force+microscopic+imaging+of+the+intra-cellular+cytoskeleton+under+aqueous+conditions.">Use of the unroofing technique for atomic force microscopic imaging of the intra-cellular cytoskeleton under aqueous conditions.</a> Journal of Electron Microscopy. 61 (5), 321-326 (2012).</li><li>Colquhoun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding,+gating,+affinity+and+efficacy:+the+interpretation+of+structure-activity+relationships+for+agonists+and+of+the+effects+of+mutating+receptors.">Binding, gating, affinity and efficacy: the interpretation of structure-activity relationships for agonists and of the effects of mutating receptors.</a> British Journal of Pharmacology. 125 (5), 924-947 (1998).</li><li>Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+physical+measure+of+conformational+rearrangement+underlying+potassium+channel+gating.">Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating.</a> Science. 271 (5246), 213-216 (1996).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gating+rearrangements+in+cyclic+nucleotide-gated+channels+revealed+by+patch-clamp+fluorometry.">Gating rearrangements in cyclic nucleotide-gated channels revealed by patch-clamp fluorometry.</a> Neuron. 28 (2), 369-374 (2000).</li><li>Zheng, J., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry+recording+of+conformational+rearrangements+of+ion+channels.">Patch-clamp fluorometry recording of conformational rearrangements of ion channels.</a> Science's STKE. 2003 (176), 7 (2003).</li><li>Biskup, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+ligand+binding+to+activation+gating+in+CNGA2+channels.">Relating ligand binding to activation gating in CNGA2 channels.</a> Nature. 446 (7134), 440-443 (2007).</li><li>Kusch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+receptor+activation+and+ligand+binding+in+HCN2+pacemaker+channels.">Interdependence of receptor activation and ligand binding in HCN2 pacemaker channels.</a> Neuron. 67 (1), 75-85 (2010).</li><li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+cAMP+binding+to+functioning+HCN+channels+studied+by+patch-clamp+fluorometry.">State-dependent cAMP binding to functioning HCN channels studied by patch-clamp fluorometry.</a> Biophysical Journal. 100 (5), 1226-1232 (2011).</li><li>Cha, A., Bezanilla, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+voltage-dependent+conformational+changes+in+the+Shaker+K++channel+with+fluorescence.">Characterizing voltage-dependent conformational changes in the Shaker K+ channel with fluorescence.</a> Neuron. 19 (5), 1127-1140 (1997).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+internal+pore+opening+in+K(V)+channels+probed+by+a+fluorescent+unnatural+amino+acid.">Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (20), 8272-8277 (2013).</li><li>Kalstrup, T., Blunck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=S4-S5+linker+movement+during+activation+and+inactivation+in+voltage-gated+K(+)+channels.">S4-S5 linker movement during activation and inactivation in voltage-gated K(+) channels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (29), 6751-6759 (2018).</li><li>Dai, G., Aman, T. K., DiMaio, F., Zagotta, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+HCN+channel+voltage+sensor+undergoes+a+large+downward+motion+during+hyperpolarization.">The HCN channel voltage sensor undergoes a large downward motion during hyperpolarization.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 26 (8), 686-694 (2019).</li><li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+fluorometry-based+channel+counting+to+determine+HCN+channel+conductance.">Patch-clamp fluorometry-based channel counting to determine HCN channel conductance.</a> Journal of General Physiology. 148 (1), 65-76 (2016).</li><li>Hwang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+of+CFTR+function+and+dysfunction.">Structural mechanisms of CFTR function and dysfunction.</a> Journal of General Physiology. 150 (4), 539-570 (2018).</li><li>Puljung, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+structures+and+progress+toward+a+dynamic+understanding+of+KATP+channels.">Cryo-electron microscopy structures and progress toward a dynamic understanding of KATP channels.</a> Journal of General Physiology. 150 (5), 653-669 (2018).</li><li>Kasuya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+competitive+inhibition+of+the+ATP-gated+P2X+receptor+channel.">Structural insights into the competitive inhibition of the ATP-gated P2X receptor channel.</a> Nature Communications. 8 (1), 876 (2017).</li><li>Virginio, C., Robertson, G., Surprenant, A., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trinitrophenyl-substituted+nucleotides+are+potent+antagonists+selective+for+P2X1,+P2X3,+and+heteromeric+P2X2/3+receptors.">Trinitrophenyl-substituted nucleotides are potent antagonists selective for P2X1, P2X3, and heteromeric P2X2/3 receptors.</a> Molecular Pharmacology. 53 (6), 969-973 (1998).</li><li>Bhargava, Y., Nicke, A., Rettinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+Alexa-647-ATP+as+a+powerful+tool+to+study+P2X+receptor+ligand+binding+and+desensitization.">Validation of Alexa-647-ATP as a powerful tool to study P2X receptor ligand binding and desensitization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 438 (2), 295-300 (2013).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Adenin nükleotidinin bozulmamış membran proteinlerine gerçek zamanlı olarak bağlanmasını ölçmek için bir yöntem geliştirdik. Yöntemimiz, amber stop kodon bastırma12, hücre çatısı açma 14 ve voltaj kelepçeli florometri / PCF19,20,21,22,23,24,25 kullanılarak proteinlerin ANAP ile etiketlenmesi de dahil olmak üzere diğer birçok yerleşik tekniğe dayanmaktadır. Bu yaklaşımların sentezi, nükleotid bağlanmasının yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükle ölçülmesine izin verir. Nitekim, önceki çalışmamızda, bu yaklaşımı kullanarak aynı protein kompleksi üzerindeki farklı bağlanma bölgeleri arasında ayrım yapabildik10,11. Önemli olarak, bu teknik, protein fonksiyonunu koruyan koşullar altında hücresel bir ortamda az miktarda proteine doğrudan uygulanabilir. Bağlama yöntemimizi iyon kanal akımlarının doğrudan, elektrofizyolojik okuması ile birlikte kullanmak, kanal geçidi11'in moleküler temelleri hakkında zengin bilgiler edinmemizi sağlar.
Spektrometreler standart olmayan bir laboratuvar ekipmanı parçası olduğundan, ANAP yoğunluğu, bant geçişli filtreler kullanılarak göreceli izolasyonda da izlenebilir. Şekil 5B , bu tür iki filtrenin spektral özelliklerini göstermektedir. 470/10 nm bant geçişli filtre, TNP-ATP'den gelen floresan sinyalini etkili bir şekilde tarar ve tepe ANAP floresansı ile iyi örtüşür. Bununla birlikte, bu filtrenin tepe geçirgenliği sadece% 50 civarındadır, bu da loş membranlardan (veya voltaj kelepçesi altındaki eksize edilmiş membran yamalarında) iyi sinyaller elde etmeyi zorlaştırabilir. Diğer bir seçenek ise 460/60 nm bant geçiş filtresidir. 460/60 nm filtre ile TNP-ATP emisyon zirvesinin ayağı arasında 470/10 nm filtreye kıyasla biraz daha fazla örtüşme vardır. Bununla birlikte, 460/60 nm bant geçişi, floresan emisyon sinyalini artırması beklenen geniş bir ANAP zirvesi aralığında% 90-95'lik bir geçirgenliğe sahiptir.
ANAP çevreye duyarlı bir florofordur 12,26,27. En yüksek emisyon ve kuantum verimi, ilgilenilen proteinin dahil olduğu yere bağlı olarak değişir ve protein konformasyonu değiştikçe değişebilir. Bu tür değişiklikler emisyon spektrumlarından hemen belli olur, ancak ANAP yoğunluğu filtreler kullanılarak ölçüldüğünde o kadar belirgin olmaz. Her durumda, nükleotid bağlanmasından sonra ANAP çevresindeki yerel ortamdaki değişiklikler nedeniyle floresan sinyalinin değişmediğini göstermek için uygun kontroller gereklidir. Etiketlenmemiş nükleotidlerle yapılan kontrol deneyleri, ANAP yoğunluğundaki herhangi bir değişikliğin ANAP ve TNP-nükleotitleri arasındaki FRET'in sonucu olduğunu doğrulamaya yardımcı olabilir. TNP-nükleotidleri, transfekte edilmemiş hücrelerden türetilen membranlara spesifik olmayan bir şekilde bağlanabilir (plazma zarına veya doğal membran proteinlerine)10. Bağlanmayı donör floresansında bir azalma olarak ölçüyoruz, çünkü bu sinyal etiketli kanala özgüdür. Bununla birlikte, her agonist / reseptör çifti için ek kontrol deneyleri yapmanızı, örneğin donör floresanındaki değişikliğin gerçekten etiketli reseptör11'e doğrudan bağlanmanın sonucu olduğunu doğrulamak için biliniyorsa nükleotid bağlanma bölgesini mutasyona uğratmanızı öneririz. Son olarak, ANAP etiketine ek olarak floresan protein etiketi içeren yapılarla çalışılması önerilir. Bu, etiketli reseptör floresansını arka plan / otofloresandan ayırt etmeye yardımcı olur. Arka plan floresansı, ANAP'den emisyon spektrumları10'un zirvesi ve şekli ile ayırt edilebilir, ancak yalnızca filtre setleri kullanıldığında bu tür belirlemeler çok zor olabilir. Ek olarak, floresan reseptörlerini eksprese eden hücreler ve çatısız membranlar, ANAP'ı uyarmak ve aşırı fotobeyazlatma riski olmadan floresan protein etiketi kullanılarak tanımlanabilir.
PCF kayıtlarımızın çoğunda, spektrumlarımızda yüksek TNP-ATP konsantrasyonlarında güçlü bir negatif tepe gözlemledik (Şekil 4C). Bu negatif zirve, arka plan çıkarma protokolümüzün bir eseridir. Şekil 4D , 1 mM TNP-ATP'ye maruz kalan bir yama pipetinin parlak alan ve floresan görüntülerini göstermektedir. TNP-ATP'nin pipet duvarlarının hacminden dışlanmasından kaynaklanan pipet ucundaki bir gölge belirgindir ve bu gölge en çok odak düzleminde belirgindir. Şekil 4E'deki spektral görüntü, bu gölgeye karşılık gelen karanlık bir bant göstermektedir. Bu karanlık bandın üstündeki veya altındaki bir bölge arka plan çıkarma işlemi için kullanıldığında, negatif bir tepe noktası oluşturur. Önemli olarak, bu zirve TNP-ATP emisyonuna karşılık gelen bir dalga boyu aralığında meydana geldi ve ANAP söndürme ölçümlerimizi etkilemedi.
Deneylerimizin en büyük sınırlaması, floresanı ölçmek için ANAP etiketli yapıların yeterli plazma membranı ekspresyonunu elde etmekti. Çatısız membranlardan yüksek kaliteli spektrumlar elde etmek genellikle PCF'den daha kolaydı, çünkü daha büyük boyutları ve yamaların her seferinde yalnızca bir tane elde edilebildiği PCF'nin aksine, çatısız membranların tamamını hızlı bir şekilde tarama yeteneğimiz vardı. Deneylerimizde, çatısız membranlardan ve PCF deneylerinden elde edilen veriler benzerdi ancak eşdeğer değildi (Şekil 6)11. Bununla birlikte, bunun evrensel bir gözlem olması için a priori bir neden yoktur, çünkü bir yama pipetindeki proteinler çatısız membranlardakilerden farklı bir işlevsel durumda olabilir.
Burada, ANAP etiketli yapılarımızın ekspresyonunu en üst düzeye çıkarmak, özellikle hücre kültürü sıcaklığını 33 ° C10,11,16'ya düşürmek için girişimlerde bulunulmuştur. Deneyimlerimize göre, ANAP'ın konservatif bir ikame olacağı proteindeki bölgeleri tanımlamaya çalışmak, tutarlı bir şekilde iyi ifade edilen yapılarla sonuçlanmadı. ANAP birleşme bölgeleri için tüm protein bölgelerini sistematik olarak taramada ve yüzey ekspresyonu10 için adayları taramada daha başarılı olduk. ANAP etiketleme sistemi ayrıca Xenopus laevis oositlerinde de çalışır, bu da çok daha büyük membran yamalarının eksize edilmesine izin verir, böylece sinyali gürültüye26,27,28 arttırır.
Daha büyük ifade seviyelerinin daha parlak sinyallerle sonuçlanması beklenirken, floresanı ölçmek için gereken minimum kanal sayısı, floroforun parlaklığı, fotobeyazlatma derecesi, uyarma ışığının yoğunluğu ve odak düzlemi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Teorik olarak, daha önce28,29 gösterildiği gibi floresan yoğunluğu ve kanal akımı arasında korelasyon kurularak tahminler yapılabilir. Bununla birlikte, bu tür tahminlerin güvenilirliği, tek kanallı iletkenlik ve kanalın açık olasılığı hakkında biraz bilgi gerektirir. Yukarıda listelenen faktörlere ek olarak, floresan sinyali, veziküllerle ilişkili kanallardan veya pipet camına yapışmış plazma zarının voltaj kelepçesi altında olmayan bölümlerinden de etkilenecektir.
Bu yöntem, diğer nükleotid duyarlı iyon kanallarının çalışmasına kolayca uyarlanmıştır. CFTR yapısal olarak KATP30,31'in aksesuar sülfonilüre reseptör alt ünitesine benzer. KATP CFTR geçidi gibi, nükleotid bağlanması ile kontrol edilir ve bu da onu yöntem7'mizin gelecekteki açık bir hedefi haline getirir. Pürinerjik P2X reseptörleri, hücre dışı ATP9 tarafından kapılanan iyon kanallarıdır. TNP-ATP, P2X reseptörleri32,33 için bir antagonist görevi görür. Bu nedenle, P2X aktivasyonunu incelemek için yararlı olmayacaktır, ancak P2X agonistleri ile rekabet tahlillerinde kullanılabilir. Alternatif olarak, aktivasyonu incelemek için ANAP emisyonu ile yeterli spektral örtüşmeye sahip diğer floresan ATP türevleri kullanılabilir. Alexa-647-ATP, floresan P2X agonisti34'tür. Alexa-647 ve ANAP arasında hesaplanan R0 ~ 85 Å'dır, bu da P2X'e doğrudan bağlanmanın kanala dahil edilen ANAP'ın önemli ölçüde söndürülmesine neden olması gerektiği anlamına gelir. Bununla birlikte, bu kadar uzun bir R0, komşu alt birimlere bağlı Alexa-647-ATP'den söndürme ile sonuçlanacak ve spesifik olmayan nükleotid bağlanmasının FRET ile sonuçlanma olasılığını artıracaktır. P2X reseptörlerindeki ligand bağlanma bölgesi hücre dışı olduğundan, bağlanma ölçümleri sağlam hücrelerde, tüm hücre voltaj kelepçesinde veya dış-dış membran yamalarında gerçekleştirilecektir. Yöntemimiz ayrıca, reaksiyon döngüleri için ATP'ye bağımlı olan elektrojenik ve elektrojenik olmayan taşıyıcıların ve pompaların yanı sıra G proteini bağlı P2Y reseptörlerinin bağlanması ve aktivasyonunu incelemek için de genişletilebilir. Son olarak, adenin nükleotid bağlanmasını (TNP-ATP, TNP-ADP, TNP-AMP) ölçmek için bu yöntemi geliştirmiş olsak da, aynı yaklaşım, uygun, floresan ligandın tanımlandığı hemen hemen her reseptöre bağlanmayı incelemek için kullanılabilir.

Birkaç önemli protein sınıfı, ligand bağlanması ile doğrudan düzenlenir. Bunlar çözünür enzimlerden, reseptör tirozin kinazlar, G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) ve iyon kanalları dahil olmak üzere membrana gömülü proteinlere kadar uzanır. GPCR'ler ve kanallar, mevcut tüm ilaç hedeflerinin sırasıyla ~% 34'ünü ve ~% 15'ini, 1,2'yi oluşturmaktadır. Bu nedenle, ligand-reseptör etkileşimlerine mekanik bakış açısı sağlayan yöntemler geliştirmeye yönelik önemli bir biyokimyasal ve tıbbi ilgi vardır. Fotoaffinite etiketleme ve radyoligand bağlama çalışmaları da dahil olmak üzere ligand bağlanmasını ölçmek için geleneksel yöntemler, büyük miktarlarda kısmen saflaştırılmış protein gerektirir ve tipik olarak fizyolojik olmayan koşullar ve zaman ölçekleri altında gerçekleştirilir. İdeal bir yöntem sadece az miktarda protein gerektirir, hücresel veya membran ortamında eksprese edilen bozulmamış proteinler üzerinde gerçekleştirilebilir, gerçek zamanlı olarak izlenebilir ve protein fonksiyonunun doğrudan okumalarıyla uyumlu olacaktır.
Förster rezonans enerji transferi (FRET), floresan olarak etiketlenmiş iki molekül arasındaki yakınlığı tespit eden bir yöntemdir3. FRET, uyarılmış bir donör florofor, enerjiyi ışınımsal olmayan bir şekilde bir alıcı moleküle (tipik olarak başka bir florofor) aktardığında ortaya çıkar. Enerji transferi, donör floresan emisyonunun söndürülmesi ve alıcı emisyonun hassaslaştırılması ile sonuçlanır (alıcı bir florofor ise). Transfer verimliliği, donör ile alıcı arasındaki mesafenin 6.gücüne bağlıdır. Ayrıca, FRET'in gerçekleşmesi için donör ve alıcı yakın olmalıdır (genellikle 10 nm'den az). Bu nedenle, FRET, floresan olarak etiketlenmiş bir protein reseptörü ile bir floresan ligand arasındaki doğrudan bağlanmayı ölçmek için kullanılabilir.
Birkaç farklı protein, hücre içi veya hücre dışı adenin nükleotidlerinin (ATP, ADP, AMP, cAMP) bağlanmasıyla düzenlenir veya aktive edilir. Birçok taşıyıcı protein, ATP bağlayıcı kaset taşıyıcılar ve Na + / K + pompa 4,5 gibi P tipi ATPazlar dahil olmak üzere reaksiyon döngüleri için ATP hidrolizine ihtiyaç duyar. ATP'ye duyarlı K+ (KATP) kanalları, kistik fibroz transmembran iletkenlik regülatörü (CFTR) ve siklik nükleotid regüle kanalları, hücre içi adenin nükleotidlerinin bağlanmasıyla kapılı olan ve onları hücresel metabolizma ve sinyal iletimindeki değişikliklere karşı hassas hale getiren iyon kanallarıdır 6,7,8 . Pürinerjik P2X ve P2Y reseptörleri, bir nörotransmitter olarak veya doku hasarının bir sonucu olarak salınabilen hücre dışı ATP'deki değişikliklere cevap verir9. Membran proteinlerine bağlanan adenin nükleotidinin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi için FRET tabanlı bir test geliştirdik. Bu yöntemi daha önce KATP kanalları10,11'e nükleotid bağlanmasını incelemek için uygulamıştık.
FRET yoluyla nükleotid bağlanmasını ölçmek için, ilgilenilen bir protein önce bir florofor ile etiketlenmelidir. Floresan etiketi, özellikle ilgili proteine, FRET'in oluşması için ligand bağlanma bölgesine yeterince yakın olacak şekilde, etiketin proteinin genel yapısını ve işlevini etkilememesini sağlamak için özel dikkat gösterilecek şekilde yerleştirilmelidir. Bunu başarmak için, Chatterjee ve ark. tarafından geliştirilen bir tekniği kullanıyoruz, floresan kanonik olmayan bir amino asit (l-3-(6-asetilnaftalin-2-ylamino)-2-aminopropiyonik; ANAP) istenilen yerde12. ANAP etiketli protein ve floresan, trinitrofenil (TNP) nükleotid türevleri arasında FRET olarak nükleotid bağlanmasını ölçüyoruz (Şekil 1A). ANAP için emisyon spektrumu, FRET'in gerçekleşmesi için gerekli bir koşul olan TNP-nükleotidlerin absorbans spektrumu ile örtüşmektedir (Şekil 1B). Burada iki farklı bağlama deneyi türünü özetliyoruz. Birincisinde, ANAP etiketli KATP kanallarının hücre içi tarafına bağlanan nükleotid, bir cam kapak kayması10,11,13,14 üzerinde plazma zarının yapışkan parçalarını bırakarak sonikasyon ile çatısı açılmış hücrelerde ölçülür.
İkinci yöntemde, ANAP etiketli KATP kanallarına bağlanan nükleotid, voltaj kelepçesi altındaki bir membran yamasında ölçülür ve iyonik akımların ve floresanın aynı anda ölçülmesine izin verir. Bu iki deneysel yaklaşımı birleştirerek, bağlanmadaki değişiklikler kanal fonksiyonu11'deki değişikliklerle doğrudan ilişkilendirilebilir. Tipik sonuçlar, potansiyel tuzaklar ve veri analizi tartışılmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1328px;" width="1327">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">T75 tissue-culture treated flask</td>
			<td style="width:195px;">StarLab</td>
			<td style="width:327px;">CC7682-4875</td>
			<td style="width:509px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">0.1% w/v poly-L-lysine</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">30 mm borosilicate cover glass slips</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>631-0174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm non-treated sterile dishes</td>
			<td>CytoOne</td>
			<td>CC7672-3340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">35 mm cover glass bottom dish</td>
			<td style="width:195px;">WPI</td>
			<td>FD35-PDL-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>31966021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Foetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TrypLE select (tryosin)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>Trypsin/EDTA reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:195px;">Gibco</td>
			<td>14040-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure distilled water</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">HEK293T cells</td>
			<td style="width:195px;">ATTC</td>
			<td>CRL-3216</td>
			<td>Used between passages 5-30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">ANAP-TFA</td>
			<td style="width:195px;">AsisChem</td>
			<td style="width:327px;">ASIS-0014</td>
			<td>Reconstituted in 30 mM NaOH to a final concentration of 1 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pANAP expression plasmid</td>
			<td style="width:195px;">Addgene</td>
			<td style="width:327px;">Plasmid #48696</td>
			<td>Encodes tRNA/tRNA synthetase pair for expression of ANAP-tagged protein</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">peRF1-E55D</td>
			<td style="width:195px;">Chin Lab (MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge, UK)</td>
			<td style="width:327px;">Jason Chin: DOI: 10.1021/ja5069728</td>
			<td>Encodes dominant-negative eukaryotic ribosomal release factor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TransIT-LT1</td>
			<td style="width:195px;">Mirus Bio</td>
			<td style="width:327px;">MIR 2300</td>
			<td>Lipopolyplex transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Thick-walled borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:195px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>GC150F-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Tetramethylrhodamine-5-maleimide</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:327px;">94506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">TNP-ATP</td>
			<td style="width:195px;">Jena Bioscience</td>
			<td style="width:327px;">NU-221L</td>
			<td>Delivered at 10 mM in water</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Nikon Eclipse TE2000-U inverted microscope microscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">60x water immersion objective (1.4 NA)</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:327px;">MRD07602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">4-Wavelength High-Power LED Head</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>LED4D245</td>
			<td>385/490/565/625 nm LEDs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Four-Channel LED Driver</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">DC4100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">390/18 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF390-18</td>
			<td>For ANAP excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">400 nm long-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">FEL0400</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">416 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MD416</td>
			<td>For imaging ANAP spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">460/60 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td style="width:327px;">MF460-60</td>
			<td>Suggested wide band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">470/10 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">ThorLabs</td>
			<td>FB470-10</td>
			<td>Suggested narrow band-pass filter for imaging ANAP fluorescence (Figure 4B)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">531/40 band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-531/40-25</td>
			<td>For orange fluorescent protein (OFP) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">540/25 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D540/25X</td>
			<td>For tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMRM) excitation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">562 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Semrock</td>
			<td>FF562-Di03</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">565 nm edge dichroic</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>565DC</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">593/40 nm band-pass excitation filter</td>
			<td style="width:195px;">Brightline</td>
			<td style="width:327px;">FF01-387/11-25</td>
			<td>For imaging OFP fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">605/55 nm band-pass emission filter</td>
			<td style="width:195px;">Chroma</td>
			<td>D605/55M</td>
			<td>For imaging TMRM fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">IsoPlane-160 Imaging Spectrometer</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>IsoPlane-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">PIXIS 400BR_eXcelon Camera</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td>PIXIS: 400BR_eXcelon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Axopatch 200B amplifier</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Axopatch 200B-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Digidata 1440A digitizer</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Probe sonicator</td>
			<td style="width:195px;">Sonics &#38; Materials</td>
			<td style="width:327px;">VC-50</td>
			<td>For unroofing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">REGLO digital peristaltic pump</td>
			<td style="width:195px;">Ismatec</td>
			<td style="width:327px;">ISM 832</td>
			<td>For bath perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Microvolume perfusion system</td>
			<td style="width:195px;">ALA Scientific Instruments</td>
			<td style="width:327px;">ALA &#956;Flow-8</td>
			<td>For TNP-ATP perfusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">pClamp 10.6.2</td>
			<td style="width:195px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Recording and analysing currents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Lightfield 5.20.1507</td>
			<td style="width:195px;">Princeton Instruments</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>Acquisition software for images and spectra</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Matlab</td>
			<td style="width:195px;">Mathworks</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Python 3.8.1</td>
			<td style="width:195px;">Python Software Foundation</td>
			<td style="width:327px;"></td>
			<td>For data analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring nucleotide binding to intact, functional membrane proteins in real time

Adenin nükleotidlerinin hücresel veya membran ortamında bozulmamış, fonksiyonel transmembran reseptörlerine bağlanmasını ölçmek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, floresan kanonik olmayan amino asit ANAP ile etiketlenmiş proteinlerin ekspresyonunu ve ANAP ile floresan (trinitrofenil) nükleotid türevleri arasındaki FRET'i birleştirir. Çatısız plazma membranlarında ölçülen ANAP etiketli KATP iyon kanallarına nükleotid bağlanma örneklerini ve voltaj kelepçesi altında eksize edilmiş, içten dışa membran yamalarını sunuyoruz. İkincisi, ligand bağlanması ve kanal akımının eşzamanlı ölçümlerine, protein fonksiyonunun doğrudan okunmasına izin verir. Veri işleme ve analizi, potansiyel tuzaklar ve eserlerle birlikte kapsamlı bir şekilde tartışılmaktadır. Bu yöntem, KATP kanallarının ligand-bağımlı geçidine zengin mekanik anlayışlar sağlar ve diğer nükleotid düzenlenmiş proteinlerin veya uygun bir floresan ligandın tanımlanabileceği herhangi bir reseptörün çalışmasına kolayca uyarlanabilir.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time at JoVE.com

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Bu protokol, hücresel bir ortamda reseptörlere gerçek zamanlı olarak adenin nükleotid bağlanmasını ölçmek için bir yöntem sunar. Bağlanma, trinitrofenil nükleotid türevleri ile kanonik olmayan, floresan amino asit ile etiketlenmiş protein arasındaki Förster rezonans enerji transferi (FRET) olarak ölçülür.

Sağlam, fonksiyonel membran proteinlerine bağlanan nükleotidin gerçek zamanlı olarak ölçülmesi

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

ATP önemli bir hücresel haberci olduğundan, ATP'nin reseptörlerine bağlanmasını yüksek hassasiyetle ölçmemizi sağlayan bir yöntem geliştirdik. Nükleotid türevleri ve floresan olarak etiketlenmiş proteinler arasındaki FRET'i kullanarak, nükleotidin bozulmamış fonksiyonel reseptörlere bağlanmasını gerçek zamanlı olarak ve mükemmel uzamsal çözünürlükle izleyebiliriz. Bu yöntemi, hücresel metabolizmanın, belirli diyabet formlarında rol oynayan ATP'ye duyarlı potasyum kanalı üzerindeki etkilerini anlamak için kullanıyoruz.Çatısız bir membran deneyi yapmak için, önce transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasından küçük bir parçayı kırmak için bir çift forseps kullanın ve parçayı PBS ile durulayın. Kapak kayması polilizin ile önceden kaplanmışsa, parçayı iki mililitre PBS içeren 35 milimetrelik bir çanağın altına yerleştirin ve numunenin üç ila beş milimetre üzerinde üç milimetrelik bir prob sonikatörünü tutun, hücrelerin çatısını açmak için 200 ila 500 milisaniye boyunca 50 watt ve% 20 ila% 40 genlikte titreştirin. Kapak kaymaları önceden kaplanmamışsa, PBS ile duruladıktan sonra, gösterildiği gibi kısa sonikasyonla hücreleri açmadan önce parçayı% 0.1 poli-L-lizin içeren bir tüpe yaklaşık 30 saniye batırın.Sonikasyonlu parçayı iki mililitre banyo çözeltisi içeren kapalı bir cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve çanağı yüksek sayısal diyaframlı 60x suya daldırma hedefi ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop üzerine monte edin. Mikroskobun kamera portunun yüksek hassasiyetli bir CCD kamera ile seri olarak bir spektrografa bağlı olup olmadığını kontrol edin ve banyo odasını dakikada 0,5 ila bir mililitre tampon akış hızında tamponla perfüze etmek için peristaltik bir pompa kullanın. ANAP etiketli kanalı ifade eden çatısız membran parçalarını tanımlamak için, floresan kanallı membranları bulmak üzere numuneyi görüntüleyin.Spektrometre maskesini mikroskoptaki kamera portu ile spektrograf arasına kısmen takın. Maskenin gölgesi kamera görüntüsünde görünecektir. Analiz için ilgili bölgenin seçilmesine izin vermek için çatısız membranın parlak bir alan ve floresan görüntüsünü elde edin.Mikrohacim perfüzyon sisteminin ucunu çatısız membrana yaklaştırın. ANAP floresansının bir görüntüsünü elde etmek için, 390/18 nanometre bant geçiş uyarma filtresi ve 416 nanometre kenar dikroik aracılığıyla 385 nanometre LED ile membranı heyecanlandırın ve yayılan ışığı 400 nanometre longpass emisyon filtresinden toplayın. Spektrometre maskesini takın ve yayılan ışığın içinden geçtiğinden emin olun.İlgilendiğiniz bölgeyi spektrometre maskesinin yarığıyla hizalayın. Spektrometre ızgaralarını devreye sokun. Izgaralar yerleştirildiğinde, spektrometre tarafından kırılan ışık, spektral görüntüler üretmek için CCD kameranın çipine yansıtılacaktır.Görüntüler uzamsal bilgileri Y boyutunda koruyacaktır. X boyutu dalga boyu ile değiştirilecektir. Nükleotid içermeyen tampon çözeltisi ile perfüzyon yaparken, deneyin geri kalanında toplanan verilerin aşağı akış düzeltmesi ve normalleştirilmesi için bir veya daha fazla 0,1 ila on saniyelik pozlama elde edin.Daha sonra, bir konsantrasyon tepki eğrisi oluşturmak için banyo çözeltisine bir dizi TNP ATP konsantrasyonu uygulayın, kararlı bir duruma ulaşılmasını sağlamak ve her konsantrasyon için bir maruz kalma elde etmek için her çözeltiyi en az bir dakika perfüze edin. Her konsantrasyondan sonra, TNP ATP'yi işlem sonrası maruz kalma görüntüsü elde etmeden önce en az bir dakika boyunca nükleotid içermeyen banyo çözeltisi ile yıkayın. Yama kelepçeli florometri deneyi gerçekleştirmek için, önce yama pipetlerini kalın duvarlı borosilikat cam kılcal damarlardan pipet çözeltisi ile doldurulduğunda 1,5 ila 2,5 megaohm dirence çekin.Daha sonra, transfekte hücrelere sahip bir kapak kaymasını, iki mililitre banyo çözeltisi içeren cam tabanlı 35 milimetrelik bir kaba aktarın ve çanağı ters çevrilmiş mikroskopa monte edin. Banyo odasını banyo çözeltisi ile perfüze edin ve ANAP etiketli kanalları ifade eden bir hücre tanımlayın. Yama pipetine hafif pozitif basınç uygulayın ve pipeti bir banyo odasına yerleştirin.Pipetinizi hücrenin zarına bastırın ve gigaohm sızdırmazlık elde etmek için nazik bir emme uygulayın. Yamayı tüketmek için, pipet tutucuyu yamalı hücreden hızla uzaklaştırın. Yama pipetinin ucunu perfüzyon sisteminin ucuna yaklaştırın ve yamanın spektrometre maskesinin yarığı içinde olup olmadığını kontrol edin.Ardından TNP ATP'yi uygulayın ve görüntü spektrumlarını toplayın. Bu görüntülerde, turuncu floresan proteini ile etiketlenmiş ATP'ye duyarlı potasyum kanallarını eksprese eden bir HEK293T hücresinden tipik bir çatısız membran parçası gözlemlenebilir. Beş mikromolar TNP ATP'ye maruz kalan bir HEK293T hücresinden çatısız bir zarda ANAP etiketli ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının bu spektral görüntüsünde, ANAP ve TNP ATP'nin tepe emisyonuna karşılık gelen iki yüksek yoğunluklu bölge gözlemlenebilir.Son bir spektrum, ortalama arka plan spektrumunun ortalama ilgi alanı spektrumundan çıkarılmasıyla elde edilebilir. Burada, çoklu maruziyetlerden sonra pik ANAP floresansında azalma gözlenebilir. TNP ATP'nin yokluğunda çeşitli maruziyetlerden kaynaklanan pik floresan, tek bir üstel bozunmaya takıldı.Bu veriler daha sonra fotobeyazlatma eserlerini düzeltmek için kullanıldı. Burada, TNP ATP'nin yokluğunda ve varlığında ANAP etiketli ATP duyarlı potasyum kanallarını eksprese eden bir hücreden elde edilen çatısız bir membrandan elde edilen temsili spektral görüntüler gösterilmiştir. Düzeltilmiş emisyon spektrumlarının gözlemlenmesi, donör ve alıcı floresan emisyonu arasında net bir ayrım olduğunu ortaya koymaktadır.Bu şekilde, tipik bir yama-kelepçe florometri deneyinden ANAP etiketli ATP duyarlı potasyum kanallarından gelen temsili akımlar ve spektrumlar gösterilmiştir. Emisyon spektrumları, çatısız membranlar için gösterildiği gibi arka plan ve ağartma için düzeltilir. Floresan sinyalinin reseptörünüze özgü olduğunu doğrulamak için kontrollere dikkat edin.Profüzyonunuzun hızlı, verimli ve eksiksiz olduğundan emin olun ve pozlamalarınızı mümkün olduğunca kısa tutun. Bu yöntem, reseptör doluluğu ve bunun işlevle nasıl ilişkili olduğu hakkındaki soruları yanıtlar. Benzer bir kurulumla kullanılan diğer FRET teknikleri, reseptördeki ligand kaynaklı doğrulama değişikliklerini araştırabilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

Yöntem gözünüzde canlandırın ve Transmisyon Elektron Mikroskobu Membran Etkileşen Proteinler Analiz için

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Radyo-etiketli GTP Bağlanması vasıtasıyla G-protein ile birleşmiş Reseptör Sinyalizasyonunun Ölçümü

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Ko-çöktürme yoluyla F-aktine Bağlı Proteinin Ölçülmesi

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Biyomoleküler DSC profilleri ile hızlı bir şekilde katlanır ve etkileşimleri bağlama karakterize etmek için Thermolabile ligandlar ölçme

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plazma membran elektron taşıma C2C12 Myotubes ile ölçme

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Monitoring GPCR-&#946;-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

Monitoring GPCR-ÃƒÅ½Ã‚Â²-arrestin1/2 Interactions in Real Time Living Systems to Accelerate Drug Discovery

İzleme GPCR-β-arrestin1/2 etkileşimleri gerçek zamanlı yaşam sistemleri Ilaç Discovery hızlandırmak için

Interactions between G-protein coupled receptors (GPCRs) and &#946;-arrestins are vital processes with physiological implications of great importance. ...