Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af tilskud CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres fremragende tekniske bistand.

Undersøgelsen blev godkendt af Forskningsetisk Komité under Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico og Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Dyrenes reproduktion, pleje og humane endepunkter blev etableret efter den officielle mexicanske standard (NOM-062-Z00-1999) baseret på "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (general health law for health research) fra den mexicanske Sundhedsminister.
1. Fremstilling af løsni...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

En fase for at opnå en neuralstamcellekultur er fordøjelsesperioden med den enzymatiske opløsning, som ikke bør overstige mere end 30 min. Neurosfærerne bør dukke op på 8-10 dage efter indledende kultur; hvis de ikke opstår ved dag 12, kasseres kulturen og gentager eksperimentet, hvilket reducerer fordøjelsesperioden. Et andet problem er de blodkar, der dækker hjernevæv. De bør fjernes helt under dissektionen, fordi overskuddet af erythrocytter kan forstyrre neurosfærerne dannelse.
<p class="jove_content...

Prærien vole (Microtus ochrogaster), et medlem af Cricetidae familien, er et lille pattedyr, hvis liv strategi udvikler sig som en socialt monogame og meget omgængelig art. Både hanner og hunner etablere en varig par obligation efter parring eller lange perioder med samliv karakteriseret ved at dele reden, forsvare deres område, og vise biparental pleje for deres afkom1,2,3,4. Således prærien vole er en værdifuld model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og funktionsnedsættelser i social kognition5.
Voksen neurogenese er en af de mest altoverskyggende processer neurale plasticitet, der fører til adfærdsmæssige ændringer. For eksempel rapporterede vores forskningsgruppe i hanvoles, at social samliv med parring øget celleprolifererende i subventrikulær zone (VZ) og subgranular zone i dentate gyrus (DG) af hippocampus, hvilket tyder på, at voksne neurogenese kan spille en rolle i dannelsen af par binding induceret ved parring i prærievoles (ikke-offentliggjorte data). På den anden side, selv om hjernen regioner, hvor nye neuroner er genereret og integreret er velkendte, de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i disse processer forbliver ubestemt på grund af tekniske ulemper i hele hjernen model6. For eksempel har signalvejene, der styrer genekspression og andre cellulære aktiviteter, en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning af fosforetom)7. En alternativ model er isolerede og dyrkede voksne neurale stamceller eller progenitor celler til at belyse molekylære komponenter involveret i voksne neurogenese.
Den første tilgang til at opretholde in vitro neurale prækursorer fra voksne pattedyr (mus) hjerne var analysen af neurosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-vedholdne forhold, som bevarer deres multipotente potentiale til at generere neuroner, samt astrocytter8,9,10. Under deres udvikling, er der en udvælgelsesproces, hvor kun prækursorer vil reagere på mitogener såsom Epidermal Vækstfaktor (EGF) og Fibroblast Vækstfaktor 2 (FGF2) at formere sig og generere neurosfærer8,9,10.
Så til vores viden, er ingen protokol rapporteret i litteraturen for at opnå voksne neurale forfædre fra prærie voles. Her etablerede vi kulturbetingelserne for at isolere neuronale forfædre fra neurogene nicher og deres in vitro vedligeholdelse gennem neurosphere formation assay. Således kan eksperimenter udformes til at identificere de molekylære og cellulære mekanismer, der er involveret i spredning, migration, differentiering og overlevelse af de neurale stamceller og forfædre, processer, der stadig er ukendte i prærien vole. Desuden belyse in vitro forskelle i egenskaberne af cellerne stammer fra VZ og DG kunne give oplysninger om den rolle, neurogene nicher i neurale plasticitet forbundet med ændringer i socio-seksuel adfærd og kognitiv adfærd, og underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum lidelse og skizofreni), som også kunne være sex-afhængige.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Neurosfærer er primære celle aggregater, der omfatter neurale stamceller og progenitor celler. Disse 3D-strukturer er et glimrende værktøj til at bestemme differentiering og spredning potentiale neurale stamceller, samt at generere cellelinjer end der kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skabe en niche (in vitro), der gør det muligt modellering af den dynamiske skiftende miljø, såsom varierende vækstfaktorer, hormoner, neurotransmittere, blandt andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik model for at forstå det neurobiologiske grundlag for socio-seksuel adfærd og social kognition. Men, de cellulære mekanismer, der er involveret i disse adfærdsmønstre er ikke kendt. Protokollen har til formål at opnå neurale progenitor celler fra neurogene nicher af den voksne prærie vole, som er dyrket under ikke-klæbende forhold, at generere neurosfærer. Størrelsen og antallet af neurosfærer afhænger af regionen (subventrikulær zone eller dentate gyrus) og køn prærien vole. Denne metode er et bemærkelsesværdigt værktøj til at studere kønsafhængige forskelle i neurogene nicher in vitro og neuroplasticitet ændringer forbundet med social adfærd såsom par limning og biparental pleje. Også, kognitive tilstande, der medfører underskud i sociale interaktioner (autisme spektrum forstyrrelser og skizofreni) kunne undersøges.

Neurosfærer blev dannet af neurale stamceller isoleret fra VZ og DG for både kvindelige og mandlige voksne prærie voles. Omkring 8-10 dage efter start af kulturen, celler bør have dannet neurosfærer. Bemærk, at pladen kan indeholde snavs i den primære kultur (Figur 3A). I passage 1 bør kulturen dog kun bestå af neurosfærer (figur 3B).
Et større antal neurosfærer blev opnået fra den kvindelige VZ sammenlignet med den mandl...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Vi etablerede betingelserne for at kultur neurale progenitor celler fra subventrikulære zone og dentate gyrus af den voksne hjerne prærie voles, som en supplerende in vitro undersøgelse, at analysere de kønsafhængige forskelle mellem neurogene nicher, der kunne være en del af funktionelle plast ændringer forbundet med social adfærd.

Kultur af Neurosfærer Stammer fra neurogene nicher i Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Denne metode kan bidrage til at undersøge kønsafhængige forskelle i de neurogene nicher, og til at forstå deres neuroplasticitet, ændringer, der understreger sociale interaktioner i prærien vole. Analysen af neurosfærer er et glimrende værktøj til at bestemme spredning og differentiering potentiale neurale stamceller og progenitor celler. Til at begynde, placere en petriskål på en overflade omgivet af is.Aflejr hjernen på fadet og tilsæt 20 milliliter kold vask opløsning. I koronal flyet, opdele hjernen i to blokke af væv ved hjælp af en skalpel, udfører snittet på bregma niveau i den forreste-posterior akse. Uddrag subventrikulær zone, eller VZ, væv fra rostralblokken, og dentate gyrus, eller DG, væv fra haleblokken.At dissekere VZ, holde en af halvkugler med en Dumont scefængsler, og indsætte de fine spidser af en anden saftføring under vævet, der linjer caudate-putamen. Åbn stangene langs dorsal-ventrale akse for at adskille vævet, og opsaml VZ'en i et centrifugerør med to milliliter koldvaskopløsning. Du må ikke samle vævet på mere end to dyr.Gentag mikrodissektionen på den anden halvkugle og opbevar røret med vævet på is. For at dissekere DG, bruge en skalpel til at gøre en koronal skåret i caudal blok, for at opnå to skiver, hvor hippocampal dannelse er observeret. Brug Dumont-krafterne til at holde et af skiverne, og lav et vandret snit mellem DG og CA1 med en anden kraft.Derefter foretages et vertikalt snit mellem GD og CA3 for at adskille GD. Gentag dissektion i den anden halvkugle af den første skive, derefter i begge halvkugler i den anden skive. Saml de fire DG stykker af hver vole i en centrifuge rør. Anbring centrifugerørene inde i biosikkerhedsskabet, og vent ca. 10 minutter på, at vævsfragmenterne udfældes af tyngdekraften.Fjern derefter vaskeopløsningen og tilsæt en milliliter varm enzymatisk opløsning til hvert rør. Inkuber rørene ved 37 grader i 10 minutter. For at opløse vævsfragmenterne pipetteres dem op og ned med en milliliterspids, men pipetter ikke mere end 30 gange.Gentag inkubationen ved 37 grader Celsius, og pipetter derefter vævet igen. Der tilsættes ni milliliter N-2-medium til hvert rør for at fortynde den enzymatiske behandling, og rørerne centrifugeres ved 200 gange g i fire minutter. Supernatanten kasseres, cellerne vaskes med 10 milliliter N-2-medium, og centrifugering gentages.Supernatanten fjernes fra hvert rør, og cellerepellerne i VZ og GD opslæmmes igen i henholdsvis to milliliter og en milliliter B-27-mediet. Filtrer hver celle suspension med en 40 mikrometer celle si for at fjerne eventuelle ikke-fordøjet væv. Kultur de filtrerede celler i en ultra-lav vedhæftet fil 24-brønd plade, ved hjælp af to brønde til VZ og en brønd til DG. Tilføj 20 nanogram pr. milliliter fibroblastvækstfaktor 2 og 20 nanogram pr. milliliter epidermal vækstfaktor til hver brønd, derefter inkubere pladen ved 37 grader Celsius, 5 % kuldioxid og høj luftfugtighed i 48 timer.Efter inkubationen fjernes halvdelen af kulturmediet og erstattes med frisk B-27-medium suppleret med dobbelte koncentrationer af vækstfaktorerne. Gentag denne proces hver tredje dag. På dage, hvor det ikke er nødvendigt at ændre kulturmediet, skal du tilføje vækstfaktorer til en endelig koncentration på 1X.Neurosfærer blev dannet fra de neurale stamceller isoleret fra den subventrikulære zone og dentate gyrus af både kvindelige og mandlige voksne prærievoles. Selv om der var snavs i den primære kultur, kun neurosfærer var til stede efter den første passage. Et højere antal neurosfærer blev opnået fra den kvindelige subventricular zone end fra den mandlige subventrikulære zone, eller dentate gyrus af både hunner og hanner, hvilket tyder på, at antallet af neurosfærer opnået afhænger af proliferative zone og vole køn.Diameteren af neurosfærerne blev målt på dag 8, 11 og 14. Det steg gradvist for mandlige og kvindelige voles i begge neuronale regioner, men neurosfærer stammer fra de mandlige hjerner var mindre i forhold til dem, der stammer fra de kvindelige hjerner. Klæbende neurosfærer var karakteriseret på dag seks i overværelse af vækstfaktorer, eller på dag 15 uden vækstfaktorer.På dag seks, under udifferentierede forhold, neurosphere-afledte celler udtrykt Nestin, en markør for neurale forfædre. Det var også muligt at identificere dobbeltkorsalsi positive celler og spredningsmarkøren Ki-67, hvilket indikerer tilstedeværelsen af enten neuronale prækursorer eller umodne neuroner. Men manglen på colocalization af Ki-67 med DCX foreslog tilstedeværelsen af post-mitotiske neuroblaster.På dag 15 blev der under differentieringsbetingelser fundet modne neuroner og celler med gliafenotype, hvilket viste de isolerede cellers differentieringspotentiale. Når du forsøger denne protokol, huske på, at være i stand til at genkende og have tidligere praksis i mikrodissektion er afgørende for at isolere kun celler fra neurogene nicher. Efter denne protokol, eksperimenter kan udformes til at identificere mekanismer, der er involveret i spredning, differentiering og overlevelse af neurale stamceller og progenitor celler, processer, der stadig er ukendt i prærien vole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Stamfader-afledt oligodendrocyt Culture System fra human føtal hjerne

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In vitro</em&gt; Udarbejdelse af Isolerede Enteriske neuroner og glia fra plexus myentericus af Voksen Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: isolering og dyrkning af voksne neurale stamceller fra Two Neurogene zoner Individuel Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering af pericyt-afledte Celler af Voksen Menneskelige hjerne til Inducerede Neuroner

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering og dyrkning af Voksen neurale stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En simpel en-trin Dissektion Protokol for Whole-mount Forberedelse af Voksen<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simpel Generation af højtydende kultur af inducerede neuroner fra menneskelige voksen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generation af Neuro kugler fra blandede primære hippocampus og kortikale neuroner isoleret fra E14-E16 Sprague Dawley rotte embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...