Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies CONACYT 252756 en 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 en IN203518; INPER 2018-1-163 en NIH P51OD11132. Wij danken Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris en Susana Castro voor hun uitstekende technische bijstand.

De studie werd goedgekeurd door de Research Ethics Committee van het Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico en Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). De reproductie, verzorging en humane eindpunten van de dieren werden vastgesteld volgens de Officiële Mexicaanse Standaard (NOM-062-Z00-1999) op basis van de "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (General Health Law for Health Research) van de Mexicaanse Secretaria of Health.
<p class="jove_...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Een stadium om een neurale stamcelcultuur te verkrijgen is de spijsverteringsperiode met de enzymatische oplossing, die niet meer dan 30 min mag bedragen omdat het de levensvatbaarheid van cellen zou kunnen verminderen. De neurosferen moeten ontstaan op 8-10 dagen na de eerste cultuur; als ze niet op dag 12 tevoorschijn komen, gooi de cultuur weg en herhaal het experiment, waardoor de spijsverteringsperiode wordt verkort. Een ander probleem is de bloedvaten die betrekking hebben op het hersenweefsel. Ze moeten volledig w...

De prairie vole (Microtus ochrogrogaster), een lid van de Cricetidae familie, is een klein zoogdier waarvan de levensstrategie zich ontwikkelt als een sociaal monogame en zeer gezellige soort. Zowel mannen als vrouwen vestigen een blijvende paarband na de paring of lange perioden van samenwonen die worden gekenmerkt door het delen van het nest, het verdedigen van hun grondgebied en het tonen van biparentale zorg voor hun nageslacht1,2,3,4. Zo is de prairie vole een waardevol model voor het begrijpen van de neurobiologische basis van sociaal-seksueel gedrag en beperkingen in sociale cognitie5.
Volwassen neurogenese is een van de meest belangrijke processen van neurale plasticiteit die leidt tot gedragsveranderingen. Bijvoorbeeld, onze onderzoeksgroep gemeld in mannelijke woelmuis dat sociale samenwonen met paring verhoogde cel proliferatie in de subventriculaire zone (VZ) en subgranulaire zone in de dentate gyrus (DG) van de hippocampus, wat suggereert dat volwassen neurogenese kan een rol spelen in de vorming van paar binding veroorzaakt door paring in prairie voles (ongepubliceerde gegevens). Aan de andere kant, hoewel de hersengebieden waar nieuwe neuronen worden gegenereerd en geïntegreerd bekend zijn, blijven de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij deze processen onbepaald vanwege technische nadelen in het hele hersenmodel6. Zo hebben de signaleringstrajecten die de genexpressie en andere cellulaire activiteiten controleren een relatief korte activeringsperiode (detectie van fosfoprotenoom)7. Een alternatief model is geïsoleerd en gekweekte volwassen neurale stamcellen of voorloper cellen om moleculaire componenten die betrokken zijn bij volwassen neurogenese op te helderen.
De eerste benadering om in vitro neurale precursoren uit volwassen zoogdier (muis) hersenen te handhaven was de test van neurosferen, die cellulaire aggregaten groeien onder niet-aanhangende omstandigheden die hun multipotente potentieel om neuronen te genereren behouden,evenalsastrocyten 8,9,10. Tijdens hun ontwikkeling is er een selectieproces waarbij alleen de precursoren zullen reageren op mitogenen zoals de Epidermal Growth Factor (EFG) en Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) om neurosferen te vermenigvuldigen en neurosferen te genereren8,9,10.
Voor zover wij weten, wordt er geen protocol gemeld in de literatuur om volwassen neurale voorouders te verkrijgen van prairiewinnen. Hier hebben we de kweekomstandigheden vastgesteld om neuronale voorouders te isoleren van neurogene niches en hun in vitro onderhoud via de neurosfeervormingstest. Zo kunnen experimenten worden ontworpen om de moleculaire en cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij proliferatie, migratie, differentiatie en overleving van de neurale stamcellen en voorouders, processen die nog onbekend zijn in de prairie vole te identificeren. Bovendien zou het ophelderen van in vitro verschillen in de eigenschappen van de cellen afgeleid van de VZ en DG informatie kunnen verschaffen over de rol van neurogene niches in neurale plasticiteit geassocieerd met veranderingen in sociaal-seksueel gedrag en cognitief gedrag, en tekorten in sociale interacties (autismespectrumstoornis en schizofrenie), die ook seksafhankelijk kunnen zijn.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Neurosferen zijn primaire celaggregaten die neurale stamcellen en voorlopercellen omvatten. Deze 3D-structuren zijn een uitstekend hulpmiddel om de differentiatie en proliferatie potentieel van neurale stamcellen te bepalen, evenals om cellijnen te genereren dan kan worden onderzocht na verloop van tijd. Ook kunnen neurosferen een niche (in vitro) creëren die het mogelijk maakt om de dynamische veranderende omgeving te modelleren, zoals verschillende groeifactoren, hormonen, neurotransmitters, onder andere. Microtus ochrogyster (prairie vole) is een uniek model voor het begrijpen van de neurobiologische basis van sociaal-seksueel gedrag en sociale cognitie. Echter, de cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij dit gedrag zijn niet bekend. Het protocol is bedoeld om neurale voorlopercellen te verkrijgen uit de neurogene niches van de volwassen prairievole, die worden gekweekt onder niet-aanhangende omstandigheden, om neurosferen te genereren. De grootte en het aantal neurosferen zijn afhankelijk van de regio (subventriculaire zone of dentate gyrus) en het geslacht van de prairievole. Deze methode is een opmerkelijk hulpmiddel om geslachtsafhankelijke verschillen in neurogene niches in vitro en de neuroplasticiteitsveranderingen in verband met sociaal gedrag zoals pairbinding en biparentale zorg te bestuderen. Ook cognitieve aandoeningen die leiden tot tekorten in sociale interacties (autisme spectrum stoornissen en schizofrenie) kunnen worden onderzocht.

Neurosferen werden gevormd uit neurale stamcellen geïsoleerd van de VZ en DG van zowel vrouwelijke als mannelijke volwassen prairie woelmuis. Ongeveer 8-10 dagen na het starten van de cultuur, cellen moeten hebben gevormd de neurosferen. Houd er rekening mee dat de plaat puin in de primaire cultuur kan bevatten(figuur 3A). In passage 1 mag de cultuur echter alleen bestaan uit neurosferen(figuur 3B).
Een hoger aantal neurosferen werde...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

We stelden de voorwaarden voor de cultuur neurale voorloper cellen uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van de volwassen hersenen van prairie voles, als een aanvullende in vitro studie, om de seks-afhankelijke verschillen tussen neurogene niches die deel kunnen uitmaken van functionele plastic veranderingen in verband met sociaal gedrag te analyseren.

Cultuur van neurosferen afgeleid van de neurogene niches in Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Deze methode kan helpen om geslachtsafhankelijke verschillen in de neurogene niches te onderzoeken, en om hun neuroplasticiteit te begrijpen, veranderingen die sociale interacties in de prairievole onderstrepen. De test van neurosferen is een uitstekend hulpmiddel om de proliferatie en differentiatie potentieel van neurale stam en voorloper cellen te bepalen. Om te beginnen, plaats een petrischaal op een oppervlak omringd door ijs.Deponeren de hersenen op de schotel en voeg 20 milliliter koude wasoplossing. In het coronale vlak, verdeel de hersenen in twee blokken weefsel met behulp van een scalpel, het uitvoeren van de snede op bregma niveau in de voorste achterste as. Haal de subventriculaire zone, of VZ, weefsel uit het rostral blok, en de dentate gyrus, of DG, weefsel uit het staartblok.Om de VZ te ontleden, houd een van de hemisferen met een Dumont tang, en voeg de fijne uiteinden van een tweede tang onder het weefsel dat lijnen de caudate-putamen. Open de tang langs de rug-ventrale as om het weefsel te scheiden en verzamel de VZ in een centrifugebuis met twee milliliter koude wasoplossing. Pool het weefsel van meer dan twee dieren niet.Herhaal de microdissection in het andere halfrond en bewaar de buis met het weefsel op ijs. Om het DG te ontleden, gebruik een scalpel om een coronale snede in het staartblok te maken, om twee plakjes te verkrijgen waarin de hippocampalvorming wordt waargenomen. Gebruik Dumont tangen om een van de plakjes te houden, en maak een horizontale snede tussen DG en CA1 met een andere tang.Maak vervolgens een verticale incisie tussen het DG en CA3, om het DG te scheiden. Herhaal de dissectie in het andere halfrond van het eerste segment, dan in beide hemisferen in het tweede segment. Verzamel de vier DG-stukken van elke woelmuis in een centrifugebuis. Plaats de centrifugebuizen in de bioveiligheidskast en wacht ongeveer 10 minuten tot de weefselfragmenten door de zwaartekracht neerslaan.Verwijder vervolgens de wasoplossing en voeg een milliliter warme enzymatische oplossing toe aan elke buis. Broed de buizen op 37 graden gedurende 10 minuten. Om de weefselfragmenten te desintegreren, pipette ze op en neer met een punt van één milliliter, maar niet meer dan 30 keer.Herhaal de incubatie bij 37 graden Celsius en pipet het weefsel opnieuw. Voeg negen milliliter N-2 medium toe aan elke buis om de enzymatische behandeling te verdunnen en de buizen gedurende vier minuten op 200 keer g te centrifugeren. Gooi de supernatant weg, was de cellen met 10 milliliter N-2-medium en herhaal de centrifugatie.Verwijder de supernatant uit elke buis, en resuspend de cel pellets van de VZ en DG in twee milliliter en een milliliter van de B-27 medium, respectievelijk. Filter elke celsuspensie met een celzeef van 40 micrometer om niet-verteerd weefsel te verwijderen. Kweek de gefilterde cellen in een ultralaage bevestigingsplaat 24-put, met behulp van twee putten voor de VZ en een put voor het DG. Voeg 20 nanogram per milliliter fibroblast groeifactor 2, en 20 nanogram per milliliter van epidermale groeifactor aan elke put, dan incubeer de plaat op 37 graden Celsius, 5%kooldioxide, en een hoge luchtvochtigheid voor 48 uur.Na de incubatie, verwijder de helft van het kweekmedium en vervang het door vers B-27-medium, aangevuld met dubbele concentraties van de groeifactoren. Herhaal dit proces elke derde dag. Op dagen dat het niet nodig is om het kweekmedium te veranderen, voeg groeifactoren toe aan een uiteindelijke concentratie van 1X.Neurosferen werden gevormd uit de neurale stamcellen geïsoleerd uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van zowel vrouwelijke als mannelijke volwassen prairie woelmuis. Hoewel er puin in de primaire cultuur was, waren alleen neurosferen aanwezig na de eerste passage. Een hoger aantal neurosferen werden verkregen uit de vrouwelijke subventriculaire zone dan uit de mannelijke subventriculaire zone, of de dentate gyrus van zowel vrouwen als mannen, wat suggereert dat het aantal verkregen neurosferen afhangt van de proliferative zone en het woelmuis.De diameter van de neurosferen werd gemeten op dag 8, 11 en 14. Het steeg geleidelijk voor mannelijke en vrouwelijke woelmuis in beide neuronale gebieden, maar neurosferen afgeleid van de mannelijke hersenen waren kleiner in vergelijking met die afkomstig van de vrouwelijke hersenen. Aanhangende neurosferen werden gekenmerkt op dag zes in aanwezigheid van groeifactoren, of op dag 15 zonder groeifactoren.Op dag zes, onder ongedifferentieerde omstandigheden, drukten de neurosfeer-afgeleide cellen Nestin uit, een marker voor neurale voorouders. Het was ook mogelijk om dubbelcortine-positieve cellen en de proliferatiemarker Ki-67 te identificeren, die wijzen op de aanwezigheid van neuronale precursoren of onrijpe neuronen. Echter, het gebrek aan colocalisatie van Ki-67 met DCX suggereerde de aanwezigheid van post-mitotische neuroblasten.Op dag 15 werden onder differentiatieomstandigheden volwassen neuronen en cellen met het gliafenotype gevonden, wat het differentiatiepotentieel van de geïsoleerde cellen aantoonde. Bij een poging van dit protocol, in gedachten houden dat de mogelijkheid om te herkennen en met eerdere praktijk in microdissection is van fundamenteel belang om alleen cellen te isoleren van de neurogene niches. Volgens dit protocol kunnen experimenten worden ontworpen om mechanismen te identificeren die betrokken zijn bij proliferatie, differentiatie en overleving van neurale stam- en voorlopercellen, processen die nog onbekend zijn in de prairievole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissectie en Cultuur van Commissural neuronen van het ruggenmerg Embryonic

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Organotypische Cultuur van Full-dikte van volwassen varkens Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor afgeleide oligodendrocyt Cultuur System van menselijke foetale hersenen

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Een<em&gt; In-vitro</em&gt; Voorbereiding van Geïsoleerde enterische neuronen en Glia uit de myenterische Plexus van de Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-herprogrammering van pericyte-afgeleide cellen van het volwassen menselijke hersenen in Induced Neuronen

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolatie en cultuur van de volwassen neurale stamcellen van de muis Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Een eenvoudige één stap Dissection protocol voor Whole-mount voorbereiding van Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Eenvoudige generatie van de cultuur van een hoog rendement van geïnduceerde neuronen van menselijke volwassen huid fibroblasten

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generatie van neuro sferen van gemengde primaire Hippocampal en corticale neuronen geïsoleerd van E14-e16 Sprague Dawley rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...