Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av tilskudd CONACYT 252756 og 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 og IN203518; INPER 2018-1-163 og NIH P51OD11132. Vi takker Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris og Susana Castro for deres utmerkede tekniske hjelp.

Studien ble godkjent av Forskningsetikkkomiteen i Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexico og Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Reproduksjon, omsorg og humane endepunkter av dyrene ble etablert etter den offisielle meksikanske standarden (NOM-062-Z00-1999) basert på "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Generell helselov for helseforskning) av den meksikanske secretaria of Health.
1. Forberedelser til løsninger ...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Et stadium for å oppnå en nevrale stamcellekultur er fordøyelsesperioden med den enzymatiske løsningen, som ikke bør overstige mer enn 30 min fordi det kan redusere celle levedyktigheten. Nevrosfærene bør dukke opp på 8-10 dager etter innledende kultur; hvis de ikke kommer frem innen dag 12, kast kulturen og gjenta eksperimentet, og reduser fordøyelsesperioden. Et annet problem er blodårene som dekker hjernevevet. De bør fjernes helt under disseksjonen fordi overskuddet av erytrocytter kan forstyrre neurosfær...

Prærievole (Microtus ochrogaster), medlem av Cricetidae-familien, er et lite pattedyr hvis livsstrategi utvikler seg som en sosialt monogam og svært omgjengelig art. Både menn og kvinner etablerer et varig parbånd etter parring eller lange perioder med samboerskap preget av å dele reiret, forsvare sitt territorium og vise biparental omsorg for deres avkom1,2,3,4. Dermed er prærievole en verdifull modell for å forstå det nevrobiologiske grunnlaget for sosio-seksuell atferd og funksjonsnedsettering i sosial kognisjon5.
Voksen nevrogenese er en av de mest avgjørende prosessene med neural plastisitet som fører til atferdsendringer. For eksempel rapporterte vår forskningsgruppe i mannlige voles at sosial samboerskap med parring økte cellespredning i subventrikulær sone (VZ) og subgranulær sone i dentate gyrus (DG) av hippocampus, noe som tyder på at voksen nevrogenese kan spille en rolle i dannelsen av parbinding indusert ved parring i prærievoles (upubliserte data). På den annen side, selv om hjerneområdene der nye nevroner genereres og integreres er velkjente, forblir molekylære og cellulære mekanismer som er involvert i disse prosessene ubestemte på grunn av tekniske ulemper i hele hjernemodellen6. For eksempel har signalveiene som kontrollerer genuttrykk og andre cellulære aktiviteter en relativt kort aktiveringsperiode (påvisning av fosfoproteom)7. En alternativ modell er isolert og kultivert voksen nevrale stamceller eller stamceller for å belyse molekylære komponenter involvert i voksen nevrogenese.
Den første tilnærmingen til å opprettholde in vitro nevrale forløpere fra voksen pattedyr (mus) hjernen var analysen av nøyrosfærer, som er cellulære aggregater vokser under ikke-tilhenger forhold som bevarer deres multipotente potensial til å generere nevroner, samt astrocytter8,9,10. Under utviklingen er det en utvelgelsesprosess der bare forløperne vil reagere på mitogener som Epidermal Growth Factor (EGF) og Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) for å spre og generere nevrosfærer8,9,10.
Så vidt vi vet, rapporteres ingen protokoll i litteraturen for å få voksne nevrale forfedre fra prærievoles. Her etablerte vi kulturforholdene for å isolere nevronale forfedre fra nevrogene nisjer og deres in vitro-vedlikehold gjennom nevrosfæreformasjonsanalysen. Dermed kan eksperimenter utformes for å identifisere molekylære og cellulære mekanismer som er involvert i spredning, migrasjon, differensiering og overlevelse av nevrale stamceller og forfedre, prosesser som fortsatt er ukjente i prærievole. Videre kan belyse in vitro forskjeller i egenskapene til cellene avledet fra VZ og DG gi informasjon om rollen som nevrogene nisjer i neural plastisitet forbundet med endringer i sosio-seksuell atferd og kognitiv atferd, og underskudd i sosiale interaksjoner (autismespekterforstyrrelse og schizofreni), som også kan være kjønnsavhengig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Nevrosfærer er primære celleaggregater som omfatter nevrale stamceller og stamceller. Disse 3D-strukturene er et utmerket verktøy for å bestemme differensierings- og spredningspotensialet til nevrale stamceller, samt å generere cellelinjer enn det som kan analyseres over tid. Også, neurosfærer kan skape en nisje (in vitro) som tillater modellering av det dynamiske skiftende miljøet, for eksempel varierende vekstfaktorer, hormoner, nevrotransmittere, blant andre. Microtus ochrogaster (prærievole) er en unik modell for å forstå det nevrobiologiske grunnlaget for sosio-seksuell atferd og sosial kognisjon. Cellulære mekanismer som er involvert i disse atferdene er imidlertid ikke godt kjent. Protokollen tar sikte på å få nevrale stamceller fra de nevrogene nisjene til den voksne prærievole, som er dyrket under ikke-tilklutnende forhold, for å generere nevrosfærer. Størrelsen og antall neurosfærer avhenger av regionen (subventrikulær sone eller bulke gyrus) og sex av prærievole. Denne metoden er et bemerkelsesverdig verktøy for å studere kjønnsavhengige forskjeller i nevrogene nisjer in vitro og nevroplastisitetsendringer forbundet med sosial atferd som parbinding og biparental omsorg. Også kognitive forhold som medfører underskudd i sosiale interaksjoner (autismespekterforstyrrelser og schizofreni) kan undersøkes.

Neurosfærer ble dannet fra nevrale stamceller isolert fra VZ og DG av både kvinnelige og mannlige voksne prærievoles. Omtrent 8-10 dager etter at kulturen startet, skulle cellene ha dannet nevrosfærene. Legg merke til at platen kan inneholde rusk i primærkulturen (figur 3A). Men i passasje 1 bør kulturen bare bestå av nevrosfærer (figur 3B).
Et høyere antall neurosfærer ble hentet fra den kvinnelige VZ sammenlignet med den m...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Vi etablerte betingelsene for å dyrke nevrale stamceller fra subventrikulær sone og bulke gyrus av den voksne hjernen til prærievoles, som en komplementær in vitro-studie, for å analysere de kjønnsavhengige forskjellene mellom nevrogene nisjer som kan være en del av funksjonelle plastendringer forbundet med sosial atferd.

Kultur av neurosfærer avledet fra nevrogene nisjer i Voksen Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Denne metoden kan bidra til å undersøke kjønnsavhengige forskjeller i nevrogene nisjer, og for å forstå deres nevroplastisitet, endringer som understreker sosiale interaksjoner i prærievole. Analysen av nevrosfærer er et utmerket verktøy for å bestemme sprednings- og differensieringspotensialet til nevrale stamceller og stamceller. Til å begynne med legger du en petriskål på en overflate omgitt av is.Deponer hjernen på parabolen og tilsett 20 milliliter kaldvaskløsning. I koronarplanet deler du hjernen i to blokker av vev ved hjelp av en skalpell, og utfører kuttet på bregmanivå i fremre-bakre akse. Trekk ut subventrikulær sone, eller VZ, vev fra rostralblokken, og dentate gyrus, eller DG, vev fra haleblokken.For å dissekere VZ, hold en av halvkulene med en Dumont tang, og sett inn de fine spissene til en annen tang under vevet som linjer caudate-putamen. Åpne tangen langs dorsal-ventralaksen for å skille vevet, og samle VZ i et sentrifugerør med to milliliter kaldvaskeløsning. Ikke pool vevet av mer enn to dyr.Gjenta mikrodisseksjonen på den andre halvkule og lagre røret med vevet på is. For å dissekere DG, bruk en skalpell for å lage en koronar skåret inn i haleblokken, for å oppnå to skiver der hippocampalformasjonen observeres. Bruk Dumont-tang til å holde en av skivene, og lag et horisontalt kutt mellom DG og CA1 med en annen tang.Deretter gjør et vertikalt snitt mellom DG og CA3, for å skille DG. Gjenta disseksjonen i den andre halvkule av den første skiven, deretter i begge halvkuler i den andre skiven. Samle de fire DG-bitene av hver vole i et sentrifugerør. Plasser sentrifugerørene inne i biosikkerhetsskapet og vent ca. 10 minutter på at vevsfragmentene skal utløses av tyngdekraften.Deretter fjerner du vaskeoppløsningen og legger til en milliliter varm enzymatisk løsning på hvert rør. Inkuber rørene ved 37 grader i 10 minutter. For å gå i oppløsning av vevsfragmentene, pipette dem opp og ned med en en milliliter spiss, men ikke pipette mer enn 30 ganger.Gjenta inkubasjonen ved 37 grader Celsius, og pipetter vevet igjen. Tilsett ni milliliter N-2 medium til hvert rør for å fortynne enzymatisk behandling, og sentrifuge rørene på 200 ganger g i fire minutter. Kast det overnaturante, vask cellene med 10 milliliter N-2 medium, og gjenta sentrifugeringen.Fjern supernatanten fra hvert rør, og gjenbruk cellepellets av VZ og DG i to milliliter og en milliliter av B-27 medium, henholdsvis. Filtrer hver celle suspensjon med en 40 mikrometer celle sil for å fjerne eventuelle ikke-fordøyd vev. Kultur de filtrerte cellene i en ultra-lav vedlegg 24-brønns plate, ved hjelp av to brønner for VZ og en brønn for DG. Tilsett 20 nanogram per milliliter fibroblastvekstfaktor 2, og 20 nanogram per milliliter epidermal vekstfaktor til hver brønn, og inkuber deretter platen ved 37 grader Celsius, 5% karbondioksid og høy luftfuktighet i 48 timer.Etter inkubasjonen fjerner du halvparten av kulturmediet og erstatter det med friskt B-27-medium, supplert med doble konsentrasjoner av vekstfaktorene. Gjenta denne prosessen hver tredje dag. På dager da det ikke er nødvendig å endre kulturmediet, legg til vekstfaktorer til en endelig konsentrasjon på 1X.Neurosfærer ble dannet fra nevrale stamceller isolert fra subventrikulær sone og bulke gyrus av både kvinnelige og mannlige voksne prærievoles. Selv om det var rusk i primærkulturen, var bare nevrosfærer tilstede etter den første passasjen. Et høyere antall neurosfærer ble hentet fra den kvinnelige subventrikulære sonen enn fra den mannlige subventrikulære sonen, eller dentate gyrus av både kvinner og menn, noe som tyder på at antall neurosfærer oppnådd avhenger av den proliferative sonen og vole sex.Diameteren på neurosfærene ble målt på dag 8, 11 og 14. Det økte gradvis for mannlige og kvinnelige voles i begge nevronale regioner, men neurosfærer avledet fra de mannlige hjernene var mindre i forhold til de avledet fra de kvinnelige hjernene. Vedvarende nevrosfærer ble karakterisert på dag seks i nærvær av vekstfaktorer, eller på dag 15 uten vekstfaktorer.På dag seks, under udifferensierte forhold, uttrykte de neurosphere-avledede cellene Nestin, en markør for nevrale forfedre. Det var også mulig å identifisere dobbeltkortinpositive celler og spredningsmarkøren Ki-67, som indikerer tilstedeværelsen av enten nevronale forløpere eller umodne nevroner. Imidlertid foreslo mangelen på colocalization av Ki-67 med DCX tilstedeværelsen av post-mitotiske nevroblaster.På dag 15, under differensieringsforhold, ble modne nevroner og celler med glialfenotypen funnet, noe som viser differensieringspotensialet til de isolerte cellene. Når du prøver denne protokollen, husk at det å kunne gjenkjenne og ha tidligere praksis i mikrodisseksjon er grunnleggende for å isolere bare celler fra de nevrogene nisjene. Etter denne protokollen kan eksperimenter utformes for å identifisere mekanismer som er involvert i spredning, differensiering og overlevelse av nevrale stamceller og stamceller, prosesser som fortsatt er ukjente i prærievole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Stamfar-avledet Oligodendrocyte Kultur System fra Human fosterets hjerne

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

En<em&gt; In-vitro</em&gt; Utarbeidelse av Isolerte Enteriske nevroner og gliaceller fra myenteric Plexus av Adult Mouse

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, to kulturer: Isolation and Culture of Adult nevrale stamceller fra de to nevrogene Soner Individuell Mus

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-deriverte celler av den voksne Human Brain inn Utførte Nerveceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolasjon og Culture of Adult Neural stamceller fra mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel ett-trinns Dissection Protokoll for Whole-mount Utarbeidelse av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkel generasjon av en høy avkastning kultur indusert neurons fra menneskelige voksne huden fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generering av Neurospheres fra Mixed Primary hippocampus og kortikale neurons isolert fra E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...