Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pelas bolsas CONACYT 252756 e 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT EM 202818 e IN203518; INPER 2018-1-163, e NIH P51OD11132. Agradecemos a Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris e Susana Castro por sua excelente assistência técnica.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México e Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). A reprodução, o cuidado e os pontos finais humanos dos animais foram estabelecidos seguindo a Norma Oficial Mexicana (NOM-062-Z00-1999) com base no "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Lei Geral de Saúde para Pesquisa em Saúde) da Secretaria de Saúde mexicana.
1. Preparaç...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Um estágio para obter uma cultura de células-tronco neurais é o período de digestão com a solução enzimática, que não deve exceder mais de 30 minutos porque pode diminuir a viabilidade celular. As neurosferas devem surgir entre 8 e 10 dias após a cultura inicial; se eles não emergirem até o dia 12, descartem a cultura e repitam o experimento, reduzindo o período de digestão. Outra questão são os vasos sanguíneos que cobrem o tecido cerebral. Eles devem ser completamente removidos durante a dissecção po...

O vole da pradaria (Microtus ochrogaster), um membro da família Cricetidae, é um pequeno mamífero cuja estratégia de vida se desenvolve como uma espécie socialmente monogâmous e altamente sociável. Tanto os machos quanto as fêmeas estabelecem um vínculo de par duradouro após o acasalamento ou longos períodos de convivência caracterizados pela partilha do ninho, pela defesa de seu território e pela exibição de cuidados biparentais para sua prole1,2,3,4. Assim, o vole pradaria é um modelo valioso para a compreensão da base neurobiológica do comportamento sociosexual e das deficiências na cognição social5.
Neurogênese adulta é um dos processos mais primordiais da plasticidade neural que leva a mudanças comportamentais. Por exemplo, nosso grupo de pesquisa relatou em voles masculinos que a coabitação social com o acasalamento aumentou a proliferação celular na zona subventricular (VZ) e na zona subgranular no giro dentado (DG) do hipocampo, sugerindo que a neurogênese adulta pode desempenhar um papel na formação de laços induzidos pelo acasalamento em voles de pradaria (dados inéditos). Por outro lado, embora as regiões cerebrais onde novos neurônios são gerados e integrados sejam bem conhecidas, os mecanismos moleculares e celulares envolvidos nesses processos permanecem indeterminados devido a desvantagens técnicas em todo o modelo cerebral6. Por exemplo, as vias de sinalização que controlam a expressão genética e outras atividades celulares têm um período de ativação relativamente curto (detecção de fosfoproteome)7. Um modelo alternativo são células-tronco neurais adultas isoladas e cultivadas ou células progenitoras para elucidar componentes moleculares envolvidos na neurogênese adulta.
A primeira abordagem para manter precursores neurais in vitro do cérebro de mamíferos adultos (camundongos) foi o ensaio das neurosferas, que são agregados celulares crescendo sob condições não aderentes que preservam seu potencial multipotente para gerar neurônios, bem como astrócitos8,9,10. Durante seu desenvolvimento, há um processo seletivo onde apenas os precursores responderão a mitogênios como o Fator de Crescimento Epidérmico (EGF) e o Fator de Crescimento do Fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar e gerar neuroesferas8,9,10.
Pelo que sabemos, nenhum protocolo é relatado na literatura para obter progenitores neurais adultos de voles pradarias. Aqui, estabelecemos as condições de cultura para isolar progenitores neuronais de nichos neurogênicos e sua manutenção in vitro através do ensaio de formação da neurosfera. Assim, os experimentos podem ser projetados para identificar os mecanismos moleculares e celulares envolvidos na proliferação, migração, diferenciação e sobrevivência das células-tronco neurais e progenitores, processos que ainda são desconhecidos na pradaria. Além disso, a elucidação de diferenças in vitro nas propriedades das células derivadas do VZ e DG poderia fornecer informações sobre o papel dos nichos neurogênicos na plasticidade neural associados a mudanças no comportamento sociosexual e comportamentos cognitivos, e déficits nas interações sociais (transtorno do espectro autista e esquizofrenia), que também poderiam ser dependentes do sexo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Neurosferas são agregados de células primárias que compreendem células-tronco neurais e células progenitoras. Essas estruturas 3D são uma excelente ferramenta para determinar o potencial de diferenciação e proliferação de células-tronco neurais, bem como para gerar linhas celulares do que pode ser avaliado ao longo do tempo. Além disso, as neurosferas podem criar um nicho (in vitro) que permite a modelagem do ambiente de mudança dinâmica, como diferentes fatores de crescimento, hormônios, neurotransmissores, entre outros. Microtus ochrogaster (pradaria vole) é um modelo único para compreender a base neurobiológica dos comportamentos sociosexual e da cognição social. No entanto, os mecanismos celulares envolvidos nesses comportamentos não são bem conhecidos. O protocolo visa obter células progenitoras neurais dos nichos neurogênicos do vole da pradaria adulta, que são cultivadas sob condições não aderentes, para gerar neurosferas. O tamanho e o número de neurosferas dependem da região (zona subventricular ou giro dento) e sexo do vole da pradaria. Este método é uma ferramenta notável para estudar diferenças dependentes do sexo em nichos neurogênicos in vitro e as mudanças de neuroplasticidade associadas a comportamentos sociais como a união de pares e cuidados biparentais. Além disso, poderiam ser examinadas condições cognitivas que acarretam déficits nas interações sociais (transtornos do espectro autista e esquizofrenia).

As neurosferas foram formadas a partir de células-tronco neurais isoladas do VZ e DG de voles de pradarias adultas femininas e masculinas. Cerca de 8-10 dias após o início da cultura, as células deveriam ter formado as neuroesferas. Note que a placa pode conter detritos na cultura primária(Figura 3A). No entanto, na passagem 1 a cultura deve consistir apenas de neuroesferas (Figura 3B).
Maior número de neurosferas foram obtidas ...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Estabelecemos as condições para cultivar células progenitoras neurais da zona subventricular e do giro dento do cérebro adulto de voles de pradaria, como um estudo in vitro complementar, para analisar as diferenças sex-dependentes entre nichos neurogênicos que poderiam fazer parte de mudanças plásticas funcionais associadas aos comportamentos sociais.

Cultura das Neurosferas Derivadas dos Nichos Neurogênicos em Voles de Pradaria Adulta

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Este método pode ajudar a investigar diferenças dependentes do sexo nos nichos neurogênicos, e a entender sua neuroplasticidade, mudanças que sublinham as interações sociais no vole da pradaria. O ensaio das neurosferas é uma excelente ferramenta para determinar o potencial de proliferação e diferenciação das células neurais e progenitoras. Para começar, coloque uma placa de Petri em uma superfície cercada de gelo.Deposite o cérebro no prato e adicione 20 mililitros de solução de lavagem a frio. No plano coronal, divida o cérebro em dois blocos de tecido usando um bisturi, realizando o corte ao nível de bregma no eixo anterior-posterior. Extrair a zona subventricular, ou VZ, tecido do bloco rostral, e o giro dentado, ou DG, tecido do bloco caudal.Para dissecar o VZ, segure um dos hemisférios com um fórceps Dumont, e insira as pontas finas de um segundo fórceps sob o tecido que reveste o caudate-putamen. Abra os fórceps ao longo do eixo dorsal-ventral para separar o tecido, e colete o VZ em um tubo de centrífuga com dois mililitros de solução de lavagem fria. Não acumule o tecido de mais de dois animais.Repita a microdisseção no outro hemisfério e armazene o tubo com o tecido no gelo. Para dissecar o DG, use um bisturi para fazer um corte coronal no bloco caudal, para obter duas fatias nas quais a formação hipocampal é observada. Use fórceps Dumont para segurar uma das fatias e faça um corte horizontal entre DG e CA1 com outro fórceps.Em seguida, faça uma incisão vertical entre o DG e o CA3, para separar o DG. Repita a dissecção no outro hemisfério da primeira fatia, depois em ambos os hemisférios na segunda fatia. Colete os quatro pedaços de DG de cada vole em um tubo de centrífuga. Coloque os tubos de centrífugas dentro do armário de biossegurança e espere aproximadamente 10 minutos para que os fragmentos de tecido precipitam pela gravidade.Em seguida, remova a solução de lavagem e adicione um mililitro de solução enzimática quente a cada tubo. Incubar os tubos a 37 graus por 10 minutos. Para desintegrar os fragmentos de tecido, pipeta-os para cima e para baixo com uma ponta de um mililitro, mas não pipeta mais de 30 vezes.Repita a incubação a 37 graus Celsius e depois encote o tecido novamente. Adicione nove mililitros de meio N-2 a cada tubo para diluir o tratamento enzimático e centrifugar os tubos a 200 vezes g durante quatro minutos. Descarte o supernasce, lave as células com 10 mililitros de meio N-2 e repita a centrifugação.Remova o supernatante de cada tubo e resuspenja as pelotas celulares do VZ e DG em dois mililitros e um mililitro do meio B-27, respectivamente. Filtre cada suspensão celular com um coador de células de 40 micrômetros para remover qualquer tecido não digerido. Cultume as células filtradas em uma placa de 24 poços de fixação ultra-baixa, usando dois poços para o VZ e um bem para o DG. Adicione 20 nanogramas por mililitro do fator de crescimento do fibroblasto 2, e 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico a cada poço, em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e alta umidade por 48 horas.Após a incubação, remova metade do meio de cultura e substitua-o por meio B-27 fresco, complementado com duplas concentrações dos fatores de crescimento. Repita esse processo a cada três dias. Nos dias em que não é necessário mudar o meio de cultura, adicione fatores de crescimento a uma concentração final de 1X.As neurosferas foram formadas a partir das células-tronco neurais isoladas da zona subventricular e do giro dento de ambos os voles da pradaria adulta feminina e masculina. Embora houvesse detritos na cultura primária, apenas as neurosferas estavam presentes após a primeira passagem. Um maior número de neurosferas foram obtidas da zona subventricular feminina do que da zona subventricular masculina, ou do giro dentado de fêmeas e machos, sugerindo que o número de neurosferas obtidas depende da zona proliferativa e do sexo de vole.O diâmetro das neurosferas foi medido nos dias 8, 11 e 14. Aumentou progressivamente para os voles masculinos e femininos em ambas as regiões neuronais, mas as neurosferas derivadas dos cérebros masculinos eram menores em comparação com as derivadas dos cérebros femininos. As neurosferas aderidas foram caracterizadas no sexto dia na presença de fatores de crescimento, ou no dia 15 sem fatores de crescimento.No sexto dia, sob condições indiferenciadas, as células derivadas da neurosfera expressaram Nestin, um marcador para progenitores neurais. Também foi possível identificar células doublecortin-positivas e o marcador de proliferação Ki-67, que indicam a presença de precursores neuronais ou neurônios imaturos. No entanto, a falta de colocalização do Ki-67 com DCX sugeriu a presença de neuroblastos pós-mitóticos.No dia 15, em condições de diferenciação, foram encontrados neurônios maduros e células com o fenótipo gliano, demonstrando o potencial de diferenciação das células isoladas. Ao tentar esse protocolo, tenha em mente que ser capaz de reconhecer e ter prática prévia em microdisseção é fundamental para isolar apenas as células dos nichos neurogênicos. Seguindo este protocolo, os experimentos podem ser projetados para identificar mecanismos envolvidos na proliferação, diferenciação e sobrevivência de células-tronco neurais e progenitoras, processos que ainda são desconhecidos no vole da pradaria.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissecção e Cultura de Neurônios da Medula Espinhal comissural embrionárias

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Neurociência

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Cultura organotípicas de Full-espessura Retina Porcina Adulto

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor derivado Sistema de Cultura oligodendroglial Cérebro Fetal Humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Um<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparação de neurônios entéricos isolados e células gliais do plexo mioentérico do Rato Adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Um rato, duas culturas: isolamento e cultivo de células-tronco neurais Adulto de as duas zonas neurogênica Individual Ratos

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolamento e Cultura de células estaminais adultas neurais do Subcallosal Zona Rato

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Um de uma etapa simples protocolo de dissecação para Whole mount-Preparação do Adulto<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Simples geração de uma cultura de alto rendimento de neurônios induzidas de fibroblastos de pele humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Geração de neuroesferas do hipocampal preliminar misturado e dos neurônios corticais isolados de E14-E16 embrião do rato de Sprague Dawley

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...