Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами CONACYT 252756 и 253631; УНАМ-ДГАПА-ПАПИИТ В202818 и В203518; INPER 2018-1-163 и NIH P51OD11132. Мы благодарим Дейси Гаска, Карлоса Лосано, Мартин Гарсия, Алехандру Кастилью, Нидию Эрнандес, Джессику Норрис и Сюзанну Кастро за отличную техническую помощь.

Исследование было одобрено Комитетом по этике исследований Института нейробиологии, Национального университета Мексики и Национального института перинатологии (2018-1-163). Воспроизводство, уход и гуманные конечные точки животных были созданы в соответствии с официальным мексиканским с...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Стадией получения культуры нервных стволовых клеток является период пищеварения с энзиматическим раствором, который не должен превышать более 30 минут, поскольку он может снизить жизнеспособность клеток. Нейросферы должны появиться через 8-10 дней после первоначальной культуры; если о?...

Прерии vole (Microtus ochrogaster), член семьи Cricetidae, является небольшое млекопитающее, чья жизненная стратегия развивается как социально моногамный и весьма общительный вид. Как самцы, так и самки устанавливают прочную парную связь после спаривания или длительных периодов сожительства, характеризующихся разделением гнезда, защитой своей территории и проявлением двухродногоухода за потомством 1,2,3,4. Таким образом, прерии vole является ценной моделью для понимания нейробиологической основы социально-сексуального поведения и нарушений в социальном познании5.
Взрослый нейрогенез является одним из наиболее важных процессов нервной пластичности, что приводит к поведенческим изменениям. Например, наша исследовательская группа сообщила в мужских voles, что социальное сожительство с спариванием увеличение пролиферации клеток в субвентрикулярной зоне (ВЗ) и субгранулярной зоне в зубной извилине (DG) гиппокампа, предполагая, что взрослый нейрогенез может играть определенную роль в формировании парных связей, вызванных спариванием в прерии voles (неопубликованные данные). С другой стороны, хотя области мозга, где новые нейроны генерируются и интегрированы хорошо известны, молекулярные и клеточные механизмы, участвующие в этих процессах остаются неопределенными из-за технических недостатков во всеймодели мозга 6. Например, сигнальные пути, контролирующие экспрессию генов и другие клеточные виды деятельности, имеют относительно короткий период активации (обнаружение фосфопротеома)7. Одной из альтернативных моделей являются изолированные и культурные взрослые нервные стволовые клетки или клетки-предшественники для выяснения молекулярных компонентов, участвующих во взрослом нейрогенезе.
Первым подходом к поддержанию в пробирке нервных прекурсоров от взрослого млекопитающего (мыши) мозга был анализ нейросфер, которые являются клеточными агрегатами, растущими в непристремленных условиях, которые сохраняют их мультипотентный потенциал для генерации нейронов, а такжеастроцитов 8,9,10. Во время их развития, есть процесс отбора, где только предшественники будут реагировать на митогены, такие как эпидермальный фактор роста (EGF) и фактор роста фибробластов 2 (FGF2) размножаться и генерироватьнейросферы 8,9,10.
К нашим знаниям, в литературе не сообщается о протоколе получения взрослых нейронных прародителей из прерий voles. Здесь мы создали культурные условия для изоляции прогениторов нейронов от нейрогенных ниш и их поддержания в пробирке через анализ формирования нейросферы. Таким образом, эксперименты могут быть разработаны для выявления молекулярных и клеточных механизмов, участвующих в распространении, миграции, дифференциации и выживании нервных стволовых клеток и прародителей, процессов, которые до сих пор неизвестны в прерии vole. Кроме того, выяснение различий в пробирке в свойствах клеток, полученных из ВЗ и ГД, может предоставить информацию о роли нейрогенных ниш в нервной пластичности, связанных с изменениями в социально-сексуальном поведении и когнитивном поведении, а также о дефиците социальных взаимодействий (расстройство аутистического спектра и шизофрения), которые также могут быть секс-зависимыми.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Нейросферы являются первичными клеточными агрегатами, которые состоят из нервных стволовых клеток и клеток-предшественников. Эти 3D структуры являются отличным инструментом для определения дифференциации и распространения потенциала нервных стволовых клеток, а также для создания клеточных линий, чем можно повести с течением времени. Кроме того, нейросферы могут создать нишу (in vitro), что позволяет моделирование динамических меняющихся условиях, таких как различные факторы роста, гормоны, нейротрансмиттеры, среди других. Микротус охрогастер (prairie vole) является уникальной моделью для понимания нейробиологической основы социально-сексуального поведения и социального познания. Тем не менее, клеточные механизмы, участвующие в этом поведении, не очень хорошо известны. Протокол направлен на получение нейронных клеток-предшественников из нейрогенных ниш взрослой прерии vole, которые культурироваться в условиях неприятеля, для создания нейросфер. Размер и количество нейросфер зависят от региона (субвентрикулярной зоны или зубной извилины) и пола прерии vole. Этот метод является замечательным инструментом для изучения секс-зависимых различий в нейрогенных нишах in vitro и нейропластичных изменений, связанных с социальным поведением, таким как парная связь и двухпарадный уход. Кроме того, когнитивные условия, которые влечет за собой дефицит в социальных взаимодействий (расстройства аутистического спектра и шизофрении) могут быть рассмотрены.

Нейросферы были сформированы из нервных стволовых клеток, изолированных от V и DG как женщин, так и мужчин взрослых прерий voles. Примерно через 8-10 дней после начала культуры, клетки должны были образовать нейросферы. Обратите внимание, что пластина может содержать мусор в основной культур?...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Мы создали условия для культуры нейронных клеток-предшественников из субвентрикулярной зоны и зубной извилины взрослого мозга прерий voles, в качестве дополнительного исследования in vitro, для анализа секс-зависимых различий между нейрогенными нишами, которые могут быть частью функциональных пластиковых изменений, связанных с социальным поведением.

Культура нейросфер, полученных из нейрогенных ниш во взрослой прерии Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Этот метод может помочь исследовать секс-зависимые различия в нейрогенных нишах, и понять их нейропластичность, изменения, которые подчеркивают социальные взаимодействия в прерии vole. Анализ нейросфер является отличным инструментом для определения пролиферации и дифференциации потенциала нервных стволовых клеток и клеток-предшественников. Для начала поместите чашку Петри на поверхность, окруженную льдом.Депозит мозга на блюдо и добавить 20 миллилитров холодного раствора мытья. В корональной плоскости, разделить мозг на два блока ткани с помощью скальпеля, выполняя разрез на уровне брегмы в передней-задней оси. Извлекайте субвентрикулярную зону, или ВЗ, ткань из рострального блока, и изморозка из хвостовой извилины, или ГД, из хвостового блока.Чтобы вскрыть ВЗ, удерживайте одно из полушарий с помощью типса Дюмона и вставьте тонкие кончики второго типса под тканью, высовываемой каудат-путамен. Откройте типсы вдоль спинной вентральной оси, чтобы отделить ткань, и соберите V в центрифугу трубку с двумя миллилитров холодного раствора мытья. Не объединить ткани более двух животных.Повторите микропересмешку в другом полушарии и храните трубку с тканью на льду. Чтобы вскрыть ГД, используйте скальпель, чтобы сделать корональный разрезать на хвостовой блок, чтобы получить два ломтика, в которых гиппокампа образование наблюдается. Используйте типсы Dumont, чтобы держать один из ломтиков, и сделать горизонтальный разрез между DG и CA1 с другой типсов.Затем сделайте вертикальный разрез между DG и CA3, чтобы отделить DG. Повторите вскрытие в другом полушарии первого ломтика, затем в обоих полушариях во втором ломтике. Соберите четыре ГД штук каждого vole в центрифуге трубки. Поместите центрифуги труб внутри шкафа биобезопасности и ждать около 10 минут для фрагментов ткани, чтобы осаждать под действием силы тяжести.Затем снимите раствор для мытья и добавьте по миллилитр теплого энзиматичного раствора в каждую трубку. Инкубировать трубки при 37 градусах в течение 10 минут. Чтобы распасть фрагменты ткани, пипетки их вверх и вниз с одним миллилитровым кончиком, но не пипетки более 30 раз.Повторите инкубацию при 37 градусах по Цельсию, а затем пипетку ткани снова. Добавьте девять миллилитров N-2 среды к каждой трубке, чтобы разбавить энзиматической обработки, и центрифуга труб при 200 раз g в течение четырех минут. Откажитесь от супернатанта, вымойте клетки 10 миллилитров среды N-2 и повторите центрифугу.Удалите супернатант из каждой трубки и повторно посовелите клеточные гранулы ВЗ и ГД в два миллилитров и один миллилитр среды B-27, соответственно. Фильтр каждой клетки подвески с 40 микрометровых клеток ситечко, чтобы удалить любые непереваренные ткани. Культура фильтрованных ячеек в ультра-низком крепление 24-хорошо пластины, используя две скважины для ВЗ и один хорошо для ГД. Добавьте 20 нанограмм на миллилитр фактора роста фибробластов 2 и 20 нанограмм на миллилитр эпидермального фактора роста к каждой пластине, затем инкубировать пластину при 37 градусах цельсия, 5%углекислом газе и высокой влажности в течение 48 часов.После инкубации удалите половину среды культуры и замените ее свежей средой B-27, дополненной двойными концентрациями факторов роста. Повторяйте этот процесс каждый третий день. В дни, когда нет необходимости менять культурную среду, добавьте факторы роста к конечной концентрации 1X.Нейросферы были сформированы из нервных стволовых клеток, изолированных от субвентрикулярной зоны и зубной извилины как женщин, так и мужчин взрослых прерий voles. Хотя в первичной культуре был мусор, после первого прохода присутствовали только нейросферы. Большее количество нейросфер было получено из женской субвентрикулярной зоны, чем из мужской субвентрикулярной зоны, или зубной извилины как женщин, так и мужчин, что свидетельствует о том, что количество полученных нейросфер зависит от зоны пролиферации и vole sex.Диаметр нейросфер измерялся в дни 8, 11 и 14. Он постепенно увеличивался для мужских и женских voles в обоих нейронных регионах, но нейросферы, полученные из мужского мозга были меньше по сравнению с теми, которые получены из женского мозга. Прилипаемые нейросферы характеризовались на шестой день наличием факторов роста, или на 15-й день без факторов роста.На шестой день, в недифференцированных условиях, нейросферные клетки выразили Nestin, маркер для нейронных прародителей. Также удалось определить двойные маркерин-положительные клетки и маркер пролиферации Ki-67, которые указывают на наличие либо нейрональных прекурсоров, либо незрелых нейронов. Однако отсутствие колокализации Ки-67 с DCX свидетельствует о наличии постмитотических нейробластов.В день 15, в условиях дифференциации, зрелые нейроны и клетки с глиальным фенотипом были найдены, демонстрируя потенциал дифференциации изолированных клеток. При попытке этого протокола, имейте в виду, что возможность распознавать и иметь предыдущую практику в микропересмешении имеет основополагающее значение для изоляции только клетки из нейрогенных ниш. Следуя этому протоколу, эксперименты могут быть разработаны для выявления механизмов, участвующих в распространении, дифференциации и выживании нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, процессов, которые до сих пор неизвестны в прерии vole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Разбор и культуры спаечный Нейроны из эмбриональных спинного мозга

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Органотипической Культура Полная толщина сетчатки взрослых свиней

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Прародитель полученные из олигодендроцитов системе культуры человека от мозга плода

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

<em&gt; Экстракорпоральное</em&gt; Подготовка Изолированные Кишечные нейронов и глии от мышечно-кишечного сплетения взрослой мыши

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Один мышь, двух культур: Выделение и культивирование взрослых нервных стволовых клеток из двух Нейрогенные зон отдельных мышей

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-перепрограммирование перицитов клеток, полученных из взрослых мозга человека в индуцированные нейронов

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Выделение и культуры взрослых нервные стволовые клетки от мыши зоны расположенный под мозолистым телом

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Простой Одношаговый Вскрытие Протокол целом монтажа подготовки взрослых<em&gt; Drosophila</em&gt; Мозги

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Поколение нейросфер из смешанных первичных гиппокампа и кортикальных нейронов изолированы от E14-E16 Sprague Даули Крыса эмбриона

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...