Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por las subvenciones CONACYT 252756 y 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 e IN203518; INPER 2018-1-163 y NIH P51OD11132. Agradecemos a Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernández, Jessica Norris y Susana Castro por su excelente asistencia técnica.

El estudio fue aprobado por el Comité de ética de la investigación del Instituto de Neurobiología, la Universidad Nacional Autónoma de México, México y el Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). La reproducción, cuidado y punto final humano de los animales se estableció siguiendo la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-Z00-1999) basada en la Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud.
1. Preparación de soluciones y existencias
<ol><li>Preparar un medio de ...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Una etapa para obtener un cultivo de células madre neurales es el período de digestión con la solución enzimática, que no debe exceder más de 30 min porque podría disminuir la viabilidad celular. Las neuroesferas deben emerger a los 8-10 días después del cultivo inicial; si no emergen en el día 12, deseche el cultivo y repita el experimento, reduciendo el período de digestión. Otro problema son los vasos sanguíneos que cubren el tejido cerebral. Deben eliminarse por completo durante la disección porque el e...

La pradera vole(Microtus ochrogaster), miembro de la familia Cricetidae, es un pequeño mamífero cuya estrategia de vida se desarrolla como una especie socialmente monógama y altamente sociable. Tanto los machos como las hembras establecen un vínculo de pareja duradero después del apareamiento o largos períodos de convivencia caracterizados por compartir el nido, defender su territorio, y mostrar cuidado biparental para su progenie1,2,3,4. Por lo tanto, la pradera vole es un modelo valioso para entender la base neurobiológica de la conducta socio-sexual y las deficiencias en la cognición social5.
La neurogénesis adulta es uno de los procesos más importantes de plasticidad neuronal que conduce a cambios de comportamiento. Por ejemplo, nuestro grupo de investigación informó en voles masculinos que la cohabitación social con el apareamiento aumentó la proliferación celular en la zona subventricular (VZ) y la zona subgranular en el giro dentado (DG) del hipocampo, lo que sugiere que la neurogénesis adulta puede desempeñar un papel en la formación de la unión de pareja inducida por el apareamiento en voles de praderas (datos inéditos). Por otro lado, aunque las regiones cerebrales donde se generan e integran nuevas neuronas son bien conocidas, los mecanismos moleculares y celulares implicados en estos procesos permanecen indeterminados debido a inconvenientes técnicos en todo el modelo cerebral6. Por ejemplo, las vías de señalización que controlan la expresión génica y otras actividades celulares tienen un período de activación relativamente corto (detección de fosfoproteoma)7. Un modelo alternativo son las células madre neurales adultas aisladas y cultivadas o las células progenitoras para dilucidar los componentes moleculares implicados en la neurogénesis adulta.
El primer enfoque para mantener precursores neuronales in vitro del cerebro de mamíferos adultos (ratón) fue el ensayo de neuroesferas, que son agregados celulares que crecen en condiciones no adherentes que preservan su potencial multipotente para generar neuronas, así como astrocitos8,9,10. Durante su desarrollo, existe un proceso de selección donde sólo los precursores responderán a mitógenos como el Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y el Factor de Crecimiento fibroblasto 2 (FGF2) para proliferar y generar neuroesferas8,9,10.
Hasta nuestro conocimiento, no se informa de ningún protocolo en la literatura para obtener progenitores neuronales adultos de los voles de las praderas. Aquí, establecimos las condiciones de cultivo para aislar a los progenitores neuronales de nichos neurogénicos y su mantenimiento in vitro a través del ensayo de formación de neurosfera. Por lo tanto, los experimentos pueden ser diseñados para identificar los mecanismos moleculares y celulares involucrados en la proliferación, migración, diferenciación y supervivencia de las células madre neurales y progenitores, procesos que todavía se desconocen en la pradera vole. Además, el esclarecer las diferencias in vitro en las propiedades de las células derivadas de la VZ y la DG podría proporcionar información sobre el papel de los nichos neurogénicos en la plasticidad neuronal asociados con los cambios en el comportamiento socio-sexual y los comportamientos cognitivos, y los déficits en las interacciones sociales (trastorno del espectro autista y esquizofrenia), que también podrían ser sexualmente dependientes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Las neuroesferas son agregados de células primarias que comprenden células madre neurales y células progenitoras. Estas estructuras 3D son una excelente herramienta para determinar el potencial de diferenciación y proliferación de las células madre neurales, así como para generar líneas celulares que se pueden probar con el tiempo. Además, las neuroesferas pueden crear un nicho (in vitro) que permite el modelado del entorno de cambio dinámico, como factores de crecimiento variables, hormonas, neurotransmisores, entre otros. Microtus ochrogaster (prairie vole) es un modelo único para entender la base neurobiológica de los comportamientos socio-sexuales y la cognición social. Sin embargo, los mecanismos celulares involucrados en estos comportamientos no son bien conocidos. El protocolo tiene como objetivo obtener células progenitoras neuronales de los nichos neurogénicos de la pradera adulta vole, que se cultivan en condiciones no adherentes, para generar neuroesferas. El tamaño y el número de neuroesferas dependen de la región (zona subventricular o giro dentado) y el sexo de la pradera vole. Este método es una herramienta notable para estudiar las diferencias dependientes del sexo en nichos neurogénicos in vitro y los cambios de neuroplasticidad asociados con comportamientos sociales como la unión de pares y la atención biparental. Además, se podrían examinar las condiciones cognitivas que entrañan déficits en las interacciones sociales (trastornos del espectro autista y esquizofrenia).

Las neuroesferas se formaron a partir de células madre neurales aisladas del VZ y DG de los voles de las praderas adultas femeninas y masculinas. Alrededor de 8-10 días después de iniciar el cultivo, las células deben haber formado las neuroesferas. Tenga en cuenta que la placa puede contener residuos en el cultivo primario (Figura 3A). Sin embargo, en el paso 1 el cultivo sólo debe consistir en neuroesferas(Figura 3B).
Se obtuvo...

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Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Establecimos las condiciones para cultivar células progenitoras neuronales de la zona subventricular y dennato gyrus del cerebro adulto de las praderas voles, como un estudio in vitro complementario, para analizar las diferencias dependientes del sexo entre nichos neurogénicos que podrían ser parte de los cambios plásticos funcionales asociados con los comportamientos sociales.

Cultura de las Neuroesferas Derivadas de los Nichos Neurogénicos en Voles de La Pradera Adulta

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Este método puede ayudar a investigar las diferencias dependientes del sexo en los nichos neurogénicos, y a entender su neuroplasticidad, cambios que subrayan las interacciones sociales en la pradera vole. El ensayo de las neuroesferas es una excelente herramienta para determinar el potencial de proliferación y diferenciación de células madre neurales y progenitoras. Para empezar, coloque un plato de Petri en una superficie rodeada de hielo.Deposite el cerebro en el plato y agregue 20 mililitros de solución de lavado en frío. En el plano coronal, divide el cerebro en dos bloques de tejido usando un bisturí, realizando el corte a nivel de bregma en el eje anterior-posterior. Extraiga la zona subventricular, o VZ, el tejido del bloque rostral y el tejido dentato gyrus, o DG, del bloque caudal.Para diseccionar el VZ, sostenga uno de los hemisferios con un fórceps Dumont, e inserte las puntas finas de un segundo fórceps debajo del tejido que recuesta los caudados-putamen. Abra los fórceps a lo largo del eje dorsal-ventral para separar el tejido, y recoja el VZ en un tubo centrífugo con dos mililitros de solución de lavado en frío. No acose el tejido de más de dos animales.Repita la microdisección en el otro hemisferio y almacene el tubo con el tejido en hielo. Para diseccionar la DG, utilice un bisturí para hacer un corte coronal en el bloque caudal, para obtener dos rebanadas en las que se observa la formación del hipocampo. Utilice fórceps Dumont para sostener una de las rodajas y haga un corte horizontal entre DG y CA1 con otro fórceps.A continuación, haga una incisión vertical entre la DG y CA3, para separar la DG. Repita la disección en el otro hemisferio de la primera rebanada, luego en ambos hemisferios en la segunda rebanada. Recoger las cuatro piezas DG de cada vole en un tubo centrífugo. Coloque los tubos centrífugos dentro del gabinete de bioseguridad y espere aproximadamente 10 minutos hasta que los fragmentos de tejido se precipiten por gravedad.A continuación, retire la solución de lavado y agregue un mililitro de solución enzimática caliente a cada tubo. Incubar los tubos a 37 grados durante 10 minutos. Para desintegrar los fragmentos de tejido, pipetearlos hacia arriba y hacia abajo con una punta de un mililitro, pero no pipetee más de 30 veces.Repita la incubación a 37 grados centígrados y, a continuación, vuelva a pipetear el tejido. Añadir nueve mililitros de medio N-2 a cada tubo para diluir el tratamiento enzimático, y centrifugar los tubos a 200 veces g durante cuatro minutos. Desechar el sobrenadante, lavar las células con 10 mililitros de N-2 medio, y repetir la centrifugación.Retire el sobrenadante de cada tubo y resuspendir los pellets celulares del VZ y DG en dos mililitros y un mililitro del medio B-27, respectivamente. Filtre cada suspensión celular con un colador celular de 40 micrómetros para eliminar cualquier tejido no digerido. Cultivo de las células filtradas en una placa de 24 pozos de unión ultrabajo, utilizando dos pozos para el VZ y uno bien para la DG. Añadir 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento de fibroblastos 2, y 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico a cada pozo, luego incubar la placa a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono y alta humedad durante 48 horas.Después de la incubación, eliminar la mitad del medio de cultivo y reemplazarlo por B-27 medio fresco, complementado con dobles concentraciones de los factores de crecimiento. Repita este proceso cada tercer día. En los días en que no es necesario cambiar el medio de cultivo, añadir factores de crecimiento a una concentración final de 1X.Las neuroesferas se formaron a partir de las células madre neurales aisladas de la zona subventricular y el giro dentuado de los voles de las praderas adultas femeninas y masculinas. Aunque había escombros en el cultivo primario, sólo las neuroesferas estaban presentes después del primer pasaje. Se obtuvo un mayor número de neuroesferas de la zona subventricular femenina que de la zona subventricular masculina, o el giro dentado tanto de mujeres como de hombres, lo que sugiere que el número de neuroesferas obtenidas depende de la zona proliferativa y del sexo vole.El diámetro de las neuroesferas se midió en los días 8, 11 y 14. Aumentó progresivamente para los voles masculinos y femeninos en ambas regiones neuronales, pero las neuroesferas derivadas de los cerebros masculinos eran más pequeñas en comparación con las derivadas de los cerebros femeninos. Las neuroesferas adheridas se caracterizaron en el día seis en presencia de factores de crecimiento, o en el día 15 sin factores de crecimiento.En el sexto día, en condiciones indiferenciadas, las células derivadas de la neurosfera expresaron Nestin, un marcador para los progenitores neuronales. También fue posible identificar las células doblecortina-positivas y el marcador de proliferación Ki-67, que indican la presencia de precursores neuronales o neuronas inmaduras. Sin embargo, la falta de colocación de Ki-67 con DCX sugirió la presencia de neuroblastos postmitéticos.En el día 15, en condiciones de diferenciación, se encontraron neuronas maduras y células con el fenotipo glial, demostrando el potencial de diferenciación de las células aisladas. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que ser capaz de reconocer y tener práctica previa en la microdisección es fundamental para aislar sólo las células de los nichos neurogénicos. Siguiendo este protocolo, se pueden diseñar experimentos para identificar mecanismos implicados en la proliferación, diferenciación y supervivencia del tallo neural y las células progenitoras, procesos que aún se desconocen en la pradera vole.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Cultura organotípicos de espesor completo Retina adulto porcino

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor derivado de sistema de cultivo de oligodendrocitos de cerebro fetal humano

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparación de las neuronas entéricas aisladas y células gliales del plexo mientérico del ratón adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Un ratón, dos culturas: Aislamiento y cultivo de adultos Neural las células madre de las dos zonas neurogénicos de ratones individuales

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-reprogramación de células derivadas de pericitos del cerebro humano adulto en neuronas inducidas

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Aislamiento y cultivo de células madre adultas neural de la Zona subcallosal Ratón

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Un simple de un solo paso para la disección Protocolo Todo el montaje Preparación de adulto<em&gt; Drosophila</emLos cerebros&gt;

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Sencilla generación de una cultura de alto rendimiento de las neuronas inducidas de fibroblastos de piel humana adulta

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generación de neuroesferas a partir de neuronas de hipocampo primario mixto y cortical esinas aisladas del e14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...