Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Denna forskning stöddes av bidrag CONACYT 252756 och 253631; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 och IN203518; INPER 2018-1-163, och NIH P51OD11132. Vi tackar Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris och Susana Castro för deras utmärkta tekniska bistånd.

Studien har godkänts av forskningsetiska kommittén vid Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Mexiko och Instituto Nacional de Perinatologia (2018-1-163). Djurens reproduktion, vård och humana effektmått fastställdes efter den officiella mexikanska standarden (NOM-062-Z00-1999) baserat på "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Allmän hälsolag för hälsoforskning) i den mexikanska Hälsohemligheten.
1. Lösningar och lager för...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Ett stadium för att få en neural stamcellskultur är matsmältningsperioden med den enzymatiska lösningen, som inte bör överstiga mer än 30 min eftersom det kan minska cellens livskraft. Neurosfärerna bör dyka upp vid 8-10 dagar efter den inledande kulturen; om de inte dyker upp dag 12, kasserar du kulturen och upprepar experimentet, vilket minskar rötningsperioden. En annan fråga är blodkärlen som täcker hjärnvävnaden. De bör avlägsnas helt under dissekering eftersom överskottet av erytrocyter kan stö...

Präriesork (Microtus ochrogaster), en medlem av familjen Cricetidae, är ett litet däggdjur vars livsstrategi utvecklas som en socialt monogam och mycket sällskaplig art. Både hanar och honor etablera en varaktig par band efter parning eller långa perioder av samlevnad kännetecknas av att dela boet, försvara sitt territorium, och visar biparental vård för sin avkomma1,2,3,4. Således är prärien sork en värdefull modell för att förstå den neurobiologiska grunden för socio-sexuellt beteende och funktionsnedsättningar i social kognition5.
Vuxen neurogenes är en av de mest paramount bearbetar av neural plasticity som leder till beteendeförändringar. Till exempel rapporterade vår forskargrupp i manliga sorkar att social samlevnad med parning ökad cellproliferation i subventricular zonen (VZ) och subgranular zon i dentate gyrus (DG) av hippocampus, vilket tyder på att vuxna neurogenes kan spela en roll i bildandet av par bindning framkallas genom parning i präriesorkar (opublicerade data). Å andra sidan, även om hjärnan regioner där nya nervceller genereras och integreras är väl kända, de molekylära och cellulära mekanismer som deltar i dessa processer förblir obestämd på grund av tekniska nackdelar i hela hjärnan modell6. Till exempel, signalvägarna som styr genuttryck och andra cellulära aktiviteter har en relativt kort aktiveringsperiod (detektion av fosphoproteome)7. En alternativ modell är isolerade och odlade vuxna neurala stamceller eller stamceller för att klarlägga molekylära komponenter som är involverade i vuxna neurogenes.
Den första metoden för att upprätthålla in vitro neurala prekursorer från vuxna däggdjur (mus) hjärnan var analysen av neurosfärer, som är cellulära aggregat växer under icke-anhängare villkor som bevarar deras multipotenta potential att generera nervceller, samt astrocyter8,9,10. Under deras utveckling finns det en urvalsprocess där endast prekursorerna kommer att svara på mitogener som Epidermal Growth Factor (EGF) och Fibroblast Growth Factor 2 (FGF2) för att föröka och generera neurosfärer8,9,10.
Vår kunskap, är inget protokoll rapporteras i litteraturen för att erhålla vuxna neurala stamceller från prärien sorkar. Här etablerade vi kultur villkor för att isolera neuronal progenitors från neurogenic nischer och deras in vitro-underhåll genom neurosfären bildandet assay. Således kan experiment utformas för att identifiera de molekylära och cellulära mekanismer som är involverade i proliferation, migration, differentiering och överlevnad av de neurala stamceller och progenitors, processer som fortfarande är okända i prärien sork. Dessutom kan belysa in vitro-skillnader i egenskaperna hos de celler som härrör från VZ och GD ge information om den roll som neurogena nischer i neural plasticitet i samband med förändringar i socio-sexuellt beteende och kognitiva beteenden, och underskott i sociala interaktioner (autismspektrumstörning och schizofreni), som också kan vara sexberoende.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Neurosfärer är primära cellaggregat som omfattar neurala stamceller och stamceller. Dessa 3D-strukturer är ett utmärkt verktyg för att bestämma differentiering och spridning potential neurala stamceller, samt att generera cellinjer än vad som kan analyseras över tiden. Också, neurospheres kan skapa en nisch (in vitro) som gör att modellering av den dynamiska föränderliga miljön, såsom varierande tillväxtfaktorer, hormoner, signalsubstanser, bland annat. Microtus ochrogaster (präriesork) är en unik modell för att förstå den neurobiologiska grunden för socio-sexuella beteenden och social kognition. Men de cellulära mekanismer som är inblandade i dessa beteenden är inte väl kända. Protokollet syftar till att få neurala stamceller från de neurogena nischerna hos den vuxna präriensork, som odlas under icke-vidhäftande tillstånd, för att generera neurosfärer. Storleken och antalet neurosfärer beror på regionen (subventricular zon eller dentate gyrus) och kön av prärien sork. Denna metod är ett anmärkningsvärt verktyg för att studera könsberoende skillnader i neurogena nischer in vitro och de neuroplasticitetsförändringar som är associerade med sociala beteenden som parbindning och biparental vård. Också, kognitiva tillstånd som medför underskott i sociala interaktioner (autismspektrumstörningar och schizofreni) skulle kunna undersökas.

Neurospheres bildades från neurala stamceller isolerade från VZ och GD av både kvinnliga och manliga vuxna prärien sorkar. Omkring 8-10 dagar efter att ha startat kulturen, celler borde ha bildat neurosfärer. Observera att plattan kan innehålla skräp i primärkulturen (Bild 3A). Men i passage 1 bör kulturen endast bestå av neurosfärer (Figur 3B).
Ett högre antal neurosfärer erhölls från den kvinnliga VZ som jämfört med...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Vi etablerade villkoren för att odla neurala stamceller från subventricular zonen och dentate gyrus av den vuxna hjärnan av präriesorkar, som en kompletterande in vitro-studie, att analysera de könsberoende skillnaderna mellan neurogena nischer som skulle kunna vara en del av funktionella plast förändringar i samband med sociala beteenden.

Kultur av neurosfärer som härrör från neurogena nischer i Adult Prairie Voles

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Denna metod kan bidra till att undersöka könsberoende skillnader i de neurogena nischerna, och för att förstå deras neuroplasticitet, förändringar som understryker sociala interaktioner i präriensork. Analysen av neurospheres är ett utmärkt verktyg för att bestämma spridning och differentiering potential neurala stam och stamceller. Till att börja med placera en petriskål på en yta omgiven av is.Deponera hjärnan på skålen och tillsätt 20 milliliter kalltvätt lösning. I koronaplanet, dela upp hjärnan i två block av vävnad med hjälp av en skalpell, utför snittet på bregma nivå i den främre-bakre axeln. Extrahera subventrikulär zon, eller VZ, vävnad från rostrala blocket, och dentate gyrus, eller DG, vävnad från caudal blocket.För att dissekera VZ, håll en av halvkloten med en Dumont-tämpningar och sätt in de fina spetsarna på en andra tlysna under vävnaden som linjer caudatus-putamen. Öppna tången längs rygg-ventrala axeln för att separera vävnaden, och samla in VZ i ett centrifugrör med två milliliter kalltvättlösning. Poola inte vävnaden hos mer än två djur.Upprepa mikrodissektionen på den andra hemisfären och förvara röret med vävnaden på is. För att dissekera DG, använd en skalpell för att göra en koronal skuren i caudal blocket, för att få två skivor där hippocampus formation observeras. Använd Dumont-forceps för att hålla en av skivorna, och gör ett horisontellt snitt mellan GD och CA1 med en annan tövrövor.Gör sedan ett vertikalt snitt mellan GD och CA3, för att separera generaldirektoratet. Upprepa dissektionen i den andra hjärnhalvan i den första skivan, sedan i båda halvkloten i den andra segmentet. Samla de fyra DG bitar av varje sork i en centrifug röret. Placera centrifugrören inuti biosäkerhetsskåpet och vänta cirka 10 minuter på att vävnadsfragmenten ska fällas ut av tyngdkraften.Ta sedan bort tvättlösningen och tillsätt en milliliter varm enzymatisk lösning på varje rör. Inkubera rören i 37 grader i 10 minuter. För att upplösa vävnadsfragmenten, pipettera dem upp och ner med en milliliter spets, men pipett inte mer än 30 gånger.Upprepa inkubationen vid 37 grader Celsius, sedan pipettera vävnaden igen. Tillsätt nio milliliter N-2 medium till varje rör för att späda ut den enzymatiska behandlingen, och centrifugera rören vid 200 gånger g i fyra minuter. Kassera supernatanten, tvätta cellerna med 10 milliliter av N-2 medium och upprepa centrifugeringen.Ta bort supernatanten från varje rör, och återanvänd cellpelletsen i VZ och GD i två milliliter respektive en milliliter av B-27-mediet. Filtrera varje cell suspension med en 40 mikrometer cell sil för att avlägsna eventuella icke-smält vävnad. Odla de filtrerade cellerna i en ultralåg fastsättning 24-brunnsplatta, med hjälp av två brunnar för VZ och en brunn för GD. Tillsätt 20 nanogram per milliliter fibroblast tillväxtfaktor 2, och 20 nanogram per milliliter epidermal tillväxtfaktor till varje brunn, sedan inkubera plattan på 37 grader Celsius, 5% koldioxid och hög luftfuktighet i 48 timmar.Efter inkubationen, ta bort hälften av odlingsmediet och ersätta det med färskt B-27 medium, kompletterat med dubbla koncentrationer av tillväxtfaktorerna. Upprepa denna process var tredje dag. På dagar då det inte är nödvändigt att ändra odlingsmediet, lägg till tillväxtfaktorer till en slutlig koncentration av 1X.Neurospheres bildades från de neurala stamcellerna isolerade från subventricular zonen och dentate gyrus av både kvinnliga och manliga vuxna prärien sorkar. Även om det fanns skräp i den primära kulturen, var endast neurospheres närvarande efter den första passagen. Ett högre antal neurospheres erhölls från den kvinnliga subventricular zonen än från den manliga subventricular zonen, eller dentate gyrus av både honor och hanar, vilket tyder på att antalet neurospheres erhållits beror på proliferative zonen och vole kön.Diametern på neurospheres mättes på dag 8, 11 och 14. Det ökade successivt för manliga och kvinnliga sorkar i båda neuronala regioner, men neurosfärer som härrör från de manliga hjärnorna var mindre i jämförelse med de som härrör från de kvinnliga hjärnorna. Adhered neurospheres kännetecknades på dag sex i närvaro av tillväxtfaktorer, eller på dag 15 utan tillväxtfaktorer.Vid dag sex, under odifferentierade förhållanden, uttryckte de neurosfär-härledda cellerna Nestin, en markör för neurala föregångare. Det var också möjligt att identifiera doublecortin-positiva celler och spridningsmarkören Ki-67, som indikerar förekomsten av antingen neuronala prekursorer eller omogna nervceller. Men föreslog bristen på colocalization av Ki-67 med DCX förekomsten av post-mitotic neuroblaster.Vid dag 15, under differentiering villkor, mogna nervceller och celler med den stödjeceller fenotyp hittades, visar differentiering potential av de isolerade cellerna. När du försöker detta protokoll, tänk på att kunna känna igen och ha tidigare praxis i mikrodissektion är grundläggande för att isolera endast celler från de neurogena nischer. Efter detta protokoll kan experiment utformas för att identifiera mekanismer som är involverade i proliferation, differentiering och överlevnad av neurala stam- och progenitorceller, processer som fortfarande är okända i präriensork.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Organotypic Kultur av full tjocklek vuxna svin Retina

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

Progenitor-härledda oligodendrocyt Kultur System från human fetal hjärna

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Ett<em&gt; In-vitro</em&gt; Beredning av isolerade Enteriska neuroner och glia från plexus myentericus av vuxen mus

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

En mus, två kulturer: isolering och odling av vuxna neurala stamceller från de två neurogen zoner Individuell möss

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Lineage-omprogrammering av Pericyte-härledda celler i den vuxna mänskliga hjärnan i inducerade Nervceller

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Isolering och kultur av vuxna neurala stamceller från mus Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

En enkel steg Dissection protokoll för hel-mount Framställning av Adult<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

Enkla Generation av en hög avkastning kultur av inducerade nervceller från mänsklig vuxen hud fibroblaster

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Generering av Neurosfärer från blandade primära hippocampal och kortikala neuroner isolerade från E14-E16 Sprague Dawley Rat embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...