Name: culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles
Uploaded: 2020-06-10T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Bu araştırma CONACYT 252756 ve 253631 hibeler tarafından desteklenmiştir; UNAM-DGAPA-PAPIIT IN202818 ve IN203518; INPER 2018-1-163 ve NIH P51OD11132. Deisy Gasca, Carlos Lozano, Martín García, Alejandra Castilla, Nidia Hernandez, Jessica Norris ve Susana Castro'ya mükemmel teknik yardımları için teşekkür ederiz.

Çalışma Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, Meksika ve Instituto Nacional de Perinatologia Araştırma Etik Komitesi (2018-1-163) tarafından onaylanmıştır. Hayvanların üreme, bakım ve insancıl uç noktaları Resmi Meksika Standardı (NOM-062-Z00-1999) "Ley General de Salud en Materia de Investigación para la Salud" (Sağlık Araştırma Genel Sağlık Yasası) Meksika Sağlık Secretaria of Sait dayalı aşağıdaki kurulmuştur.
1. Çözümler ve ...

<ol>
	<li>Portillo, W., Paredes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motivational+Drive+in+Non-copulating+and+Socially+Monogamous+Mammals.">Motivational Drive in Non-copulating and Socially Monogamous Mammals.</a> Frontiers Behavioral Neuroscience. 13, 238 (2019).</li><li>Walum, H., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+mechanisms+and+circuitry+of+the+pair+bond.">The neural mechanisms and circuitry of the pair bond.</a> Nature Reviews Neurosciences. 19 (11), 643-654 (2018).</li><li>Gobrogge, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex,+drugs,+and+violence:+neuromodulation+of+attachment+and+conflict+in+voles.">Sex, drugs, and violence: neuromodulation of attachment and conflict in voles.</a> Current Topics Behavioral Neurosciences. 17, 229-264 (2014).</li><li>Perkeybile, A. M., Bales, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergenerational+transmission+of+sociality:+the+role+of+parents+in+shaping+social+behavior+in+monogamous+and+non-monogamous+species.">Intergenerational transmission of sociality: the role of parents in shaping social behavior in monogamous and non-monogamous species.</a> Journal of Experimental Biology. 220, 114-123 (2017).</li><li>McGraw, L. A., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prairie+vole:+an+emerging+model+organism+for+understanding+the+social+brain.">The prairie vole: an emerging model organism for understanding the social brain.</a> Trends in Neuroscience. 33 (2), 103-109 (2010).</li><li>Fowler, C. D., Liu, Y., Ouimet, C., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+social+environment+on+adult+neurogenesis+in+the+female+prairie+vole.">The effects of social environment on adult neurogenesis in the female prairie vole.</a> Journal of Neurobiology. 51 (2), 115-128 (2002).</li><li>Yang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omic+Profiling+Reveals+Dynamics+of+the+Phased+Progression+of+Pluripotency.">Multi-omic Profiling Reveals Dynamics of the Phased Progression of Pluripotency.</a> Cell Systems. 8 (5), 427-445 (2019).</li><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system.">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li><li>Gritti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipotential+stem+cells+from+the+adult+mouse+brain+proliferate+and+self-renew+in+response+to+basic+fibroblast+growth+factor.">Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor.</a> Journal of Neurosciences. 16 (3), 1091-1100 (1996).</li><li>Ostenfeld, T., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+neurogenesis+to+proceed+through+the+division+of+neuronal+progenitors+following+differentiation+of+epidermal+growth+factor+and+fibroblast+growth+factor-2-responsive+human+neural+stem+cells.">Requirement for neurogenesis to proceed through the division of neuronal progenitors following differentiation of epidermal growth factor and fibroblast growth factor-2-responsive human neural stem cells.</a> Stem Cells. 22 (5), 798-811 (2004).</li><li>Paxinos, G., Keith, B. J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. , (2001).</li><li>Conti, L., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+stem+cell+systems:+physiological+players+or+in+vitro+entities.">Neural stem cell systems: physiological players or in vitro entities.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (3), 176-187 (2010).</li><li>Lieberwirth, C., Liu, Y., Jia, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Social+isolation+impairs+adult+neurogenesis+in+the+limbic+system+and+alters+behaviors+in+female+prairie+voles.">Social isolation impairs adult neurogenesis in the limbic system and alters behaviors in female prairie voles.</a> Hormones and Behavior. 62 (4), 357-366 (2012).</li><li>Ruscio, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pup+exposure+elicits+hippocampal+cell+proliferation+in+the+prairie+vole.">Pup exposure elicits hippocampal cell proliferation in the prairie vole.</a> Behavioral Brain Research. 187 (1), 9-16 (2008).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li><li>Eack, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commonalities+in+social+and+non-social+cognitive+impairments+in+adults+with+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Commonalities in social and non-social cognitive impairments in adults with autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Schizophrenia Research. 148 (1-3), 24-28 (2013).</li><li>Pinkham, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+comparison+of+social+cognitive+performance+in+autism+spectrum+disorder+and+schizophrenia.">Comprehensive comparison of social cognitive performance in autism spectrum disorder and schizophrenia.</a> Psychological Medicine. , 1-9 (2019).</li><li>Yirmiya, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+arginine+vasopressin+1a+receptor+(AVPR1a)+gene+and+autism+in+a+family-based+study:+mediation+by+socialization+skills.">Association between the arginine vasopressin 1a receptor (AVPR1a) gene and autism in a family-based study: mediation by socialization skills.</a> Molecular Psychiatry. 11 (5), 488-494 (2006).</li><li>Montag, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxytocin+and+oxytocin+receptor+gene+polymorphisms+and+risk+for+schizophrenia:+a+case-control+study.">Oxytocin and oxytocin receptor gene polymorphisms and risk for schizophrenia: a case-control study.</a> The World Journal of Biological Psychiatry. 14 (7), 500-508 (2013).</li><li>Harony, H., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+contribution+of+oxytocin+and+vasopressin+to+mammalian+social+behavior:+potential+role+in+autism+spectrum+disorder.">The contribution of oxytocin and vasopressin to mammalian social behavior: potential role in autism spectrum disorder.</a> Neurosignals. 18 (2), 82-97 (2010).</li><li>Bachner-Melman, R., Ebstein, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+oxytocin+and+vasopressin+in+emotional+and+social+behaviors.">The role of oxytocin and vasopressin in emotional and social behaviors.</a> Handbook of Clinical Neurology. 124, 53-68 (2014).</li><li>Wegiel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuropathology+of+autism:+defects+of+neurogenesis+and+neuronal+migration,+and+dysplastic+changes.">The neuropathology of autism: defects of neurogenesis and neuronal migration, and dysplastic changes.</a> Acta Neuropathologica. 119 (6), 755-770 (2010).</li><li>Kaushik, G., Zarbalis, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatal+Neurogenesis+in+Autism+Spectrum+Disorders.">Prenatal Neurogenesis in Autism Spectrum Disorders.</a> Frontiers in Chemistry. 4, 12 (2016).</li><li>Sheu, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Critical+Period+for+the+Development+of+Schizophrenia-Like+Pathology+by+Aberrant+Postnatal+Neurogenesis.">A Critical Period for the Development of Schizophrenia-Like Pathology by Aberrant Postnatal Neurogenesis.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 635 (2019).</li><li>Donaldson, Z. R., Young, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+contribution+of+proximal+5'+flanking+sequence+and+microsatellite+variation+on+brain+vasopressin+1a+receptor+(Avpr1a)+gene+expression+and+behavior.">The relative contribution of proximal 5' flanking sequence and microsatellite variation on brain vasopressin 1a receptor (Avpr1a) gene expression and behavior.</a> PLoS Genetics. 9 (8), 1003729 (2013).</li><li>Rice, M. A., Hobbs, L. E., Wallace, K. J., Ophir, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryptic+sexual+dimorphism+in+spatial+memory+and+hippocampal+oxytocin+receptors+in+prairie+voles+(Microtus+ochrogaster).">Cryptic sexual dimorphism in spatial memory and hippocampal oxytocin receptors in prairie voles (Microtus ochrogaster).</a> Hormones and Behavior. 95, 94-102 (2017).</li></ol>

Bir sinir kök hücre kültürü elde etmek için bir aşama enzimatik çözelti ile sindirim dönemi, hangi hücre canlılığını azaltabilir çünkü 30 dakikadan fazla olmamalıdır. Nörosferler ilk kültürden 8-10 gün sonra ortaya çıkmalıdır; 12. güne kadar ortaya çıkmazlarsa, kültürü atın ve deneyi tekrarlayın, sindirim süresini kısaltın. Başka bir sorun beyin dokusunu kaplayan kan damarları. Eritrositlerin aşırı nörosfer oluşumunu engelleyebilir, çünkü onlar tamamen diseksiyon sırası...

Çayır sıçanı(Microtus ochrogaster),Cricetidae familyasından, sosyal olarak tek eşli ve son derece sosyal bir tür olarak gelişen küçük bir memeli türüdür. Hem erkek hem de dişiler çiftleşme veya yuva paylaşımı ile karakterize birlikte yaşama uzun süre sonra kalıcı bir çift bağ kurmak, kendi toprakları savunmak, ve kendi döl leri için biebeveyn bakım gösteren1,2,3,4. Böylece, çayır sıçanı sosyo-cinsel davranış ve sosyal biliş bozuklukları nın nörobiyolojik temelini anlamak için değerli bir modeldir5.
Erişkin nörogenez, davranış değişikliklerine yol açan nöral plastisitenin en önemli süreçlerinden biridir. Örneğin, araştırma grubumuz erkek volelerde hipokampusun subventriküler zonu (VZ) ve subgranular bölgede hücre çoğalmasının arttığını bildirmiş, bu da yetişkin nörogenezinin çayır voles (yayınlanmamış veriler) çiftleşme ile indüklenen çift bağ oluşumunda rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Öte yandan, yeni nöronların üretildiği ve entegre edildiği beyin bölgeleri iyi bilinmesine rağmen, bu süreçlerde yer alan moleküler ve hücresel mekanizmalar tüm beyin modeli6'dakiteknik sakıncalar nedeniyle belirsizliğini korumaktadır. Örneğin, gen ekspresyonu ve diğer hücresel faaliyetleri kontrol eden sinyal yolları nispeten kısa bir aktivasyon süresine sahiptir (fosfoproteom saptanması)7. Bir alternatif model izole ve yetişkin nörogenezi dahil moleküler bileşenleri açıklamak için yetişkin nöral kök hücreleri veya ata hücreleri kültürlü.
Yetişkin memeli in vitro nöral öncülleri korumak için ilk yaklaşım (fare) beyin nörosferlerin analizi oldu, hangi hücresel agregalar nöronlar oluşturmak için onların çok güçlü potansiyelini korumak non-yapışık koşullar altında büyüyen olan, yanı sıra astrositler8,9,10. Gelişimleri sırasında, sadece öncüllerin Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) ve Fibroblast Büyüme Faktörü 2 (FGF2) gibi mitojenlere yanıt verecekleri birseçim süreci vardır.
Bilgimiz dahilinde, literatürde bozkır farelerinden yetişkin nöral atalar elde etmek için bir protokol bildirilmemiştir. Burada, nöronal ataları nörojenik nişlerden ve bunların in vitro bakımlarından nörosfer formasyonu analizi ile izole etmek için kültür koşullarını oluşturduk. Böylece, deneyler nöral kök hücrelerin ve atalarının çoğalması, göçü, farklılaşması ve hayatta kalması, çayır faresinde hala bilinmeyen süreçler de dahil olmak üzere moleküler ve hücresel mekanizmaları belirlemek üzere tasarlanabilir. Ayrıca, VZ ve DG türetilen hücrelerin özellikleri in vitro farklılıkları açıklığa kavuşturan sosyo-cinsel davranış ve bilişsel davranışlardeğişiklikleri ile ilişkili nöral plastisite nörojenik nişler rolü hakkında bilgi sağlayabilir, ve sosyal etkileşimlerde açıkları (otizm spektrum bozukluğu ve şizofreni), aynı zamanda cinsiyete bağımlı olabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Antibody ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Nestin</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX30671</td>
			<td>RRID:AB_625325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Doublecortin</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>AB2253</td>
			<td>RRID:AB_1586992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki67</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66155</td>
			<td>RRID:AB_1140752</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX50810</td>
			<td>RRID:AB_11170769</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G3893</td>
			<td>RRID:AB_477010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11029</td>
			<td>RRID:AB_2534088</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 568</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11036</td>
			<td>RRID:AB_10563566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Guinea Pig Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11073</td>
			<td>RRID:AB_2534117</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase, Type IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17104019</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17105041</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12, HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>11330032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Cell Culture Grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 supplement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>17502048</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NAHCO3</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>Powder, Suitable for Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>10010023</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine hydrobromide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3655</td>
			<td>Powder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human FGF-basic</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific/Gibco</td>
			<td>A1110501</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Corning/Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Corning/Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431118</td>
			<td>PES membrane, 45 mm diameter neck</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic Sterile Centrifuge Tube</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td>with conical bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Pyrogenic sterile tips of 1,000 &#181;l, 200 &#181;l and 10 &#181;l.</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton gauzes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile microcentrifuge tubes of 1.5 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes of 5, 10 and 25 mL</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile surgical gloves</td>
			<td>any brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filters, 0.22 &#181;m pore</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>SLGPR33RB</td>
			<td>Polyethersulfone (PES) membrane, 33 mm diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and surgical instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized Pipet Filler/Dispenser</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel Blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless-steel Spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture of neurospheres derived from the neurogenic niches in adult prairie voles

Nörosferler nöral kök hücreleri ve progenitor hücreleri oluşturan birincil hücre agregalarıdır. Bu 3D yapılar, nöral kök hücrelerin farklılaşma ve çoğalma potansiyelini belirlemek ve zaman içinde tahmin edilenegöre hücre hatları oluşturmak için mükemmel bir araçtır. Ayrıca, nörosferler bir niş oluşturabilirsiniz (in vitro) dinamik değişen ortamın modelleme sağlayan, bu tür değişen büyüme faktörleri gibi, hormonlar, nörotransmitterler, diğerleri arasında. Microtus ochrogaster (çayır sıçanı) sosyo-cinsel davranışlar ve sosyal biliş nörobiyolojik temelini anlamak için benzersiz bir modeldir. Ancak, bu davranışlarda yer alan hücresel mekanizmalar iyi bilinmemektedir. Protokol, nörosfer ler üretmek için, yapışık olmayan koşullar altında kültüre giren yetişkin çayır sıçanının nörojenik nişlerinden nöral progenitor hücreleri elde etmeyi amaçlıyor. Nörosferlerin büyüklüğü ve sayısı bölgeye (subventriküler bölge veya dentat girus) ve çayır sıçanının cinsiyetine bağlıdır. Bu yöntem, in vitro nörojenik nişlerde cinsiyete bağlı farklılıkları ve çift bağ ve çift ebeveyn bakımı gibi sosyal davranışlarla ilişkili nöroplastisite değişikliklerini incelemek için dikkate değer bir araçtır. Ayrıca, sosyal etkileşimlerde (otizm spektrum bozuklukları ve şizofreni) açıkları gerektiren bilişsel koşullar incelenebilir.

Nörosferler hem dişi hem de erkek erişkin çayır sıçanlarının VZ ve DG'sinden izole edilen nöral kök hücrelerden oluşmuştur. Kültüre başladıktan yaklaşık 8-10 gün sonra hücreler nörosferleri oluşturmuş olmalıdır. Plakanın birincil kültürde enkaz içerebileceğini unutmayın(Şekil 3A). Ancak, paragraf 1'de kültür sadece nörosferlerden oluşmalıdır (Şekil 3B).
Kadın VZ'den hem dişilerin hem de erkek...

Watch this Scientific Journal Video about Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles at JoVE.com

Culture of Neurospheres Derived from the Neurogenic Niches in Adult Prairie Voles

Sosyal davranışlarla ilişkili fonksiyonel plastik değişikliklerin bir parçası olabilecek nörojenik nişler arasındaki cinsiyete bağımlı farklılıkları analiz etmek için, subventriküler bölgeden nöral progenitor hücrelerini kültüraltına alma ve çayır volelerinin yetişkin beyninin dentat giruslarını tamamlayıcı bir in vitro çalışma olarak belirledik.

Yetişkin Çayır Voles Nörojenik Nişler Türetilmiş Nörosferkültürü

Neurospheres are primary cell aggregates that comprise neural stem cells and progenitor cells. These 3D structures are an excellent tool to determine the ...

Bu yöntem nörojenik nişlerde cinsiyete bağlı farklılıkları araştırmak için yardımcı olabilir, ve onların nöroplastisite anlamak için, çayır vole sosyal etkileşimleri vurgulamak değişiklikler. Nörosferlerin tsay nöral kök ve progenitor hücrelerinin çoğalma ve farklılaşma potansiyelini belirlemek için mükemmel bir araçtır. Başlamak için, buz la çevrili bir yüzeye bir Petri kabı yerleştirin.Çanak üzerinde beyin mevduat ve soğuk yıkama çözeltisi 20 mililitre ekleyin. Koronal düzlemde, ön-posterior ekseninde bregma düzeyinde kesme gerçekleştiren, bir neşter kullanarak doku iki blok halinde beyin bölün. Subventriküler zonu veya VZ, rostral blok doku ayıklayın ve dentat girus, ya da DG, kaudal blok doku.VZ incelemek için, bir Dumont forceps ile yarımkürede birini tutun, ve kaudate-putamen hatları doku altında ikinci bir forceps ince uçlarını yerleştirin. Dokuyu ayırmak için dorsal-ventral eksen boyunca forsepsleri açın ve VZ'yi iki mililitre soğuk yıkama çözeltisi içeren bir santrifüj tüpüne toplayın. İkiden fazla hayvanın dokusunu birleştirmeyin.Diğer yarımküredeki mikrodiseksiyonu tekrarlayın ve tüpü dokuyla buz üzerinde saklayın. DG incelemek için, bir koronak kesim kaudal blok yapmak için bir neşter kullanın, hangi hipokampal oluşumu gözlenen iki dilim elde etmek için. Dilimlerden birini tutmak için Dumont forceps'u kullanın ve DG ve CA1 arasında başka bir çeliş lekesi ile yatay bir kesim yapın.Daha sonra, DG ve CA3 arasında dikey bir kesi yapmak, DG ayırmak için. İlk dilimin diğer yarımküresinde diseksiyonu, ikinci dilimin her iki yarımküresinde tekrarlayın. Bir santrifüj tüp her vole dört DG parçaları toplamak. Santrifüj tüplerini biyogüvenlik kabininin içine yerleştirin ve doku parçalarının yer çekimine göre çökeltmesini yaklaşık 10 dakika bekleyin.Daha sonra, yıkama çözeltisini çıkarın ve her tüpe bir mililitre sıcak enzimatik çözelti ekleyin. Tüpleri 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Doku parçalarını parçalamak için, pipet bir mililitre ucu ile yukarı ve aşağı, ama daha fazla 30 kez pipet yok.Kuluçkayı 37 santigrat derecede tekrarlayın, sonra dokuyu tekrar pipetleyin. Enzimatik tedaviyi seyreltmek için her tüpe dokuz mililitre N-2 orta ekleyin ve tüpleri 200 kez g'de dört dakika santrifüj edin. Supernatant atın, N-2 orta 10 mililitre ile hücreleri yıkayın ve santrifüj tekrarlayın.Her tüpten supernatant çıkarın ve iki mililitre ve B-27 orta bir mililitre VZ ve DG hücre pelet leri resuspend, sırasıyla. Sindirilmemiş dokuları çıkarmak için her hücre süspansiyonuna 40 mikrometrelik bir süzgeç uygulayın. Kültür vz için iki kuyu ve DG için bir kuyu kullanarak, ultra-düşük eki 24-iyi plaka filtrelenmiş hücreleri. Fibroblast büyüme faktörü 2 mililitre başına 20 nanogram ekleyin, ve epidermal büyüme faktörü mililitre başına 20 nanogram her kuyuya, sonra 37 santigrat derece, 5% karbondioksit ve 48 saat boyunca yüksek nem plaka kuluçka.Kuluçkadan sonra, kültür ortamının yarısını çıkarın ve büyüme faktörlerinin çift konsantrasyonları ile desteklenen taze B-27 ortamı ile değiştirin. Bu işlemi her üç günde bir tekrarlayın. Kültür ortamını değiştirmenin gerekli olmadığı günlerde, büyüme faktörleri 1X'lik son konsantrasyona ekleyin.Nörosferler subventriküler bölgeden izole edilen nöral kök hücrelerden ve hem dişi hem de erkek erişkin çayır sıçanlarının dentat girusundan oluşmuştur. Birincil kültürde enkaz olmasına rağmen, ilk geçişten sonra sadece nörosferler mevcuttu. Kadın subventriküler bölgesinden erkek subventriküler zonundan veya hem dişilerin hem de erkeklerin dentat girusundan daha fazla sayıda nörosfer elde edilebilmektedir, bu da elde edilen nörokürelerin sayısının proliferatif bölgeye ve vole cinsiyetine bağlı olduğunu düşündürmektedir.Nörosferlerin çapı 8, 11 ve 14. Her iki nöronal bölgede de erkek ve dişi sıçanlarda giderek artmış, ancak erkek beyinlerinden elde edilen nörosferler kadın beyinlerinden elde edilenlere göre daha küçüktü. Bağlı nörosferler büyüme faktörlerinin varlığında altıncı günde veya büyüme faktörleri olmadan 15.Altıncı günde, farklılaşmamış koşullar altında, nörosferden türetilmiş hücreler, nöral atalar için bir belirteç olan Nestin'i ifade etti. Ayrıca çift kortin-pozitif hücreleri ve nöronal öncüllerin veya olgunlaşmamış nöronların varlığını gösteren proliferasyon belirteci Ki-67'yi tanımlamak da mümkün oldu. Ancak, DCX ile Ki-67 kolokalizasyon eksikliği post-mitotik nöroblastlar varlığını önerdi.15. günde, farklılaşma koşulları altında, izole hücrelerin farklılaşma potansiyelini gösteren, glial fenotip ile olgun nöronlar ve hücreler bulundu. Bu protokolü denerken, mikrodisze'yi tanıyabilmek ve daha önce uygulamaya sahip olmak nörojenik nişlerden sadece hücreleri izole etmek için temel bir temeldir. Bu protokolü takiben, nöral kök ve ata hücrelerinin çoğalması, farklılaşması ve hayatta kalması, çayır sıçanında hala bilinmeyen süreçler ile ilgili mekanizmaları belirlemek için deneyler tasarlanabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Organotypic Culture of Full-thickness Adult Porcine Retina

Tam kalınlıkta Yetişkin Domuz Retina Organotipik Kültür

There is a recognized demand for in vitro models that can replace or reduce animal experiments. Porcine retina has a similar neuronal structure to human ...

Progenitor-derived Oligodendrocyte Culture System from Human Fetal Brain

İnsan Fetal Beyin gelen Progenitör-türetilmiş Oligodendrosit Kültür Sistemi

Differentiation of human neural progenitors into neuronal and glial cell types offers a model to study and compare molecular regulation of neural cell ...

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Bir<em&gt; In-vitro</emYetişkin Mouse myenterik Pleksus izole edilen enterik Nöronlar ve Glia bir&gt; hazırlanması

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Lineage-reprogramming of Pericyte-derived Cells of the Adult Human Brain into Induced Neurons

Kaynaklı Nöronlar içine Yetişkin İnsan Beyninin perisit türetilmiş Hücreler Lineage yeniden programlama

Direct lineage-reprogramming of non-neuronal cells into induced neurons (iNs) may provide insights into the molecular mechanisms underlying neurogenesis ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Simple Generation of a High Yield Culture of Induced Neurons from Human Adult Skin Fibroblasts

İnsan yetişkin cilt fibroblastlar indüklenen Neurons yüksek verimli kültürünün basit üretimi

Induced neurons (iNs), the product of somatic cells directly converted to neurons, are a way to obtain patient-derived neurons from tissue that is easily ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...