Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (NICHD) F31 HD089693، والمعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية / المركز الوطني للنهوض بالعلوم الترجمية (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 و4UH3ES029073-03، وSessed.000.03 توماس ج. واتكين.
الكتاب يود أن أشكر اريك و. روث لمساعدتهم في المجهر الإلكترون انتقال. وقد استفاد هذا العمل من مرفق BioCryo التابع لمركز جامعة نورث وسترنللعلوم والتكنولوجيات النووية (NUANCE) التابع لجامعة نورث وسترن، الذي تلقى الدعم من الموارد التجريبية لتكنولوجيا النانو (SHyNE) (NSF ECCS-1542205)؛ برنامج MRSEC (NSF DMR-1720139) في مركز أبحاث المواد؛ المعهد الدولي لتكنولوجيا النانو (IIN)؛ وولاية إلينوي، من خلال IIN. كما استخدمت معدات CryoCluster، التي تلقت الدعم من برنامج التصوير بالرنين المغناطيسي (NSF DMR-1229693). تم تصميم الرسومات في الشكل 1 باستخدام BioRender.com.

وقد وافقت على جميع تجارب الماوس لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في جامعة نورث وسترن، وتم تنفيذ جميع الإجراءات بموجب بروتوكولات وافقت عليها اللجنة.
1. إعداد محلول الإنزيمي للتفكك الأنسجة
<ol><li>استخدم حلين انزيميين مختلفين (الحل 1 والحل 2)، وكلاهما تم باستخدام حل م?...

مع الانتهاء من هذا البروتوكول الجيل العضوي، سيكون للمستخدم أربع تقنيات ثقافة مختلفة متاحة لهم لتجميع التشييد الخصية و organoids في أي ECM أو ECM-البيئات الخالية من. الأهم من ذلك، جميع الأساليب الأربع تسمح للباحث لمراقبة غير الغازية التجميع الذاتي organoid مع مرور الوقت من خلال التصوير الفاصل الزمني ...

الخصية هي تقنية رائدة لدراسة تطوير الخصية ، والحيوانات المنوية ، وعلم وظائف الأعضاء في المختبر1،2،3،4. وقد تم استكشاف عدة طرق لتوليد organoid; وتشمل هذه مجموعة متنوعة من المصفوفة خارج الخلية (ECM) وECM- أنظمة الثقافة الخالية، في كل من ثنائي الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) التوجهات. يمكن أن تعزز أساليب التوليد المختلفة استراتيجيات تجميع خلوية متميزة؛ وهذا يؤدي إلى مستوى عال من التباين المورفولوجي والوظيفي بين النماذج العضوية المنشورة. الغرض من هذه المقالة هو مناقشة الحالة الراهنة للنماذج الخصية في المختبر، ولخدمة كنموذج للمحققين في المستقبل، عند تصميم التجارب الخصية. وفي إطار هذه الدراسة، تم تحديد أربعة نماذج مختلفة من نماذج النظم الثقافية وتتميز في العملية التجريبية والنتائج البيولوجية. وتشمل هذه: 2D ECM-Free، 2D ECM، 3D ECM-Free، و 3D ECM الأساليب ثقافة. تهدف الاستراتيجيات المعروضة هنا إلى أن تكون بسيطة وسهلة الاستخدام وقابلة للاستنساخ بشكل كبير بين مختلف المختبرات ومجموعات البحث.
تاريخيا للخصية، وقد استخدمت التسمية "في المختبر"، لعدة طرق مختلفة لثقافة الأنسجة والخلايا الخصية. وتشمل هذه الأنسجة العضوية / أساليب زراعة الجهاز (أي ثقافة explant)5، معزولة ثقافة أنبوب شبهيرول6، ثقافة الخلية الخصية7، وطرق دي نوفو تكوين الأنسجة (أي، وانشاءات البيولوجية والأجهزة)1. وقد أجريت التحقيقات الأولى في الحيوانات المنوية في المختبر قبل ما يقرب من 100 سنة، مع ثقافة الخصية الأرانب explants في 19208، وفي وقت لاحق في عام 1937 مع explants الماوس9. ضمن هذه التجارب الأولية لوحظ spermatogonia إلى حد كبير منحطة عبر الأسبوع الأول من الثقافة، على الرغم من أن بعض الخلايا التفريق meioticly تم تحديدها. تذكرنا هذه التقارير التاريخية، تم إحياء ثقافة explant testis الأمثل في عام 2011 لتصبح تقنية مجدية لدراسة الخصية10. منذ عام 2011، أنتجت ثقافة explant الحيوانات المنوية المختصة الخصوبة في تقارير متعددة11,12,13. ومع ذلك ، بسبب اعتماد ثقافة explant على أنابيب الخصية الأصلية الموجودة مسبقًا ، فإن هذه التطورات الأخيرة توصف بدقة أكبر كأمثلة على وظيفة الخصية "ex vivo" وتولد الحيوانات المنوية ، وظيفة الأنسجة التي تم الحفاظ عليها أو استئنافها عند إزالتها من جسم الكائن الحي. على الرغم من انتشارها في الأدب، على المدى الطويل صيانة الخلايا الجرثومية والتمايز داخل explants الخصية هو التحدي لتكرار14،,15،,16،,17،,18، وخاصة على مدى الأطر الزمنية طويلة بما يكفي لمراقبة كاملة في المختبر الحيوانات المنوية (~ 35 يوما في الفئران19 و 74 في البشر20). ومن المثير للاهتمام أن نقدر أن العديد من التحديات نفسها التي واجهتها قبل 100 سنة، لا تزال من ذوي الخبرة داخل الحيوانات المنوية السابقين vivo اليوم.
مختلفة عن النهج الجسم الحي السابق، والعضوية الخصية هي دي نوفو تجميعها microtissues ولدت تماما في المختبر من مصادر خلوية (أي الخلايا الخصية الأولية). توفر الخصية العضية استراتيجية مبتكرة للتحايل على الاعتماد التاريخي للحقل على الأنسجة المحلية الموجودة من قبل ، واختخيص بيولوجيا الخصية تمامًا في المختبر. هناك متطلبات متعددة مشتركة بين معظم نماذج الأنسجة العضوية; وتشمل هذه (1) في مورفولوجيا الأنسجة vivo-mimetic أو الهندسة المعمارية، (2) أنواع الخلايا الرئيسية المتعددة من الأنسجة الممثلة، (3) التجميع الذاتي أو التنظيم الذاتي في جيلهم، و (4) القدرة على محاكاة مستوى ما من وظيفة الأنسجة الممثلة وعلم وظائف الأعضاء21،,22،,23،,24. بالنسبة للخصيتين ، يمكن التقاط هذا في أربع علامات رئيسية: (1) إدراج أنواع خلايا الخصية الرئيسية ، الجرثومة، Sertoli، Leydig، peritubular، وغيرها من الخلايا الخلالية، (2) خلية موجهة الجمعية الأنسجة، (3) أنواع الخلايا المجزأة بشكل مناسب في مقصورات أنبوبي منفصلة (الجرثومة وSertoli) والمناطق الخلالي (جميع أنواع الخلايا الأخرى)، و (4) درجة ما من وظيفة الأنسجة (على سبيل المثال، إفراز هرمون أو استجابات الأنسجة، والحفاظ على الخلايا الجرثومية والتمايز). وبالنظر إلى التحديات التاريخية في الحفاظ على تمايز الخلايا الجرثومية السابقين في الجسم الحي وفي المختبر، فإن تلخيص في الهياكل الخصية المحنية -المحاكاة (أي الهياكل التي تشبه الأنابيب شبه المنيفيرة) مع علامات إضافية توحي بمحاكاة فسيولوجيا الخصية (على سبيل المثال، وظيفة الغدد الصماء)، هي معالم ذات أولوية نحو توليد الغدد الصماء التي قد تستمر يوماً ما في الحفاظ على تكوين الحيوانات المنوية في المختبر.
غالبية الأساليب العضوية الخصية المنشورة الاستفادة من ECM المتاحة تجاريا (مثل الكولاجين أو تركيبات ECM الملكية)25،26،27 أو ECMs حسب المصدر (أي، الخصيص decellularized الهيدروجين المستمدة من ECM)28،29،30. ECM خارجية يعزز تكوين الأنسجة دي نوفو من خلال توفير سقالة الجمعية داعمة لتوليد الأنسجة. وقد أتاحت أساليب ECM مستوى مثير للإعجاب من تكوين الأنسجة، بما في ذلك بعض وجود الخلايا الجرثومية ومورفولوجيا الأنسجة المحاكاة25،28. ومع ذلك، فإن ECMs التي يستخدمونها ليست متاحة دائماً عالمياً (أي هيدروجيلات مشتقة من ECM غير الخلوية)، وتتطلب بعض الطرق التوجهات المتطورة من الجل والخلايا البذر (مثل تدرجات 3 طبقات من ECM والطباعة ثلاثية الأبعاد)25و31,,و32. سقال طرق خالية (على سبيل المثال، معلقة قطرة ولوحات الثقافة nonadherent)33،34،35 كما ولدت organoids قوية وقابلة للاستنساخ للغاية دون الحاجة إلى المواد الهلامية ECM أو السقالات. ومع ذلك، فإن مورفولوجيا الأنسجة لهذه العضوية الخالية من السقالات غالباً ما تختلف عن الخصيتين الجسمية، ومعظم هذه التقارير تتضمن إضافة كيماوية بيولوجية ECM لتعزيز تكوين الأنسجة33،34،36، أو بدلاً من ذلك ، تعتمد على الطرد المركزي لتجميع الخلايا القسري وضغط34، مما يجعلها أقل مثالية لدراسة الهجرة الموجهة نحو الخلايا والتنظيم الذاتي.
تتضمن أساليب التوليد العضوية الأربعة المعروضة في هذه المخطوطة استراتيجيات مستقلة تعتمد على ECM، كل منها يستخدم البذر الخلوي البسيط الذي يتيح مراقبة التجميع الذاتي العضوي القائم على الخلية. يمكن تنفيذ التقنيات الأربعة جميعها من نفس التعليقات الخلوية أو يمكن أن تستفيد من مجموعات مخصصة ومخصبة من نوع الخلية. قوة هذه الطرق هي القدرة على مراقبة تجميع الأعضاء الذاتية في الوقت الحقيقي ، ومقارنة مباشرة كيف تتجمع الهياكل الخصية ذاتيا بين البيئة المجهرية المختلفة. وينبغي النظر في الاختلافات الظاهرية بين هذه الأساليب الثقافية الأربعة لتأثيرها على السؤال البحثي أو موضوع المحقق. وتنتج كل طريقة التركيبات البيولوجية أو الأعضاء في غضون 24 ساعة أو أقل. في الختام، فإن الأساليب المعروضة هنا توفر مجموعة من تقنيات التجميع العضوي لدراسة تجميع الخصية العضوية، وتطوير الأنسجة، وعلم وظائف الأعضاء الخصية في المختبر.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

توفر الخصية أداة لدراسة تطور الخصية، ونشوء الحيوانات المنوية، والغدد الصماء في المختبر. وقد تم تطوير عدة طرق من أجل خلق الأعضاء الخصية. يعتمد العديد من هذه الطرق على المصفوفة خارج الخلية (ECM) لتعزيز تجميع الأنسجة من جديد ، ومع ذلك ، هناك اختلافات بين الأساليب من حيث مورفولوجيا الأنسجة والوظائف الحيوية. وعلاوة على ذلك، هناك عدد قليل من المقارنات المباشرة بين الأساليب المنشورة. هنا، يتم إجراء مقارنة مباشرة من خلال دراسة الاختلافات في بروتوكولات توليد الأعضاء، مع النتائج المقدمة. أربعة أساليب الجيل الأركيولوجي: (1) 2D ECM خالية، (2) 2D ECM، (3) 3D ECM خالية، و (4) 3D ECM الثقافة هي الموصوفة. واستخدمت ثلاثة معايير أولية لتقييم توليد الخصية العضوية. هذه هي التجميع الذاتي الخلوي ، وإدراج أنواع الخلايا الرئيسية (Sertoli ، Leydig ، والجرثومة ، والخلايا المحيطية) ، والهندسة المعمارية الأنسجة المجزأة بشكل مناسب. من البيئات الأربع التي تم اختبارها، ولدت 2D ECM و 3D ECM-الثقافات organoids مع المورفولوجيا الداخلية الأكثر شبها الخصيتين الأصلية، بما في ذلك تقسيم دي نوفو من أنواع الخلايا الأنبوبية مقابل الخلالي، وتطوير هياكل تشبه الأنابيب، ودالة الغدد الصماء على المدى الطويل المنشأة. استخدمت جميع الأساليب التي تمت دراستها تعليق خلايا الخصية الأولية غير المُنَتَجة واستخدمت موارد الثقافة التي يمكن الوصول إليها بشكل شائع. وتوفر تقنيات توليد الخصية هذه مجموعة أدوات يسهل الوصول إليها ويمكن استنساخها للمبادرات البحثية في تكوين الأعضاء الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.

واعتبر جيل العضوية غير ناجحة إذا لم الخلايا الخصية تجميع الذاتي داخل 72 ساعة من الثقافة، ومع ذلك، جميع الأساليب المعروضة هنا تجميع داخل 24 ساعة عند استخدام خلايا مورين الأحداث (5 ديسيبل). فشل بناء البيولوجية جيل قدم على أنه استمرار للخلايا علقت بحرية (0 عمود ح في الشكل 1)حتى بعد...

Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

هنا، هناك أربع طرق لتوليد الخصية العضوية من خلايا الخصية الخصية الخصية حديثي الولادة الأولية هي وصفها، أي المصفوفة خارج الخلية (ECM) وبيئات الثقافة 2D و 3D الخالية من ECM. هذه التقنيات لها تطبيقات بحثية متعددة ومفيدة بشكل خاص لدراسة تطوير الخصية وعلم وظائف الأعضاء في المختبر.

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

هذه البروتوكولات تمكن المستخدم من إنتاج عدد كبير من الخصية الخصية الوظيفية من الناحية الهيكلية و الغدد الصماء في كل من ECM وبيئات خالية من DCM في ظروف الثقافة 2D أو 3D. وهذه التقنيات قابلة للاستنساخ إلى حد كبير، وسهلة التطبيق على البيئات المختبرية البيولوجية القياسية، ولا تستخدم سوى الأدوات والمواد المشتركة. الخصية organoids هي أداة جديدة لمحاكاة الحيوانات المنوية والغدد الصماء التناسلية في المختبر، ويمكن أن تمكن يوم واحد من دراسة في المختبر gametogenesis.تبدأ عن طريق وضع الماوس القتل الرحيم سوبين على حصيرة تشريح وتعقيم البطن مع 70٪ الإيثانول. خيمة جلد أسفل البطن مع ملقط وفتحه مع مقص. حدد مكان الخصية في المناطق الأربية السفلية اليسرى والأيمنية من البطن وقطع اتصالاتها بأوعية الأوعية وأي أنسجة الضامة الرسو.ثم ارفع الخصيات بأكملها من الحيوان. وضعه في طبق بيتري من BM قبل التوازن. تحت مجهر تشريح، وجعل شق صغير في albuginea tunica على نهاية واحدة من كل الخصية مع مقص تشريح صغير أو عن طريق تمزيق بلطف مع اثنين من ملقط غرامة. أثناء عقد الخصية من الطرف المقابل من الشق ، اضغط عليه بلطف مع ملقط ناعم ودفع في حركة كاسحة نحو الثقب في التونيكا ، والتي ستطلق الأنسجة الخصية كقطعة واحدة متماسكة.قطع الأنسجة إلى قطع أصغر. ضع القطع في ملليلتر واحد من محلول الانفصام قبل الالدفء واحد واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد الحضانة، triturate بلطف قطع الخصيات 50 مرات مع ماصة P1000.تأكد من أن الأنابيب منفصلة عن بعضها البعض وعن الأنسجة الخلالية. إذا بقيت كتل، احتضان لمدة خمس دقائق إضافية و triturate مرة أخرى. إضافة 33 ميكرولترات من محلول الأسهم هيالورونيداز لكل ملليلتر واحد من خليط الانفصام.ثم triturate 50 مرات مع ماصة P1000 واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد الحضانة، اُعيد 50 مرة مع ماصة P200. بعد التأكد من عدم وجود أنابيب مرئية أو كتل من الخلايا ، أطفئ إنزيمات الانفصام عن طريق إضافة FBS إلى 10 ٪ من الحجم الإجمالي للعينة وتاخر عدة مرات مع ماصة P200.الرطب في مركز مصفاة 40 ميكرومتر مع وسائل الإعلام وpirate بعيدا، ثم إضافة العينة إلى مصفاة قبل ترطيب وتصفية لإنتاج تعليق خلية واحدة. الطرد المركزي تعليق في 100 مرة ز لمدة سبع دقائق. تجاهل افرا و resuspend الخلايا في BM الطازجة. عد الخلايا القابلة للحياة على مقياس للهيموسيت باستخدام الاستبعاد الأزرق trypan، ثم إعادة الطرد المركزي وإعادة تعليقها في BM جديدة. بالنسبة للثقافة الخالية من ECM 2D ، يتم تعليق اللوحة أحادية الخلية مباشرة على شرائح الغرفة ذات الأربعآبار ووضع الشرائح في حاضنة درجة مئوية 35.لثقافة ECM 2D ، الاستغناء عن 100 ميكرولترات من المصفوفة الباردة المخففة واحد إلى واحد خارج الخلية المتوسطة في شريحة غرفة أربعة بئر ، وضمان أن يغطي الجل قاع الطبق. ضع الشريحة في الحاضنة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة للسماح لـ ECM بالتمرمر إلى هلام ، ثم إضافة تعليق الخلية على القمة. لثقافة 3D ECM خالية، ضع أطباق agarose 3D Petri في طبق ثقافة 24 بئرًا واغطيها بميليلتر واحد من BM. السماح للأطباق توازن في BM لمدة 30 دقيقة على الأقل في حاضنة درجة مئوية 35، ثم تجاهل BM وتكرار التوازن مرة أخرى مع ملليلتر واحد من BM الطازجة. إزالة جميع BM من البئر والاستغناء عن 200 ميكرولترات من BM الطازجة حول ولكن ليس داخل عطلة مركز طبق بيتري 3D، ثم جمع أي BM المتبقية من داخل خلية مركز بذر عطلة من إدراج جيدا الدقيقة.الاستغناء عن تعليق خلية واحدة في عطلة مركز و triturate بلطف صعودا وهبوطا. ضع الطبق في حاضنة مرطبة 35 درجة مئوية للثقافة. في اليوم التالي، ببطء وبعناية إزالة وسائل الإعلام الموجودة من حول صحن agarose 3D بيتري واستبدالها بميليلتر واحد من BM الطازجة. يجب أن تكون الأعضاء مضغوطة بين عشية وضحاها ، مما يسمح لهم بالراحة في القاع.بالنسبة لثقافة ECM ثلاثية الأبعاد، قم بإعداد تعليق أحادي الخلية عن طريق الجمع بين أجزاء متساوية من تعليق الخلية في BM مع ECM الباردة المذابة مسبقًا. Triturate عدة مرات لضمان أنها مختلطة بشكل جيد. ثم الاستغناء فورا الخليط في شريحة غرفة أربعة بئر، وضمان أنه يغطي الجزء السفلي بأكمله من لوحة.احتضان الشرائح الغرفة في 35 درجة مئوية والسماح لمحتوياتها البلمرة لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد البلمرة، إضافة 500 ميكرولترات من BM على رأس الثقافة. ثقافة جميع أنواع نموذج organoid في 35 درجة مئوية.لجميع أنواع الثقافة، وتبادل نصف وسائل الإعلام الخاصة بهم مع BM الطازجة كل يومين. وقد استخدم هذا البروتوكول لتحقيق توليد العضوية في غضون 24 ساعة باستخدام خلايا الخصية المورين الأحداث. وقد لوحظت الأنسجة التي تم إنشاؤها بنجاح في البداية كتجمعات خلايا ثلاثية الأبعاد.في بيئات ECM، تملك كتل الخلية هوامش واضحة بين الكتلة والبيئة المحيطة بها. ولوحظ أيضا أن مجموعات الخلايا تنتقل عبر إدارة المحتوى في الـ ECM وتصهر بعضها البعض. تتطلب ثقافة 3D ECM وقتًا أطول لتجميع هياكل de novo أكثر من جميع أساليب الثقافة الأخرى.وأنتجت الثقافة 3D ECM خالية من أكبر المجموعات مع مجموعة واحدة كبيرة وصغيرة داخل كل بئر من 3D agarose بيتري الطبق. لتقييم ما إذا كانت النماذج العضوية تشبه الأنسجة الأصلية ، تم فحص الانشاءات البيولوجية لعلامات خاصة بالخلايا وتصورها مع الفلوروسين المناعي. أنتجت الأساليب 2D ECM و 3D ECM الخالية من العضية مع مورفولوجيا داخلية محاكاة عالية من تجزئة الخصية.تم إجراء تحليل طويل الأجل على الأعضاء المجمعة 3D ECM خالية. تم استزراع الأعضاء لمدة 14 يومًا ثم تم فحصها بحثًا عن علامات خاصة بالخلية والهيكل. ولوحظت هياكل تشبه الأنابيب.كما تمت دراسة الأعضاء 3D ECM خالية من وظيفة الغدد الصماء في ثقافة 12 أسبوعا مع التحفيز gonadotropin. التستوستيرون وinhibin B على حد سواء كميا من المتوسطة organoid مكيفة. بعد 12 أسابيع, تمت إزالة gonadotropins لمدة 48 ساعة, مما تسبب في التستوستيرون وتركيزات inhibin B إلى الانخفاض.عندما عاد gonadotropins, كل من هرمون تركيزات زيادة كبيرة, مما يدل على الاستجابة السليمة للغدد الصماء. الجمعية العضوية يستفيد من السلوك الذاتي للخلايا الخصية غير ناضجة قابلة للحياة. يمكن بسهولة ابتكار التجارب الإبداعية من خلال استخدام خلية مخصصة مفروزات الخلية أو الهجين.بعد البذر الخلية، يمكن استخدام التصوير الفيديو الحي أو التصوير الفاصل الزمني لتحديد حجم التجميع الذاتي العضوي. عبر الثقافة، يمكن جمع organoids ومتوسطة الشرط لتحليلات التحاليل النسيجية والأمينية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

السابق الرحم Electroporation للوعضوي النمط من الثقافة شريحة ماوس الحصين الأنسجة

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

جيل المعدلة وراثيا الثقافات الجلد الميتة عضوي عن طريق الأدمة الإنسان

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

عزل خلايا الفئران الجنينية مكون للدم غشائي

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

تقييم الضرر الناجم عن الشيخوخة و في فيفو إعادة برمجة في العضلات الهيكلية

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

في فيفو تتبع البشرية المستمدة من الدهنية الخلايا الجذعية الوسيطة في نموذج الفئران هشاشة العظام ركبة مع صبغ الغشاء محبتين نيون

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

جيل بانكريتويدس التعبير عن الأنسولين خالية من السقالة، ثلاثي الأبعاد من الماوس المتكفل البنكرياس في المختبر

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...