Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

这项工作由国家卫生研究所、国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）F31 HD089693、国家环境卫生科学研究所/国家促进转化科学中心（NIEHS/NCATS）UH3TR001207和4UH3ES029073-03以及托马斯·沃特金纪念教授职位资助。
作者要感谢埃里克·罗斯在透射电子显微镜方面的帮助。这项工作利用了西北大学NUANCE中心的BioCryo 设施，该设施得到了软和混合纳米技术实验（SHyNE）资源（NSF ECCS-1542205）的支持;材料研究中心的 MRSEC 计划 （NSF DMR-1720139）;国际纳米技术研究所;和伊利诺伊州，通过IN。它还使用 CryoCluster 设备，该设备得到了 MRI 计划 （NSF DMR-1229693） 的支持。图 1 中的图形 是使用BioRender.com。

所有小鼠实验都得到西北大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，所有程序都根据国际动物保护委员会批准的议定书进行。
1. 酶组织分离解决方案的制备
<ol><li>使用两种不同的酶解决方案（解决方案 1 和解决方案 2），这两种解决方案都是使用基底培养基介质解决方案 （BM） 制造的。</li>
	<li>要准备BM，将血清和青霉素-链霉素添加到最低基本介质到最终浓度的10%和1%（ <s...

随着此器官生成协议的完成，用户将有四种不同的培养技术可供他们组装睾丸构造和无 ECM 环境中的器官。重要的是，这四种方法都允许研究人员通过延时成像或录像，在一段时间内对器官自我组装进行非侵入性观察，并且能够无创地收集条件介质来分析分泌的激素和细胞因子，而不会在培养过程中干扰组织。在所有方法中，在24小时过程中，实验者可以生成多达数百个器官/睾丸构造，如细胞数?...

睾丸器官是研究睾丸发育、精子生成和体,外1、2、3、4,2的生理学的开创性技术。已探索了几种方法，用于组织生成;其中包括各种细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 培养系统，包括二维 （2D） 和三维 （3D） 方向。不同的生成方法可以促进不同的细胞组装策略;这导致已发表的器官模型之间的形态和功能变异程度很高。本文的目的是讨论体外睾丸模型的当前状态，并在设计睾丸器官实验时作为未来研究者的模型。本研究确定了四种不同的培养系统原型，并在实验过程和生物结果中进行了描述和描述。这些包括：2D ECM 无 ECM、2D ECM、3D ECM 无和 3D ECM 培养方法。本文介绍的策略旨在在不同的实验室和研究组之间简单、易于访问和高度可重复。
从历史上看，睾丸的指定"体外"，已被用于睾丸组织和细胞的几种不同的培养方法。这些包括有机组织/器官培养方法（即外植培养）5、分离的半纤维培养6、睾丸细胞培养7，以及新组织形态生成方法（即生物构造和器官）1。第一次对体外精子发生的调查是在大约100年前进行的，1920年8月，兔子睾丸的培养，后来于1937年与小鼠外植9。在这些最初的实验中，观察到精子在培养的第一周大体退化，尽管发现了一些具有美色区分的细胞。回想这些历史报告，睾丸外培养在2011年恢复和优化，成为一个可行的技术，研究睾丸10。自2011年以来，在11、12、13的多个报告中，植外培养已经产生了生育能力强的精子。然而，由于植物外培养对预先存在的原生睾丸的依赖，这些最近的进步被更准确地描述为"外活"睾丸功能和精子生成的例子，组织功能从生物体的身体中去除后保持或恢复。尽管它在文献中流行，但长期的生殖细胞维持和睾丸外植分化是具有挑战性的复制14，15，16，17，18，特别是在足够长的时间充分观察体外精子发生（+35,15,16,17,18天在小鼠19和74在人类20）。有趣的是，许多相同的挑战经历了100年前，仍然经历在外体精子发生今天。
与外体方法不同，睾丸器官是完全从细胞源（即原发性睾丸细胞）在体外产生的。睾丸器官提供了一个创造性的策略，以规避该领域对预先存在的原生组织的历史依赖，并完全在体外重述睾丸生物学。大多数器官组织模型有多种共同要求;其中包括（1）体内膜状组织形态或结构，（2）代表组织的多种主要细胞类型，（3）自组装或自组织在它们的生成，和（4）模拟一定水平的表示组织的功能和生理的能力21，22，23，24。,22,23,24对于睾丸，这可以在四个主要特征中捕获：（1） 包含主要睾丸细胞类型， 细菌、Sertoli、Leydig、围膜和其他间膜细胞，（2）细胞定向组织组装，（3）适当分离细胞类型，分为单独的管状隔间（细菌和Sertoli）和间膜区域（所有其他细胞类型），以及（4）某种程度的组织功能（如生殖激素分泌或组织反应，以及生殖细胞维持和分化）。考虑到在维持生殖细胞分化外体和体外方面的历史挑战，在体内-哑膜睾丸结构（即类似半膜状管状结构）的回顾，以及暗示睾丸生理学模拟（例如内分泌功能）的其他标记，是生成有朝一日可能维持体外精子生成器官的优先里程碑。
大多数已发表的睾酮类药物都利用了市售的 ECM（例如胶原蛋白或专有 ECM 配方）25、26、27,26,27或定制来源的 ECM（即去细胞化睾丸 ECM 衍生水凝胶）28、29、30。28,29,30外源 ECM 通过提供用于组织生成组装支持的支架来促进非新组织的形成。ECM方法提供了令人印象深刻的组织形成水平，包括一些生殖细胞的存在和组织-模仿形态25，28。25,但是，它们利用的 ECM 并不总是通用的（即去细胞化 ECM 衍生水凝胶），并且某些方法需要复杂的凝胶和细胞播种方向（例如，ECM 的 3 层梯度和 3D 打印）25、31,31、32。,无脚手架方法（如吊滴和非坚固培养板）33、34、35也产生了坚固且高度可重复的有机体，无需ECM凝胶或脚手架。33,34,35然而，这些无支架器官的组织形态往往与体内睾丸不同，这些报告中大多数都含有生化ECM添加剂，以促进组织形成33、34、36，,34,36或者依靠离心进行强制细胞聚集和压实34，使得它们不太适合研究细胞定向迁移和自组织。
本手稿中介绍的四种器官生成方法包括 ECM 依赖和独立策略，每种策略都使用简单的细胞播种，从而能够观察细胞驱动的器官自组装。所有四种技术都可以从相同的细胞悬浮液中执行，也可以利用自定义和细胞类型的富集种群。这些方法的强项是能够实时观察器官自组装，并直接比较睾丸结构在不同文化微环境之间如何自我组装。这四种文化方法之间的表型差异，对于研究者的研究问题或课题的影响，应考虑它们。每种方法在24小时或更小范围内产生生物构造或器官。总之，本文介绍的方法为研究睾丸器官组装、组织发育和体外睾丸生理学提供了器官组装技术工具包。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

睾丸器官为研究体外睾丸发育、精子生成和内分泌学提供了工具。为了制造睾丸器官，已经开发出几种方法。许多这些方法依靠细胞外基质（ECM）来促进新组织组装，然而，在仿生形态和组织功能方面，方法之间存在差异。此外，对已发布的方法几乎没有直接的比较。在这里，通过研究器官生成协议的差异，提供结果，进行直接比较。介绍了四种原型生成方法：（1） 2D 无 ECM、（2） 2D ECM、（3） 3D ECM 无和 （4） 3D ECM 培养。三个主要基准用于评估睾丸器官生成。这些是细胞自组装，包括主要细胞类型（Sertoli，Leydig，细菌和围膜细胞），以及适当的分立组织结构。在测试的四个环境中，2D ECM 和 3D ECM 培养物生成具有与原生睾丸最相似的内部形态的有机体，包括管状细胞与间质细胞类型的去新隔离、类似管状结构的发展以及已建立的长期内分泌功能。研究的所有方法都利用了未排序的原发性睾丸细胞悬浮液，并使用了常用的培养资源。这些睾丸器官生成技术为睾丸器官生成和体外生理学的研究举措提供了高度可访问和可重复的工具包。

如果睾丸细胞在培养的72小时内没有自组装，则有机细胞生成被认为是不成功的，然而，在使用幼细胞（5 dpp）时，这里提供的所有方法在24小时内组装。生物构造生成的失败呈现为自由悬浮细胞的延续（图1中的0 h列）， 即使在扩展培养（72小时）之后。在没有组织自组装的情况下，任何明显的细胞簇在轻轻操作（即移液）后也很容易分散到单个细胞中。成功生成的组织最初...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

在这里，介绍了从原发性新生儿穆林睾丸细胞生成睾丸器官的四种方法，即细胞外基质 （ECM） 和无 ECM 的 2D 和 3D 培养环境。这些技术具有多种研究应用，特别适用于研究睾丸发育和体外生理学。

基于细胞基和细胞外矩阵的Murine睾丸器官生成

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

这些协议使用户能够在 2D 或 3D 培养条件下的 ECM 和 DCM 无负载环境中产生大量的结构模仿和内分泌功能睾酮器官。这些技术具有高度可重复性，易于应用于标准生物实验室环境，并且仅使用通用工具和材料。睾丸器官是一种在体外模拟精子生成和生殖内分泌学的新工具，有一天可能有助于体外游戏发生的研究。首先将安乐死小鼠在解剖垫上，用70%乙醇对腹部进行消毒。用钳子将下腹部的皮肤搭上帐篷，然后用剪刀打开。在腹部的左下、右下角区域定位睾丸，切断其与血管延迟和任何锚定结缔组织的连接。然后从动物那里抬起整个睾丸。放在预平衡的 BM 的培养皿中。在解剖显微镜下，用小微解剖剪刀或用两个细钳轻轻撕裂，在每个睾丸的一端的图尼卡阿尔布吉纳做一个小切口。当从切口的另一端握住睾丸时，用细钳轻轻挤压它，然后向 tunica 上的孔推进一个清扫运动，这将释放睾丸组织作为一个内聚的一块。将组织切成小块。将碎片放入一毫升预热分离溶液中，并在37摄氏度下孵育10分钟。孵育后，用P1000移液器轻轻三叶草30次。确保管状分开彼此和从间状组织。如果团块仍然存在，再孵育五分钟，再三结。每毫升分离混合物中加入33微升的海卢罗尼达塞库存溶液。然后用P1000移液器三重奏50次，在37摄氏度下孵育样品5分钟。孵育后，用P200移液器三联其50次。在确保不存在可见的团或细胞团后，通过将FBS加入样品总体积的10%并用P200移液器多次三联化，淬火分离酶。用介质将 40 微米细胞滤株的中心弄湿并吸走，然后将样品添加到预湿滤片中，然后过滤以产生单细胞悬浮液。将悬浮液在 100 倍 g 下离心 7 分钟。丢弃上一液，在新鲜的BM中重新暂停细胞。使用 trypan 蓝色排除物计算血细胞仪上的可行细胞，然后重新离心，并在新鲜的 BM 中重新排水。对于 2D ECM 培养，板单单元悬架直接放在四井腔室的幻灯片上，然后将滑轨放入 35 摄氏度的培养箱中。对于 2D ECM 培养，将 100 微升的冷一对一稀释的细胞外基质介质分配到四井腔室滑盘中，确保凝胶覆盖菜底。将幻灯片放在培养箱中至少 30 分钟，使 ECM 聚合到凝胶中，然后将电池悬浮液添加到顶部。对于 3D ECM 无培养，将阿加罗斯 3D Petri 菜肴放入 24 井培养皿中，并覆盖一毫升 BM。让盘子在35摄氏度的培养箱中平衡在BM中至少30分钟，然后丢弃BM，再用一毫升新鲜BM重复平衡。从井中拆下所有 BM，并分配 200 微升新鲜 BM 周围，但不是在 3D Petri 盘的中心凹槽内，然后从微井插入的中心细胞播种凹槽内收集任何剩余的 BM。将单单元悬浮液分配到中心凹槽中，然后轻轻上下三角。将菜放入加湿的35摄氏度培养箱中，用于培养。第二天，缓慢而小心地从阿加罗斯 3D Petri 盘周围去除现有介质，代之以一毫升新鲜 BM。器官应该在一夜之间压实，让它们在底部休息。对于 3D ECM 培养，通过将 BM 中电池悬架的相等部分与冷预解冻 ECM 相结合，准备单单元悬架。多次三次三次，以确保其混合良好。然后立即将混合物分配到四井室滑轨中，确保它覆盖整个板底。孵育室在35摄氏度下滑动，并允许其内层聚合至少30分钟。聚合后，在培养基上加入500微升BM。培养所有有机模型类型在35摄氏度。对于所有文化类型，每两天用新的 BM 交换一半的媒体。该协议用于使用幼年月脑睾丸细胞在24小时内实现器官生成。成功生成的组织最初被观测为3D细胞簇。在 ECM 环境中，单元群集在群集与其周围环境之间具有清晰的边距。还观察到细胞簇在 ECM 之间迁移并熔断在一起。与所有其他培养方法相比，3D ECM 培养需要比所有其他培养方法更多的时间来组装新结构。3D ECM 培养产生最大的集群，在 3D agarose Petri 盘的每个井内都有一个大型紧凑的聚类。为了评估器官模型是否与原生组织相似，对生物构造进行细胞特异性标记的探究，并用免疫荧光进行可视化。2D ECM 和 3D ECM 无 ECM 方法产生具有睾丸分块化内部形态高度模仿的器官。对 3D 无 ECM 组装的有机体进行了长期分析。器官被培养14天，然后探究细胞和结构特异性标记。观察到了图勒状结构。在具有腺激素刺激的12周培养物中，还研究了3D ECM无器官的内分泌功能。睾酮和因希宾B都是从器官条件介质中量化的。12周后，腺腺激素被移除48小时，导致睾酮和血红素B浓度下降。当性腺激素返回时， 两种激素浓度显著增加， 表现出适当的内分泌反应.有机体组装利用可行的未成熟睾丸细胞的自主行为。通过使用定制细胞排序或混合细胞混合物，可以轻松设计创意实验。在细胞播种之后，实时视频成像或延时成像可用于量化器官自组装。跨培养，器官和条件介质可以收集组织学和氨基测定分析。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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科研

发育生物学

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小鼠肝外胆管有机体的产生

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

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The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...