Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 og 4UH3ES029073-03 og Thomas J. Watkins memorial professorat.
Forfatterne vil gerne takke Eric W. Roth for deres hjælp med transmission elektron mikroskopi. Dette arbejde gjorde brug af BioCryo facilitet Northwestern University's NUANCE Center, som har modtaget støtte fra Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); MRSEC-programmet (NSF DMR-1720139) på Materials Research Center; Det Internationale Institut for Nanoteknologi (IIN) og staten Illinois, gennem IIN. Det gjorde også brug af CryoCluster udstyr, som har modtaget støtte fra MR-programmet (NSF DMR-1229693). Grafikken i figur 1 er designet ved hjælp af BioRender.com.

Alle museforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) fra Northwestern University, og alle procedurer blev udført i henhold til IACUC-godkendte protokoller.
1. Udarbejdelse af enzymatiske vævsdesociationsopløsninger
<ol><li>Brug to forskellige enzymatiske opløsninger (Løsning 1 og Løsning 2), begge fremstillet ved hjælp af en basalkultur medium opløsning (BM).</li>
	<li>For at forberede BM tilsættes serum og penicillin-streptomycin til minimum væsent...

Med færdiggørelsen af denne organoid generation protokol, vil brugeren have fire forskellige kultur teknikker til rådighed for dem til montering af testikelkonstruktioner og organoider i enten ECM eller ECM-fri miljøer. Vigtigere er det, at alle fire metoder gør det muligt for forskeren at ikke-invasivt observere organoid selvsamling over tid gennem time-lapse-billeddannelse eller videooptagelse, og at ikke-invasivt indsamler betinget medier til analyse af hemmelige hormoner og cytokiner uden at forstyrre væv under...

Testikelorganoider er en banebrydende teknik til at studere testikeludvikling, spermatogenese og fysiologi in vitro1,,2,,3,4. Flere metoder er blevet undersøgt for organoid generation; disse omfatter en række ekstracellulære matrix (ECM) og ECM-fri kultur systemer, i både to-dimensionelle (2D) og tre-dimensionelle (3D) retninger. Forskellige generation metoder kan fremme forskellige cellulære samling strategier; dette resulterer i en høj grad af morfologisk og funktionel variation mellem offentliggjorte organoidmodeller. Formålet med denne artikel er at diskutere den aktuelle tilstand af in vitro testikelmodeller, og at tjene som en skabelon for fremtidige efterforskere, når designe testikel organoid eksperimenter. I denne undersøgelse defineres og karakteriseres fire forskellige kultursystemarktyper i forsøgsprocessen og det biologiske resultat. Herunder: 2D ECM-fri, 2D ECM, 3D ECM-fri og 3D ECM-kultur. Strategierne heri er beregnet til at være enkle, tilgængelige og meget reproducerbare mellem forskellige laboratorier og forskningsgrupper.
Historisk for testikerne, betegnelsen "in vitro", er blevet brugt til flere forskellige kultur metoder testikelvæv og celler. Disse omfatter organotypiske vævs-/organkulturmetoder (dvs. eksplantkultur)5, isoleret seminiferøs tubulekultur6, testikelcellekultur7og metoder til de novo tissue morfoogenese (dvs. biologiske konstruktioner og organoider)1. De første undersøgelser af in vitro spermatogenese blev udført omkring 100 år siden, med kulturen i kanin testis explants i 19208, og senere i 1937 med mus explants9. Inden for disse første forsøg spermatogoni blev observeret for stort set degenerere i hele den første uge af kulturen, selv om nogle meiotisk differentiere celler blev identificeret. Minder om disse historiske rapporter, testis explant kultur blev genoplivet og optimeret i 2011 at blive en mulig teknik til at studeretestikerne 10. Siden 2011 har explant kultur produceret fertilitet kompetente sædceller i flere rapporter11,12,13. Men på grund af explant kultur afhængighed af allerede eksisterende native testikler tubuli, disse seneste fremskridt er mere præcist beskrevet som eksempler på "ex vivo" testikelfunktion og spermatogenese, vævsfunktion, der blev opretholdt eller genoptaget ved fjernelse fra en organisme krop. På trods af sin udbredelse i litteraturen, langsigtede kim celle vedligeholdelse og differentiering inden testikel explants er udfordrende atreplikere 14,,15,,16,17,18, især over tidsrammer længe nok til fuldt ud at observere in vitro spermatogenese (~ 35 dage i mus19 og 74 hos mennesker20). Det er spændende at forstå, at mange af de samme udfordringer oplevet for 100 år siden, er stadig opleves inden for ex vivo spermatogenesis i dag.
Testikelorganoider, der adskiller sig fra ex vivo-tilgange, er de novo-forsamlede mikrotissu'er, der udelukkende genereres fra cellulære kilder (dvs. primære testikelceller). Testikelorganoider giver en kreativ strategi for at omgå feltets historiske afhængighed af allerede eksisterende indfødte væv, og at opsummere testikelbiologi helt in vitro. Der er flere krav deles af de fleste organoid væv modeller; disse omfatter (1) in vivo-mimetisk væv morfologi eller arkitektur, (2) flere større celletyper af det repræsenterede væv, (3) selvsamling eller selvorganisation i deres generation, og (4) evnen til at simulere en vis grad af det repræsenterede vævs funktion og fysiologi21,22,23,24. For testikler kan dette opfanges i fire hovedstempler: 1) medtagelse af større testikelcelletyper, kim, Sertoli, Leydig, peritubular og andre interstitielle celler, (2) celle-rettet vævssamling, (3) passende opdelte celletyper i separate rørformede rum (kim og Sertoli) og interstitielle regioner (alle andre celletyper) og (4) en vis grad af vævsfunktion (f.eks. reproduktionshortsekretion eller vævsreaktioner samt kimvedligeholdscelle og -differentiering). I betragtning af de historiske udfordringer i opretholdelsen af kimcelledifferentiering ex vivo og in vitro, rekapitulation af in vivo-mimetiske testikelarkitekturer (dvs. strukturer, der ligner seminiferøse tubuli) med yderligere markører, der tyder på simulering af testikelfysiologi (f.eks. endokrine funktion), er prioriterede milepæle i retning af at generere organoider, som en dag kan opretholde in vitro spermgeneatose.
De fleste offentliggjorte testikelorganoide metoder udnytter kommercielt tilgængelige ECM -produkter (f.eks. kollagen eller proprietære ECM-formuleringer)25,26,27 eller specialfremstillede ECM'er (dvs. decellulaliserede testikler ECM-afledte hydrogels)28,29,30. Eksogent ECM fremmer de novo vævsdannelse ved at levere et samlingsfremmende stillads til vævsgeneration. ECM-metoder har givet et imponerende niveau af vævsdannelse, herunder en vis kimcelletilstedeværelse og vævs-mimetisk morfologi25,28. De ECM'er, de anvender, er imidlertid ikke altid universelt tilgængelige (dvs. decellulære ECM-afledte hydrogels), og nogle metoder kræver avancerede gel- og cellesåningsretninger (f.eks. 3-lags gradienter af ECM- og 3D-print)25,31,32. Stilladsfri metoder (f.eks. hængende dråbe og ikke-vedhæftige dyrkningsplader)33,34,35 har også genereret robusteogmeget reproducerbare organoider uden behov for ECM-geler eller stilladser. Men væv morfologi af disse stillads-fri organoider er ofte ulig in vivo testikler, og de fleste af disse rapporter indeholder en biokemisk ECM tilsætningsstof til at fremme vævdannelse 33,34,36, eller alternativt, stole på centrifugering for tvungen celle aggregering og komprimering34, hvilket gør dem mindre ideelle til at studere celle-rettet migration og selvorganisering.
De fire organoid generation metoder præsenteret i dette manuskript omfatter både ECM-afhængige og uafhængige strategier, hver ved hjælp af simple celle såning, der gør det muligt at observation af celle-drevet organoid selvsamling. Alle fire teknikker kan udføres fra de samme celle suspensioner eller kan gøre brug af brugerdefinerede og celle-type beriget populationer. En styrke af disse metoder er evnen til at observere organoider selv-samle i realtid, og til direkte at sammenligne, hvordan testikelstrukturer selv-samle mellem forskellige kultur mikromiljøer. De fæotypiske forskelle mellem disse fire dyrkningsmetoder bør overvejes for deres indvirkning på investigators forskningsspørgsmål eller emne. Hver metode producerer biologiske konstruktioner eller organoider inden for 24 timer eller derunder. Afslutningsvis, de metoder, der præsenteres her giver en værktøjskasse af organoid samling teknikker til at studere testikel organoid samling, væv udvikling, og testikelfysiologi in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Testikelorganoider giver et værktøj til at studere testikeludvikling, spermatogenese og endokrinologi in vitro. Der er udviklet flere metoder til at skabe testikelorganoider. Mange af disse metoder er afhængige af ekstracellulære matrix (ECM) for at fremme de novo vævssamling, men der er forskelle mellem metoder med hensyn til biomimetisk morfologi og vævs funktion. Desuden er der kun få direkte sammenligninger af offentliggjorte metoder. Her foretages en direkte sammenligning ved at studere forskelle i organoid generationsprotokoller, med forudsat resultater. Fire arketypiske generationsmetoder: (1) 2D ECM-fri, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-fri, og (4) 3D ECM kultur er beskrevet. Der blev anvendt tre primære benchmarks til vurdering af testikelorganoidproduktionen. Disse er cellulære selvsamling, inddragelse af større celletyper (Sertoli, Leydig, kim, og peritubular celler), og passende opdelt væv arkitektur. Af de fire testede miljøer genererede 2D ECM og 3D ECM-frie kulturer organoider med interne morfologier, der minder mest om indfødte testikler, herunder de novo compartmentalization af rørformede versus interstitielle celletyper, udvikling af tubullignende strukturer og en etableret langsigtet endokrine funktion. Alle undersøgte metoder udnyttede usorterede, primære murine testikelcellesuspensioner og anvendte almindeligt tilgængelige kulturressourcer. Disse testikelorganoide generationsteknikker udgør en meget tilgængelig og reproducerbar værktøjskasse til forskningsinitiativer inden for testikelorganogenese og fysiologi in vitro.

Organoid generation blev anset for mislykket, hvis testikelceller ikke selv samles inden for 72 h af kultur, men alle metoder, der præsenteres her samles inden for 24 timer, når du bruger unge (5 dpp) murin celler. Svigt i den biologiske konstruktørproduktion, der præsenteres som en fortsættelse af frit suspenderede celler (0 h kolonne i figur 1) selv efter udvidet kultur (72 h). I mangel af selvopsamling af væv kan eventuelle synlige celleklynger let spredes til individuelle celler ve...

Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Her beskrives fire metoder til generering af testikelorganoider fra primære neonatal murine testikelceller, dvs. Disse teknikker har flere forskningsapplikationer og er især nyttige til at studere testikeludvikling og fysiologi in vitro.

Ekstra Cellulær Matrix-baseret og ekstra cellulær matrix-fri generation af Murine testikel organoider

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Disse protokoller gør det muligt for brugeren at producere et stort antal strukturelt mimetiske og endokrine funktionelle testikelorganoider i både ECM og DCM-fri miljøer i 2D eller 3D kultur betingelser. Disse teknikker er meget reproducerbare, let anvendes til standard biologiske laboratorieindstillinger, og kun udnytte fælles værktøjer og materialer. Testikelorganoider er et nyt værktøj til simulering af spermatogenese og reproduktiv endokrinologi in vitro, og kan en dag gøre det muligt at studere in vitro gametogenesis.Begynd med at placere den aflivede mus liggende på en dissektionsmåtte og sterilisere maven med 70% ethanol. Telt huden på underlivet med snævler og åbne den med en saks. Find testiklerne i nederste venstre og højre lyskeområder i maven og skære deres forbindelser til vas deferens og enhver forankring bindevæv.Løft derefter hele testiklerne fra dyret. Placer den i en petriskål af præ-kvilibreret BM. Under en dissektion mikroskop, foretage et lille snit i tunica albuginea i den ene ende af hver testik med enten små mikro dissektion saks eller ved forsigtigt at rive med to fine kraftforpine. Mens du holder testikerne fra den modsatte ende af snittet, skal du forsigtigt klemme det med fine scefængre og skubbe i en fejende bevægelse mod hullet i tunica, som vil frigive testikelvævet som en sammenhængende stykke.Skær vævet i mindre stykker. Stykerne hældes i en milliliter forsociationsopløsning en og inkuberes ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Efter inkubationen triturere forsigtigt testiklerne 50 gange med en P1000-pipette.Sørg for, at tubuliene er adskilt fra hinanden og fra det interstitielle væv. Hvis klumper forblive, inkuberes i yderligere fem minutter og triturate igen. Der tilsættes 33 mikroliter hyaluronidase stock opløsning pr. milliliter dissociationsblandingen.Derefter triturere 50 gange med en P1000 pipette og inkubere prøven ved 37 grader Celsius i fem minutter. Efter inkubationen tritureres den 50 gange med en P200-pipette. Efter at have sørget for, at der ikke er synlige tubuli eller klumper af celler til stede, skal dissociationsenzymerne slukkes ved at tilsætte FBS til 10 % af prøvens samlede volumen og triturere den flere gange med en P200-pipette.Våd midten af en 40 mikrometer celle si med medier og aspirere det væk, derefter tilføje prøven til den for-våde si og filtrere det til at producere en enkelt-celle suspension. Centrifuge suspensionen ved 100 gange g i syv minutter. Kassér supernatanten og opspjæn dine celler i frisk BM. Tæl de levedygtige celler på et hæmocytometer ved hjælp af trypan blå udelukkelse, derefter re-centrifuge og resuspend dem i frisk BM. Til 2D ECM-fri kultur, plade encellede suspensioner direkte på fire-godt kammer dias og placere dias i en 35 grader Celsius inkubator.Til 2D ECM-kultur skal der dispenseres 100 mikroliter kold en-til-en fortyndet ekstracellulær matrixmedium ud i et fire-brønds kammerslid, der sikrer, at gelen dækker skålbunden. Anbring rutsjebanen i inkubatoren i mindst 30 minutter, så ECM kan polymerisere i en gel, og tilsæt derefter celleaffjedringen øverst. For en 3D ECM-fri kultur, skal du placere agarose 3D Petri retter i en 24-brønd kultur parabol og dække dem med en milliliter BM. Lad retterne ligevægte i BM i mindst 30 minutter i en 35 grader Celsius inkubator, derefter kasseres BM og gentages jævnsmitteringen igen med en milliliter frisk BM. Fjern alle BM fra brønden og dispensere 200 mikroliter af frisk BM rundt, men ikke inde i midten fordybning af 3D Petri skålen, derefter indsamle eventuelle resterende BM inde fra midten celle såning fordybning af mikro godt indsætte.Afgør encellede suspensionen i midterfordyringen og triturat forsigtigt op og ned. Placer fadet i en befugtet 35 grader Celsius inkubator for kultur. På den næste dag, langsomt og forsigtigt fjerne eksisterende medier fra omkring agarose 3D Petri fad og erstatte med en milliliter frisk BM. De organoider bør have komprimeret natten over, så de kan hvile i bunden.Til 3D ECM-kultur skal du forberede en enkeltcellesuspension ved at kombinere lige dele af cellesuspensionen i BM med kold fortøbt ECM. Triturate flere gange for at sikre, at det er godt blandet. Derefter straks dispensere blandingen i en fire-brønd kammer dias, sikre, at det dækker hele bunden af pladen.Inkuber kammeret glider ved 35 grader Celsius og lad dets indhold til at polymerisere i mindst 30 minutter. Efter polymeriseringen tilsættes 500 mikroliter BM oven på kulturen. Kultur alle organoid model typer ved 35 grader Celsius.For alle kulturtyper skal du udveksle halvdelen af deres medier med frisk BM hver anden dag. Denne protokol blev brugt til at opnå organoid generation inden for 24 timer ved hjælp af unge murin testikelceller. Vellykket genereret væv blev oprindeligt observeret som 3D-celle klynger.I ECM-miljøer har celleklyngerne klare kanter mellem klyngen og deres omgivende miljø. Der blev også observeret celleklynger for at migrere over ECM og smelte sammen. 3D ECM-kulturen krævede markant mere tid til at samle de novo strukturer end alle andre kulturmetoder.Og den 3D ECM-fri kultur producerede de største klynger med en enkelt stor og kompakt klynge inden for hver brønd af 3D agarose Petri skålen. For at vurdere, om organoidmodellerne ligner det oprindelige væv, blev de biologiske konstruktioner undersøgt for cellespecifikke markører og visualiseret med immunfluorescens. 2D ECM- og 3D ECM-fri metoder producerede organoider med en indre morfologi, der er meget mimetisk testikelopdemærkest.Der blev udført en langtidsanalyse på de 3D ECM-frie samlede organoider. Organoiderne blev dyrket i 14 dage og derefter undersøgt for celle- og strukturspecifikke markører. Tubule-lignende strukturer blev observeret.De 3D ECM-frie organoider blev også undersøgt for endokrine funktion i en 12-ugers kultur med gonadotropin stimulation. Testosteron og inhibin B blev begge kvantificeret fra organoid-konditioneret medium. Efter 12 uger, gonadotropiner blev fjernet i 48 timer, forårsager testosteron og inhibin B koncentrationer til at falde.Når gonadotropiner blev returneret, begge hormon koncentrationer betydeligt øget, viser korrekt endokrine lydhørhed. Organoid samling udnytter den autonome adfærd levedygtige umodne testikelceller. Kreative eksperimenter kan nemt udtænkes ved hjælp af tilpassede cellesorterede eller hybridcelleblandinger.Efter celle såning, live video billeddannelse eller time-lapse imaging kan bruges til at kvantificere organoid selvsamling. På tværs af kultur, organoider og tilstand medium kan indsamles til histologiske og amino assay analyser.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporering og organotypisk Slice kultur Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generering af genetisk modificerede Organotypiske Skin Cultures Brug devitaliseret Menneskelig Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolering af murint embryonale Hemogenic endotelceller

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Sporing af menneskers fedt-afledt mesenkymale stamceller i en rotte knæet slidgigt Model med fluorescerende lipofile membran farvestof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion og validering af cellulære gulne i primære humane celler

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation af Organoids fra mus ekstrahepatisk galdeveje

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...