Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door het National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, het National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 en 4UH3ES029073-03, en het Thomas J. Watkin's Memorial Professorship.
De auteurs zouden Eric W. Roth voor hun hulp met transmissieelektronenmicroscopie willen danken. Dit werk maakte gebruik van de BioCryo faciliteit van Northwestern University NUANCE Center, die steun heeft ontvangen van de Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205); het MRSEC-programma (NSF DMR-1720139) van het Materials Research Center; het Internationaal Instituut voor Nanotechnologie (IIN); en de staat Illinois, via het IIN. Het maakte ook gebruik van de CryoCluster apparatuur, die steun heeft ontvangen van het MRI-programma (NSF DMR-1229693). Afbeeldingen in figuur 1 zijn ontworpen met behulp van BioRender.com.

Alle muis experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Northwestern University, en alle procedures werden uitgevoerd onder IACUC-goedgekeurde protocollen.
1. Bereiding van enzymatische oplossingen voor weefselesociatie
<ol><li>Gebruik twee verschillende enzymatische oplossingen (Solution 1 en Solution 2), beide gemaakt met behulp van een basale cultuur medium oplossing (BM).</li>
	<li>Voeg voor de voorbereiding van BM serum en penicilline...

Met de voltooiing van dit organoïde generatieprotocol heeft de gebruiker vier verschillende cultuurtechnieken tot hun beschikking voor het assembleren van testiculaire constructies en organoïden in ECM- of ECM-vrije omgevingen. Belangrijk is dat alle vier de methoden de onderzoeker in staat stellen om organoïde zelfassemblage in de loop van de tijd niet te observeren door middel van time-lapse beeldvorming of video-opname, en om niet-invasief geconditioneerde media te verzamelen voor analyse van uitgescheiden hormonen...

Testiculaire organoïden zijn een baanbrekende techniek voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese en fysiologie in vitro1,2,3,4. Verschillende methoden zijn onderzocht voor organoïde generatie; deze omvatten een verscheidenheid aan extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije kweeksystemen, zowel in tweedimensionale (2D) als in driedimensionale (3D) oriëntaties. Verschillende generatiemethoden kunnen verschillende cellulaire assemblagestrategieën bevorderen; dit resulteert in een hoge mate van morfologische en functionele variabiliteit tussen gepubliceerde organoïde modellen. Het doel van dit artikel is om de huidige toestand van in vitro testiculaire modellen te bespreken, en om te dienen als een sjabloon voor toekomstige onderzoekers, bij het ontwerpen van testiculaire organoïde experimenten. Binnen deze studie worden vier verschillende cultuursysteemarchetypen gedefinieerd en gekenmerkt in experimenteel proces en biologische uitkomst. Deze omvatten: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free en 3D ECM cultuurmethoden. De hierin gepresenteerde strategieën zijn bedoeld om eenvoudig, toegankelijk en zeer reproduceerbaar te zijn tussen verschillende laboratoria en onderzoeksgroepen.
Historisch voor de testis, de benaming "in vitro", is gebruikt voor verschillende cultuurmethoden van testiculaire weefsels en cellen. Deze omvatten organotypische weefsel/orgaankweekmethoden (d.w.z. explantcultuur)5, geïsoleerde halfnifereuze tubulicultuur6, testiculaire celkweek7, en methoden van de novo weefselmorfogenese (d.w.z., biologische constructies en organoïden)1. De eerste onderzoeken naar in vitro spermatogenese werden ongeveer 100 jaar geleden uitgevoerd, met de cultuur van konijn testis explants in 19208, en later in 1937 met muis explants9. Binnen deze eerste experimenten spermatogonia werden waargenomen om grotendeels te degenereren in de eerste week van de cultuur, hoewel sommige meiotically differentiërende cellen werden geïdentificeerd. Doet denken aan deze historische rapporten, testis explant cultuur werd nieuw leven ingeblazen en geoptimaliseerd in 2011 om een haalbare techniek voor het bestuderen van de testis10. Sinds 2011 produceert de explantcultuur vruchtbaarheidsge competent sperma in meerdere rapporten11,12,13. Toch, als gevolg van explant cultuur afhankelijkheid van reeds bestaande inheemse testis tubuli, deze recente vooruitgang worden nauwkeuriger beschreven als voorbeelden van "ex vivo" testiculaire functie en spermatogenese, weefsel functie die werd gehandhaafd of hervat bij verwijdering uit het lichaam van een organisme. Ondanks de prevalentie in de literatuur, lange termijn kiemcel onderhoud en differentiatie binnen testiculaire explants is een uitdaging om te repliceren14,15,16,17,18, vooral over termijnen lang genoeg om volledig te observeren in vitro spermatogenese (~ 35 dagen bij muizen19 en 74 bij de mens20). Het is intrigerend om te begrijpen dat veel van dezelfde uitdagingen ervaren 100 jaar geleden, zijn nog steeds ervaren binnen ex vivo spermatogenese vandaag.
Anders dan ex vivo benaderingen, testiculaire organoïden zijn de novo geassembleerde microtissues die volledig in vitro worden gegenereerd uit cellulaire bronnen (d.w.z. primaire testiculaire cellen). Testiculaire organoïden bieden een creatieve strategie om de historische afhankelijkheid van het veld van reeds bestaand inheems weefsel te omzeilen en testiculaire biologie volledig in vitro samen te vatten. Er zijn meerdere eisen gedeeld door de meeste organoïde weefselmodellen; deze omvatten (1) in vivo-mimetische weefselmorfologie of architectuur, (2) meerdere belangrijke celtypen van het vertegenwoordigde weefsel, (3) zelfassemblage of zelforganisatie in hun generatie, en (4) de mogelijkheid om een bepaald niveau van de functie en fysiologie van het vertegenwoordigde weefsel te simuleren21,22,23,24. Voor de testis kan dit worden vastgelegd in vier belangrijke kenmerken: (1) de opname van belangrijke soorten testiculaire cellen, kiem,Sertoli, Leydig, peritubulaire, en andere interstitiële cellen, (2) cel-gerichte weefsel assemblage, (3) adequaat gecompartimenteerde celtypen in afzonderlijke buisvormige compartimenten (kiem en Sertoli) en interstitiële gebieden (alle andere celtypes), en (4) een zekere mate van weefselfunctie (bijvoorbeeld, reproductieve hormoon secretie of weefselreacties, en kiemcel onderhoud en differentiatie). Gezien de historische uitdagingen bij het handhaven van kiemceldifferentiatie ex vivo en in vitro, zijn de recapitulatie van in vivo-mimetische testiculaire architecturen (d.w.z. structuren die lijken op seminiferous tubuli) met extra markers die simulatie van testiculaire fysiologie suggereren (bijvoorbeeld endocriene functie), prioritaire mijlpalen zijn ten aanzien van het genereren van organoïden die op een dag in vitro spermatogenese zouden kunnen ondersteunen.
De meeste gepubliceerde testiculaire organoïde methoden maken gebruik van commercieel beschikbare ECM (bv. collageen of gepatenteerde ECM-formuleringen)25,26,27 of op maat gemaakte ECU's (d.w.z. gedecelluleerde testis ECM-afgeleide hydrogels)28,29,30. Exogene ECM bevordert de novo weefselvorming door het verstrekken van een assemblage-ondersteunende steiger voor weefsel generatie. ECM-methoden hebben een indrukwekkend niveau van weefselvorming geboden, waaronder enige aanwezigheid van kiemcelcellen en weefselmimetische morfologie25,28. De ECM's die zij gebruiken zijn echter niet altijd universeel beschikbaar (d.w.z. gedecelluleerde ECM-afgeleide hydrogels) en sommige methoden vereisen geavanceerde gel- en celzaaioriëntaties (bijvoorbeeld 3-laaggradiënten van ECM en 3D-printen)25,31,32. Steigervrije methoden (bijvoorbeeld hangende val en niet-loodzhemende kweekplaten)33,34,35 hebben ook robuuste en zeer reproduceerbare organoïden gegenereerd zonder de noodzaak van ECM-gels of steigers. De weefselmorfologie van deze steigervrije organoïden is echter vaak ongelijk aan in vivo teelballen, en de meeste van deze rapporten bevatten een biochemisch ECM-additief ter bevordering van weefselvorming33,34,36, of als alternatief, vertrouwen op centrifugatie voor geforceerde celaggregatie en verdichting34, waardoor ze minder ideaal zijn voor het bestuderen van celgestuurde migratie en zelforganisatie.
De vier organoïde generatie methoden gepresenteerd in dit manuscript omvatten zowel ECM-afhankelijke en onafhankelijke strategieën, elk met behulp van eenvoudige cel zaaien die de observatie van cel-gedreven organoïde zelfassemblage mogelijk maakt. Alle vier de technieken kunnen worden uitgevoerd vanuit dezelfde cel suspensies of kan gebruik maken van aangepaste en cel-type verrijkte populaties. Een kracht van deze methoden is het vermogen om organoïden zelf te assembleren in real-time te observeren, en om direct te vergelijken hoe testiculaire structuren zelf assembleren tussen verschillende cultuurmicro-omgevingen. De fenotypische verschillen tussen deze vier cultuurmethoden moeten worden overwogen voor hun impact op de onderzoeksvraag of het onderwerp van de onderzoeker. Elke methode produceert biologische constructies of organoïden binnen 24 uur of minder. Tot slot, de hier gepresenteerde methoden bieden een toolkit van organoïde assemblagetechnieken voor het bestuderen van testiculaire organoïde assemblage, weefselontwikkeling en testiculaire fysiologie in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Testiculaire organoïden bieden een hulpmiddel voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling, spermatogenese, en endocrinologie in vitro. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om testiculaire organoïden te maken. Veel van deze methoden vertrouwen op extracellulaire matrix (ECM) ter bevordering van de novo weefselassemblage, maar er zijn verschillen tussen methoden in termen van biomimetische morfologie en functie van weefsels. Bovendien zijn er weinig directe vergelijkingen van gepubliceerde methoden. Hier wordt een directe vergelijking gemaakt door verschillen in organoïde generatieprotocollen te bestuderen, met verstrekte resultaten. Vier archetypische generatiemethoden: (1) 2D ECM-vrij, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-vrij en (4) 3D ECM-cultuur worden beschreven. Drie primaire benchmarks werden gebruikt om de testiculaire organoïde generatie te beoordelen. Dit zijn cellulaire zelfassemblage, opname van grote celtypen (Sertoli, Leydig, kiem, en peritubulaire cellen), en adequaat gecompartimenteerde weefselarchitectuur. Van de vier geteste omgevingen genereerden 2D ECM- en 3D ECM-vrije culturen organoïden met interne morfologieën die het meest lijken op inheemse teelballen, waaronder de de novo compartimentering van buisvormige versus interstitiële celtypen, de ontwikkeling van tubule-achtige structuren en een gevestigde langdurige endocriene functie. Alle bestudeerde methoden gebruikten ongesorteerde, primaire murine testiculaire celsuspensies en gebruikten algemeen toegankelijke kweekmiddelen. Deze testiculaire organoïde generatietechnieken bieden een zeer toegankelijke en reproduceerbare toolkit voor onderzoeksinitiatieven op het gebied van testiculaire organogenese en fysiologie in vitro.

Organoïde generatie werd beschouwd als niet succesvol als testiculaire cellen niet zelf assembleren binnen 72 uur van de cultuur, echter, alle methoden hier gepresenteerd verzamelen binnen 24 uur bij het gebruik van jonge (5 dpp) murine cellen. Falen van biologische constructgeneratie gepresenteerd als een voortzetting van vrij zwevende cellen (0 h kolom in figuur 1) zelfs na uitgebreide cultuur (72 h). Bij afwezigheid van zelfassemblage van weefsel, alle schijnbare celclusters gemakkelijk ...

Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Hier worden vier methoden beschreven voor het genereren van testiculaire organoïden uit primaire neonatale murine-testiculaire cellen, d.w.z. extracellulaire matrix (ECM) en ECM-vrije 2D- en 3D-cultuuromgevingen. Deze technieken hebben meerdere onderzoekstoepassingen en zijn vooral nuttig voor het bestuderen van testiculaire ontwikkeling en fysiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-based en extra cellular matrix-vrije generatie van Murine Testiculaire Organoïden

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Deze protocollen stellen de gebruiker in staat om een groot aantal structureel mimetische en endocriene functionele testiculaire organoïden te produceren in zowel ECM- als DCM-vrije omgevingen in 2D- of 3D-kweekomstandigheden. Deze technieken zijn zeer reproduceerbaar, gemakkelijk toegepast op standaard biologische laboratoriuminstellingen, en alleen gebruik maken van gemeenschappelijke instrumenten en materialen. Testiculaire organoïden zijn een nieuw hulpmiddel voor het simuleren van spermatogenese en reproductieve endocrinologie in vitro, en zou op een dag de studie van in vitro gametogenese mogelijk kunnen maken.Begin met het plaatsen van de geëuthanaseerde muis supine op een dissectie mat en steriliseren van de buik met 70%ethanol. Tent de huid van de onderbuik met tangen en open het met een schaar. Zoek de teelballen in de linker- en rechtergebieden van de buik en snijd hun verbindingen met de vas deferens en eventuele verankering bindweefsel.Til vervolgens de hele teelballen van het dier. Plaats het in een petrischaaltje van vooraf geëquilibreerde BM. Maak onder een dissectiemicroscoop een kleine incisie in de tunica albuginea aan één uiteinde van elke testis met een kleine microdissectieschaar of door zachtjes te scheuren met twee fijne tangen. Terwijl u de testis van het tegenovergestelde uiteinde van de incisie houdt, knijpt u deze voorzichtig met fijne tangen en duw u in een vegende beweging naar het gat in de tunica, waardoor het testiculaire weefsel als één samenhangend stuk wordt losgegeven.Snijd het weefsel in kleinere stukken. Leg de stukken in een milliliter prewarme dissociatieoplossing een en incubeer ze op 37 graden Celsius gedurende 10 minuten. Na de incubatie, voorzichtig trituraat de teelballen stukken 50 keer met een P1000 pipet.Zorg ervoor dat de tubuli van elkaar en van het interstitiële weefsel scheiden. Als klonten blijven, incubeer voor een extra vijf minuten en trituraat weer. Voeg 33 microliter hyaluronidase voorraadoplossing per één milliliter van het dissociatiemengsel toe.Dan tritureren 50 keer met een P1000 pipet en incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Na de incubatie, trituraat het 50 keer met een P200 pipet. Nadat u ervoor hebt gezorgd dat er geen zichtbare tubuli of klonten cellen aanwezig zijn, doven de dissociatieenzymen door FBS toe te voegen aan 10% van het totale volume van het monster en trituraat het meerdere malen met een P200 pipet.Nat het centrum van een 40 micrometer cel zeef met media en aspirate het weg, voeg dan het monster aan de voorbesteed zeef en filter het om een eencellige suspensie te produceren. Centrifuge de vering op 100 keer g gedurende zeven minuten. Gooi de supernatant weg en plaats de cellen opnieuw in verse BM. Tel de levensvatbare cellen op een hemocytometer met behulp van trypan blauwe uitsluiting, dan re-centrifuge en resuspend ze in verse BM. Voor 2D ECM-vrije cultuur, plaat eencellige suspensies direct op vier-put kamer dia's en plaats de dia's in een 35 graden Celsius incubator.Voor 2D ECM-cultuur, afzien van 100 microliters van koude een-op-een verdund extracellulaire matrix medium in een vier-put kamer dia, ervoor te zorgen dat de gel de schotel bodem bedekt. Plaats de glijbaan minimaal 30 minuten in de couveuse om de ECM in een gel te laten polymeriseren en voeg er vervolgens de celsuspensie aan toe. Voor een 3D ECM-vrije cultuur, plaats agarose 3D Petri gerechten in een 24-well cultuur schotel en bedek ze met een milliliter BM. Laat de gerechten minstens 30 minuten in BM equiliberen in een 35 graden Celsius incubator, gooi de BM weg en herhaal het evenwicht nogmaals met één milliliter verse BM. Verwijder alle BM uit de put en afzien van 200 microliter verse BM rond, maar niet in het midden uitsparing van de 3D Petri schotel, dan verzamelen van de resterende BM uit het centrum cel zaaien uitsparing van de micro goed insert.Doe de eencellige suspensie in de middenuitsparing en triturate zachtjes op en neer. Plaats het gerecht in een bevochtigde 35 graden Celsius incubator voor cultuur. Op de volgende dag, langzaam en zorgvuldig te verwijderen bestaande media uit rond de agarose 3D Petri schotel en vervangen door een milliliter verse BM. De organoïden moeten 's nachts verdicht hebben, zodat ze aan de onderkant kunnen rusten.Voor de 3D ECM-cultuur moet u een eencellige suspensie voorbereiden door gelijke delen van de celsuspensie in BM te combineren met koude voor ontdooide ECM. Trituraat meerdere malen om ervoor te zorgen dat het goed gemengd. Dan onmiddellijk afzien van het mengsel in een vier-put kamer schuif, ervoor te zorgen dat het de hele bodem van de plaat bedekt.Broed de kamer dia's op 35 graden Celsius en laat de inhoud ervan te polymeriseren voor ten minste 30 minuten. Voeg na de polymerisatie 500 microliter BM toe bovenop de cultuur. Cultuur alle organoïde modeltypes op 35 graden Celsius.Voor alle cultuurtypes wisselt u de helft van hun media uit met verse BM om de twee dagen. Dit protocol werd gebruikt om organoïde generatie te bereiken binnen 24 uur met behulp van jonge murine testiculaire cellen. Met succes gegenereerde weefsels werden in eerste instantie waargenomen als 3D-celclusters.In ECM-omgevingen beschikten de celclusters duidelijke marges tussen het cluster en hun omgeving. Celclusters werden ook waargenomen om over de ECM te migreren en samen te smelten. De 3D ECM cultuur vergde aanzienlijk meer tijd om de novo structuren te assembleren dan alle andere cultuurmethoden.En de 3D ECM-vrije cultuur produceerde de grootste clusters met een enkele grote en compacte cluster binnen elke put van de 3D agarose Petri schotel. Om te beoordelen of de organoïde modellen lijken op het inheemse weefsel, werden de biologische constructies gesondeerd op celspecifieke markers en gevisualiseerd met immunofluorescentie. De 2D ECM en 3D ECM-vrije methoden geproduceerd organoïden met een innerlijke morfologie zeer mimetisch van testiculaire compartimentering.Een langetermijnanalyse werd uitgevoerd op de 3D ECM-vrije geassembleerde organoïden. De organoïden werden 14 dagen gekweekt en vervolgens onderzocht op cel- en structuurspecifieke markers. Tubule-achtige structuren werden waargenomen.De 3D ECM-vrije organoïden werden ook bestudeerd voor endocriene functie in een 12-weekse cultuur met gonadotropine stimulatie. Testosteron en inhibine B werden beide gekwantificeerd van organoïde geconditioneerd medium. Na 12 weken werden gonadotropinen gedurende 48 uur verwijderd, waardoor testosteron en inhibine B-concentraties daalden.Toen de gonadotropinen werden teruggestuurd, beide hormoonconcentraties aanzienlijk toegenomen, waaruit blijkt een goede endocriene responsiviteit. Organoïde assemblage maakt gebruik van het autonome gedrag van levensvatbare onrijpe testiculaire cellen. Creatieve experimenten kunnen gemakkelijk worden bedacht door het gebruik van aangepaste cel gesorteerd of hybride cel mengsels.Na celzaaien kan live video imaging of time-lapse imaging worden gebruikt om organoïde zelfassemblage te kwantificeren. Over cultuur heen kunnen organoïden en conditiemedium worden verzameld voor histologische en aminotestanalyses.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Generatie van genetisch gemodificeerde Organotypische Skin Culturen behulp gedevitaliseerde Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Bijhouden van menselijke adipeus afkomstige mesenchymale stamcellen in een Rat knie artrose Model met fluorescerende lipofiele membraan kleurstof

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Steiger-vrije, driedimensionale insuline uitdrukken Pancreatoids van muis alvleesklier voorlopercellen In Vitro generatie

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generatie van Organoids van muis Extrahepatic galwegen

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generatie van multicellulaire humane primaire Endometriale Organoïden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...