Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
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Ces travaux ont été financés par les National Institutes of Health, le National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, le National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 et 4UH3ES029073-03, et le Thomas J. Watkin’s Memorial Professorship.
Les auteurs remercient Eric W. Roth pour leur aide à la microscopie électronique de transmission. Ces travaux ont fait usage de l’installation BioCryo du NUANCE Center de l’Université Northwestern, qui a reçu le soutien de la Ressource expérimentale en nanotechnologie douce et hybride (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); le programme MRSEC (NSF DMR-1720139) au Materials Research Center; l’Institut international de nanotechnologie (IIN); et l’État de l’Illinois, par l’intermédiaire de l’IIN. Il a également utilisé l’équipement CryoCluster, qui a reçu le soutien du programme d’IRM (NSF DMR-1229693). Les graphiques de la figure 1 ont été conçus à l’aide BioRender.com.

Toutes les expériences sur les souris ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université Northwestern, et toutes les procédures ont été effectuées en vertu des protocoles approuvés par l’IACUC.
1. Préparation de solutions enzymatiques de dissociation tissulaire
<ol><li>Utilisez deux solutions enzymatiques différentes (Solution 1 et Solution 2), toutes deux fabriquées à l’aide d’une solution moyenne de culture...

Avec l’achèvement de ce protocole de génération organoïde, l’utilisateur aura quatre techniques de culture différentes à leur disposition pour l’assemblage de constructions testiculaires et organoïdes dans des environnements ECM ou ECM-free. Fait important, les quatre méthodes permettent au chercheur d’observer de façon non invasive l’auto-assemblage organoïde au fil du temps par imagerie ou enregistrement vidéo en accéléré, et de recueillir non invasivement des supports conditionnés pour l’ana...

Organoïdes testiculaires sont une technique pionnière pour étudier le développement testiculaire, spermatogenèse, et la physiologie in vitro1,2,3,4. Plusieurs méthodes ont été explorées pour la génération organoïde; il s’agit notamment d’une variété de systèmes de culture extracellulaire (ECM) et sans ECM, dans les deux dimensions (2D) et en trois dimensions (3D) orientations. Différentes méthodes de génération peuvent promouvoir des stratégies d’assemblage cellulaire distinctes; il en résulte un niveau élevé de variabilité morphologique et fonctionnelle entre les modèles organoïdes publiés. Le but de cet article est de discuter de l’état actuel des modèles testiculaires in vitro, et de servir de modèle pour les futurs chercheurs, lors de la conception d’expériences organoïdes testiculaires. Dans la présente étude, quatre archétypes différents du système culturel sont définis et caractérisés dans le processus expérimental et les résultats biologiques. Il s’agit notamment de: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, et 3D ECM méthodes de culture. Les stratégies présentées ici se veulent simples, accessibles et hautement reproductibles entre différents laboratoires et groupes de recherche.
Historiquement pour les testicules, la désignation « in vitro », a été utilisée pour plusieurs méthodes de culture différentes de tissus et de cellules testiculaires. Il s’agit notamment des méthodes organotypiques de culture des tissus et des organes (c.-à-d. la culture des explantations)5,de la culture isolée des tubules séminifères6,de la culture cellulaire testiculaire7et des méthodes de morphogenèse des tissus de novo (c.-à-d. constructions biologiques et organoïdes)1. Les premières investigations sur la spermatogenèse in vitro ont été réalisées il y a environ 100 ans, avec la culture des explants de testicules de lapin en 19208,et plus tard en 1937 avec des explants de souris9. Dans ces expériences initiales spermatogonia ont été observés pour dégénérer en grande partie au cours de la première semaine de culture, bien que certaines cellules meiotically différenciation ont été identifiés. Rappelant ces rapports historiques, la culture d’explantation de testis a été relancée et optimisée en 2011 pour devenir une technique réalisable pour étudier le testis10. Depuis 2011, la culture d’explant a produit le sperme compétent de fertilité dans les rapportsmultiples 11,,12,,13. Pourtant, en raison de la dépendance de la culture d’explantation sur les tubules indigènes préexistants de testicule, ces avances récentes sont plus exactement décrites comme exemples de fonction testiculaire « ex vivo » et de spermatogenèse, fonction tissulaire qui a été maintenue ou reprise lors de l’enlèvement du corps d’un organisme. En dépit de sa prédominance dans la littérature, le maintien et la différenciation à long terme de cellules germinales dans les explants testiculaires est difficilede reproduire 14,,15,,16,,17,,18,particulièrement au-dessus des périodes assez longues pour observer entièrement la spermatogenèse in vitro (~35 jours chez lessouris 19 et 74 chez l’homme20). Il est fascinant d’apprécier que bon nombre des mêmes défis rencontrés il ya 100 ans, sont encore expérimentés dans ex vivo spermatogenesis aujourd’hui.
Différents des approches ex vivo, les organoïdes testiculaires sont des microtissues assemblés de novo générés entièrement in vitro à partir de sources cellulaires (c.-à-d. cellules testiculaires primaires). Les organoïdes testiculaires fournissent une stratégie créative pour contourner la dépendance historique du champ à l’égard des tissus indigènes préexistants, et pour récapituler la biologie testiculaire complètement in vitro. Il existe de multiples exigences partagées par la plupart des modèles de tissus organoïdes; il s’agit notamment (1) de morphologie ou d’architecture des tissus in vivo-mimétiques, (2) de multiples types cellulaires majeurs du tissu représenté, (3) d’auto-assemblage ou d’auto-organisation dans leur génération, et (4) la capacité de simuler un certain niveau de la fonction et de la physiologie du tissureprésenté 21,22,23,24. Pour les testicules, cela peut être capturé en quatre grandes caractéristiques : (1) l’inclusion de principaux types de cellules testiculaires, germe, Sertoli, Leydig, cellules péritubulaires et autres cellules interstitielles, (2) assemblage de tissus dirigés par cellules, (3) types de cellules compartimentées de façon appropriée dans des compartiments tubulaires distincts (germe et Sertoli) et régions interstitielles (tous les autres types de cellules), et (4) un certain degré de fonction tissulaire (p. ex., sécrétion d’hormones reproductrices ou réponses tissulaires, et maintien et différenciation des cellules germinales). Compte tenu des défis historiques liés au maintien de la différenciation des cellules germinales ex vivo et in vitro, la récapitulation d’architectures testiculaires in vivo-mimétiques (c.-à-d. structures ressemblant à des tubules séminifères) avec des marqueurs supplémentaires suggérant la simulation de la physiologie testiculaire (p. ex., fonction endocrinienne), sont des étapes prioritaires vers la génération d’organoïdes qui pourraient un jour soutenir la spermatogenèse in vitro.
La majorité des méthodes organoïdes testiculaires publiées profitent de l’ECM disponible dans le commerce (p. ex., collagène ou formulations brevetées d’ECM)25,26,27 ou des ECM sur mesure (c.-à-d. hydrogels dérivés de testis décellularisés)28,29,30. L’ECM exogène favorise la formation de tissus de novo en fournissant un échafaudage de soutien à l’assemblage pour la génération de tissus. Les méthodes d’ECM ont offert un niveau impressionnant de formation de tissu, y compris une certaine présence de cellules germinales et la morphologie tissu-mimétique25,28. Toutefois, les ECM qu’ils utilisent ne sont pas toujours universellement disponibles (c.-à-d. hydrogels dérivés de l’ECM décellularisés), et certaines méthodes nécessitent des orientations sophistiquées en gel et en semis cellulaires (p. ex., gradients de 3 couches d’ECM et d’impression 3D)25,31,32. Les méthodes sans échafaudage (p. ex., chute suspendue et plaques de culture non hémorentes)33,34,35 ontégalement généré des organoïdes robustes et hautement reproductibles sans avoir besoin de gels ecm ou d’échafaudages. Cependant, la morphologie tissulaire de ces organoïdes sans échafaudage est souvent différente des testicules in vivo, et la plupart de ces rapports intègrent un additif biochimique ecm pour promouvoir la formationdes tissus 33,34,36, ou alternativement, compter sur la centrifugation pour l’agrégation cellulaire forcée et le compactage34, ce qui les rend moins idéal pour étudier la migration dirigée par cellules et l’auto-organisation.
Les quatre méthodes de génération organoïde présentées dans ce manuscrit comprennent à la fois des stratégies dépendantes de l’ECM et des stratégies indépendantes, chacune utilisant un ensemencement cellulaire simple qui permet l’observation de l’auto-assemblage organoïde conduit par cellules. Les quatre techniques peuvent être exécutées à partir des mêmes suspensions cellulaires ou peuvent faire usage de populations enrichies personnalisées et de type cellulaire. Une force de ces méthodes est la capacité d’observer les organoïdes s’auto-assembler en temps réel, et de comparer directement comment les structures testiculaires s’auto-assemblent entre différents microenvironnements de culture. Les différences phénotypiques entre ces quatre méthodes culturelles devraient être prises en considération pour leur impact sur la question de recherche ou le sujet de l’investigateur. Chaque méthode produit des constructions biologiques ou organoïdes dans les 24 h ou moins. En conclusion, les méthodes présentées ici fournissent une boîte à outils des techniques d’assemblage organoïde pour étudier l’assemblage organoïde testiculaire, le développement tissulaire, et la physiologie testiculaire in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Les organoïdes testiculaires fournissent un outil pour étudier in vitro le développement testiculaire, la spermatogenèse et l’endocrinologie. Plusieurs méthodes ont été développées afin de créer des organoïdes testiculaires. Beaucoup de ces méthodes reposent sur la matrice extracellulaire (ECM) pour favoriser l’assemblage des tissus de novo, cependant, il existe des différences entre les méthodes en termes de morphologie biomimétique et la fonction des tissus. En outre, il existe peu de comparaisons directes des méthodes publiées. Ici, une comparaison directe est faite en étudiant les différences dans les protocoles de génération organoïde, avec des résultats fournis. Quatre méthodes de génération archétypales : (1) sans ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) sans ECM 3D, et (4) culture ECM 3D sont décrites. Trois repères primaires ont été utilisés pour évaluer la génération organoïde testiculaire. Il s’est agi de l’auto-assemblage cellulaire, de l’inclusion des principaux types de cellules (Sertoli, Leydig, germes et cellules péritubulaires) et de l’architecture tissulaire compartimentée de façon appropriée. Des quatre environnements testés, les cultures 2D ECM et 3D sans ECM ont généré des organoïdes avec des morphologies internes les plus similaires aux testicules indigènes, y compris la compartimentation de novo des types tubulaires par rapport aux cellules interstitielles, le développement de structures tubules-like, et une fonction endocrinienne établie à long terme. Toutes les méthodes étudiées utilisaient des suspensions cellulaires testiculaires primaires non triées et utilisaient des ressources de culture couramment accessibles. Ces techniques testiculaires de génération d’organoïdes fournissent une boîte à outils hautement accessible et reproductible pour les initiatives de recherche sur l’organogenèse testiculaire et la physiologie in vitro.

La génération organoïde a été considérée comme infructueuse si les cellules testiculaires ne se sont pas auto-assembler dans les 72 h de culture, cependant, toutes les méthodes présentées ici se réunissent dans les 24 h lors de l’utilisation de cellules murines juvéniles (5 dpp). Échec de la génération de construction biologique présentée comme une continuation des cellules librement suspendues (colonne de 0 h dans la figure 1)même après culture étendue (72 h). En l’a...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ici, quatre méthodes pour générer des organoïdes testiculaires à partir des cellules testiculaires murines néonatales primaires sont décrites, c’est-à-dire la matrice extracellulaire (ECM) et les environnements de culture 2D et 3D exempts d’ECM. Ces techniques ont de multiples applications de recherche et sont particulièrement utiles pour étudier le développement testiculaire et la physiologie in vitro.

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Ces protocoles permettent à l’utilisateur de produire un grand nombre d’organoïdes testiculaires fonctionnels structurellement mimétiques et endocriniens dans des environnements exempts d’ECM et de DCM dans des conditions de culture 2D ou 3D. Ces techniques sont hautement reproductibles, facilement appliquées aux laboratoires biologiques standards, et n’utilisent que des outils et des matériaux communs. Les organoïdes testiculaires sont un nouvel outil pour simuler la spermatogenèse et l’endocrinologie reproductive in vitro, et pourraient un jour permettre l’étude de la gametogenèse in vitro.Commencez par placer la sulfpine euthanasie de souris sur un tapis de dissection et stérilisant l’abdomen avec 70% d’éthanol. Tentez la peau du bas-ventre avec des forceps et ouvrez-la avec des ciseaux. Localiser les testicules dans les régions inguinales inférieures gauche et droite de l’abdomen et couper leurs connexions aux déférents de vas et à tout tissu conjonctif d’ancrage.Puis soulevez les testicules entiers de l’animal. Placez-le dans une boîte de Pétri de BM pré-équilibré. Sous un microscope à dissection, faire une petite incision dans la tunica albuginea à une extrémité de chaque testicule avec soit de petits ciseaux de micro dissection ou en déchirant doucement avec deux forceps fins. Tout en tenant le testicule de l’extrémité opposée de l’incision, serrez-le doucement avec des forceps fins et poussez dans un mouvement de balayage vers le trou dans la tunica, qui libérera le tissu testiculaire comme pièce cohésive.Couper le tissu en petits morceaux. Placez les morceaux en un millilitre de solution de dissociation d’avant-guerre et incubez-les à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Après l’incubation, triturer délicatement les morceaux de testicules 50 fois avec une pipette P1000.Assurez-vous que les tubules se séparent les uns des autres et du tissu interstitiel. S’il reste des touffes, incuber pendant cinq minutes supplémentaires et triturer à nouveau. Ajouter 33 microlitres de solution de bouillon d’hyaluronidase par millilitre du mélange de dissociation.Puis triturer 50 fois avec une pipette P1000 et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Après l’incubation, triturer 50 fois avec une pipette P200. Après s’être assuré qu’il n’y a pas de tubules visibles ou de touffes de cellules, étanchez les enzymes de dissociation en ajoutant du FBS à 10 % du volume total de l’échantillon et triturez-le plusieurs fois avec une pipette P200.Mouillez le centre d’une passoire à cellules de 40 micromètres avec du média et aspirez-le, puis ajoutez l’échantillon à la passoire prémét mouillée et filtrez-le pour produire une suspension à cellule unique. Centrifuger la suspension à 100 fois g pendant sept minutes. Jetez le supernatant et resuspendez les cellules dans bm frais. Comptez les cellules viables sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue trypan, puis re-centrifugeuse et les résuspendez en BM frais. Pour une culture sans ECM 2D, plaquez les suspensions à cellule unique directement sur les glissières de chambre à quatre puits et placez les glissières dans un incubateur de 35 degrés Celsius.Pour la culture ecm 2D, distribuez 100 microlitres de liquide matriciel extracellulaire dilué froid en un seul milieu de matrice dilué dans une glissière de chambre de quatre puits, en veillant à ce que le gel couvre le fond du plat. Placez la lame dans l’incubateur pendant au moins 30 minutes pour permettre à l’ECM de polymériser dans un gel, puis ajoutez la suspension cellulaire sur le dessus. Pour une culture 3D sans ECM, placez les boîtes de Pétri 3D surgi dans un plat de culture de 24 puits et couvrez-les d’un millilitre de BM. Laissez les plats s’équilibrer en BM pendant au moins 30 minutes dans un incubateur de 35 degrés Celsius, puis jetez le BM et répétez l’équilibrage une fois de plus avec un millilitre de BM frais. Retirez tous les BM du puits et distribuez 200 microlitres de BM frais autour mais pas à l’intérieur de l’évidement central de la boîte de Pétri 3D, puis recueillez n’importe quel BM restant de l’intérieur de la cavité centrale d’ensemencement de cellules du micro insert de puits.Distribuez la suspension à cellule unique dans l’évidement central et triturez doucement de haut en bas. Placez le plat dans un incubateur humidifié de 35 degrés Celsius pour la culture. Le lendemain, retirez lentement et soigneusement les supports existants autour de la boîte de Pétri 3D agarose et remplacez-les par un millilitre de BM frais. Les organoïdes auraient dû se compacter pendant la nuit, ce qui leur permet de se reposer au fond.Pour la culture ECM 3D, préparez une suspension à cellule unique en combinant des parties égales de la suspension cellulaire en BM avec de l’ECM prégelé à froid. Triturer plusieurs fois pour s’assurer qu’il est bien mélangé. Ensuite, distribuez immédiatement le mélange dans une glissière de chambre de quatre puits, en s’assurant qu’il couvre tout le fond de la plaque.Incuber la chambre glisse à 35 degrés Celsius et laisser son contenu polymériser pendant au moins 30 minutes. Après la polymérisation, ajouter 500 microlitres de BM au-dessus de la culture. Culture tous les types de modèles organoïdes à 35 degrés Celsius.Pour tous les types de culture, échangez la moitié de leurs médias avec bm frais tous les deux jours. Ce protocole a été employé pour réaliser la génération organoïde dans les 24 heures utilisant les cellules testiculaires juvéniles de murine. Les tissus générés avec succès ont été au commencement observés en tant que faisceaux de cellules 3D.Dans les environnements ECM, les grappes cellulaires possédaient des marges claires entre le cluster et leur environnement environnant. On a également observé que les grappes cellulaires migrent à travers l’ECM et fusionnent ensemble. La culture 3D ECM a nécessité beaucoup plus de temps pour assembler des structures de novo que toutes les autres méthodes de culture.Et la culture 3D sans ECM a produit les plus grands clusters avec un seul cluster grand et compact dans chaque puits de la boîte de Pétri agarose 3D. Pour évaluer si les modèles organoïdes ressemblent au tissu indigène, les constructions biologiques ont été sondées pour des marqueurs spécifiques aux cellules et visualisées avec l’immunofluorescence. Les méthodes 2D ECM et 3D ECM-free ont produit des organoïdes avec une morphologie interne fortement mimétique de compartimentation testiculaire.Une analyse à long terme a été effectuée sur les organoïdes assemblés sans ECM 3D. Les organoïdes ont été cultivés pendant 14 jours, puis sondés pour des marqueurs cellulaires et spécifiques à la structure. Des structures en comme des tubules ont été observées.Les organoïdes sans ECM 3D ont également été étudiés pour la fonction endocrinienne dans une culture de 12 semaines avec la stimulation de gonadotropine. La testostérone et l’inhibine B ont été quantifiées du milieu organoïde-conditionné. Après 12 semaines, des gonadotropines ont été enlevées pendant 48 heures, causant des concentrations de testostérone et d’inhibine B pour diminuer.Quand les gonadotropines ont été retournées, les deux concentrations d’hormone ont sensiblement augmenté, démontrant la réactivité endocrinienne appropriée. L’assemblage organoïde tire parti du comportement autonome des cellules testiculaires immatures viables. Des expériences créatives peuvent être facilement conçues en utilisant des mélanges cellulaires triés sur mesure ou hybrides.Après l’ensemencement cellulaire, l’imagerie vidéo en direct ou l’imagerie en accéléré peuvent être utilisées pour quantifier l’auto-assemblage organoïde. Dans toute la culture, les organoïdes et le milieu de l’état peuvent être recueillis pour des analyses d’analyse histologique et amino.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ex Utero L&#39;électroporation et organotypiques Slice culture de souris hippocampe Tissue

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Recherche

Biologie du développement

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