Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health, dem National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dem National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 und 4UH3ES029073-03 und der Thomas J. Watkin es Memorial Professorship finanziert.
Die Autoren danken Eric W. Roth für die Unterstützung bei der Transmissionselektronenmikroskopie. Diese Arbeit wurde von der BioCryo-Anlage des NUANCE Center der Northwestern University genutzt, die von der Soft and Hybrid Nanotechnology Experimental (SHyNE) Resource (NSF ECCS-1542205) unterstützt wurde. das MRSEC-Programm (NSF DMR-1720139) am Materials Research Center; das Internationale Institut für Nanotechnologie (IIN); und dem Staat Illinois durch die IIN. Es nutzt auch die CryoCluster-Ausrüstung, die vom MRT-Programm (NSF DMR-1229693) unterstützt wurde. Grafiken in Abbildung 1 wurden mit BioRender.com entworfen.

Alle Mausexperimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Northwestern University genehmigt, und alle Verfahren wurden nach von der IACUC zugelassenen Protokollen durchgeführt.
1. Vorbereitung von enzymatischen Gewebedissoziationslösungen
<ol><li>Verwenden Sie zwei verschiedene enzymatische Lösungen (Lösung 1 und Lösung 2), die beide mit einer Basalkultur-Medium-Lösung (BM) hergestellt werden.</li>
	<li>Zur Herstellung von BM serum und penicillin-streptomy...

Mit der Fertigstellung dieses Organoid-Generierungsprotokolls stehen dem Benutzer vier verschiedene Kulturtechniken für die Montage von Hodenkonstrukten und Organoiden in ECM- oder ECM-freien Umgebungen zur Verfügung. Wichtig ist, dass alle vier Methoden es dem Forscher ermöglichen, die organoide Selbstmontage im Laufe der Zeit durch Zeitraffer-Bildgebung oder Videoaufzeichnung nicht-invasiv zu beobachten und konditionierte Medien für die Analyse von abgesonderten Hormonen und Zytokinen zu sammeln, ohne das Gewebe w?...

Hodenorganoide sind eine bahnbrechende Technik zur Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Physiologie in vitro1,2,3,4. Mehrere Methoden wurden für die Organoid-Generierung erforscht; Dazu gehören eine Vielzahl von extrazellulären Matrix- (ECM) und ECM-freien Kultursystemen, sowohl in zweidimensionalen (2D) als auch dreidimensionalen (3D) Ausrichtungen. Unterschiedliche Erzeugungsmethoden können unterschiedliche zelluläre Montagestrategien fördern; Dies führt zu einer hohen morphologischen und funktionellen Variabilität zwischen veröffentlichten Organoidmodellen. Der Zweck dieses Artikels ist es, den aktuellen Zustand von In-vitro-Hodenmodellen zu diskutieren und als Vorlage für zukünftige Forscher bei der Entwicklung von Hodenorganoidexperimenten zu dienen. In der vorliegenden Studie werden vier verschiedene Kultursystemarchetypen definiert und in experimentellen Prozess- und biologischen Ergebnissen charakterisiert. Dazu gehören: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free und 3D ECM Kulturmethoden. Die hier vorgestellten Strategien sollen einfach, zugänglich und zwischen verschiedenen Laboratorien und Forschungsgruppen hochgradig reproduzierbar sein.
Historisch für die Hoden, die Bezeichnung "in vitro", wurde für mehrere verschiedene Kulturmethoden von Hodengeweben und -zellen verwendet. Dazu gehören organotypische Gewebe-/Organkulturmethoden (d.h. Explantkultur)5, isolierte seminiferöse Tubulenkultur6, Hodenzellkultur7und Methoden der de novo Gewebemorphogenese (d.h. biologische Konstrukte und Organoide)1. Die ersten Untersuchungen zur In-vitro-Spermatogenese wurden vor etwa 100 Jahren mit der Kultur der Kaninchen-Hodenexplantationen 19208und später 1937 mit Mausexplantationen9durchgeführt. Innerhalb dieser ersten Experimente wurden Spermatogonien beobachtet, die in der ersten Kulturwoche weitgehend degenerierten, obwohl einige meiotisch differenzierende Zellen identifiziert wurden. Erinnert an diese historischen Berichte, wurde die Testis-Explantationskultur 2011 wiederbelebt und optimiert, um eine praktikable Technik zum Studium der Hoden10zu werden. Seit 2011 hat explant kultur Fruchtbarkeit kompetente Spermien in mehreren Berichten produziert11,12,13. Doch aufgrund der Abhängigkeit der Explant-Kultur von bereits existierenden nativen Hobules werden diese jüngsten Fortschritte genauer als Beispiele für "ex vivo" Hodenfunktion und Spermatogenese beschrieben, Gewebefunktion, die bei der Entfernung aus dem Körper eines Organismus beibehalten oder wieder aufgenommen wurde. Trotz seiner Prävalenz in der Literatur, langfristige Keimzellerhaltung und Differenzierung innerhalb hoden Explants ist eine Herausforderung zu replizieren14,15,16,17,18, vor allem über Zeitrahmen lang genug, um vollständig zu beobachten In-vitro-Spermatogenese (35 Tage bei Mäusen19 und 74 beim Menschen20). Es ist faszinierend zu erkennen, dass viele der gleichen Herausforderungen, die vor 100 Jahren erlebt wurden, noch heute in der ex vivo Spermatogenese erlebt werden.
Im Unterscheidet sich von Ex-vivo-Ansätzen sind Hodenorganoide de novo zusammengesetzte Mikrotissues, die vollständig in vitro aus zellulären Quellen (d. h. primären Hodenzellen) erzeugt werden. Hodenorganoide bieten eine kreative Strategie, um die historische Abhängigkeit des Feldes von bereits vorhandenem nativem Gewebe zu umgehen und die Hodenbiologie vollständig in vitro zu rekapitulieren. Es gibt mehrere Anforderungen, die von den meisten organoiden Gewebemodellen geteilt werden; Dazu gehören (1) in vivo-mimetische Gewebemorphologie oder Architektur, (2) mehrere Hauptzelltypen des dargestellten Gewebes, (3) Selbstmontage oder Selbstorganisation in ihrer Erzeugung und (4) die Fähigkeit, eine gewisse Ebene der Funktion des dargestellten Gewebes und der Physiologie zu simulieren21,22,23,24. Für die Hoden kann dies in vier Hauptmerkmalen erfasst werden: (1) die Einbeziehung von Haupthodenzelltypen, Keim, Sertoli, Leydig, peritubular und andere interstitielle Zellen, (2) zellgesteuerte Gewebeanordnung, (3) entsprechend kompartalisierte Zelltypen in separate röhrenförmige Kompartimente (Keim und Sertoli) und interstitielle Regionen (alle anderen Zelltypen) und (4) ein gewisses Maß an Gewebefunktion (z. B. Reproduktivhormonsekretion oder Gewebereaktionen und Zellabhängigkeit). Unter Berücksichtigung der historischen Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Keimzelldifferenzierung ex vivo und in vitro sind die Rekapitulation in vivo-mimetischer Hodenarchitekturen (d. h. Strukturen, die seminiferous tubulis ähneln) mit zusätzlichen Markern, die auf die Simulation der Hodenphysiologie (z. B. endokrine Funktion) hindeuten, vorrangige Meilensteine zur Erzeugung von Organoiden, die eines Tages die in vitro erhaltene Spermatogenese aufrechterhalten könnten.
Die meisten veröffentlichten Hodenorganoid-Methoden nutzen kommerziell erhältliche ECM (z.B. Kollagen oder proprietäre ECM-Formulierungen)25,26,27 oder kundenspezifische ECMs (d.h. dezelluläre Hoden ECM-abgeleitete Hydrogele)28,29,30. Exogenes ECM fördert die De-Novo-Gewebebildung durch bereitstellung eines Montage-unterstützenden Gerüstes für die Gewebebildung. ECM-Methoden haben ein beeindruckendes Maß an Gewebebildung ermöglicht, einschließlich einiger Keimzellpräsenz und gewebemimetischer Morphologie25,28. Die von ihnen verwendeten ECMs sind jedoch nicht immer universell verfügbar (d. h. dezellularisierte ECM-abgeleitete Hydrogele), und einige Methoden erfordern ausgeklügelte Gel- und Zellsaatausrichtungen (z. B. 3-Schicht-Gradienten des ECM- und 3D-Drucks)25,31,32. Gerüstfreie Methoden (z.B. hängende Tropfen und nicht haftende Kulturplatten)33,34,35 haben auch robuste und hoch reproduzierbare Organoide ohne ECM-Gele oder Gerüste erzeugt. Jedoch, die Gewebemorphologie dieser Gerüst-freien Organoide ist oft unähnlich zu in vivo Hoden, und die meisten dieser Berichte enthalten eine biochemische ECM-Additiv zur Förderung der Gewebebildung33,34,36, oder alternativ, verlassen sich auf Zentrifugierung für erzwungene Zellaggregation und Verdichtung34, so dass sie weniger ideal für die Untersuchung zellgesteuerte Migration und Selbstorganisation.
Die vier in diesem Manuskript vorgestellten Organoid-Generierungsmethoden umfassen sowohl ECM-abhängige als auch unabhängige Strategien, die jeweils eine einfache Zellaussaat verwenden, die die Beobachtung der zellgesteuerten organoiden Selbstmontage ermöglicht. Alle vier Techniken können aus denselben Zellsuspensionen ausgeführt werden oder benutzerdefinierte und zelltypangereicherte Populationen verwenden. Eine Stärke dieser Methoden ist die Fähigkeit, Organoide in Echtzeit selbst zu beobachten und direkt zu vergleichen, wie hodenförmige Strukturen sich zwischen verschiedenen Kulturmikroumgebungen selbst zusammensetzen. Die phänotischen Unterschiede zwischen diesen vier Kulturmethoden sollten wegen ihrer Auswirkungen auf die Forschungsfrage oder das Thema des Prüfers berücksichtigt werden. Jede Methode produziert biologische Konstrukte oder Organoide innerhalb von 24 h oder weniger. Zusammenfassend lassen sich sagen, dass die hier vorgestellten Methoden ein Toolkit von organoiden Montagetechniken zum Studium der Hodenorganoid-Montage, Gewebeentwicklung und Hodenphysiologie in vitro bieten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Hodenorganoide bieten ein Werkzeug für die Untersuchung der Hodenentwicklung, Spermatogenese und Endokrinologie in vitro. Mehrere Methoden wurden entwickelt, um Hodenorganoide zu erstellen. Viele dieser Methoden verlassen sich auf extrazelluläre Matrix (ECM), um de novo Gewebe-Montage zu fördern, jedoch gibt es Unterschiede zwischen Denkmethoden in Bezug auf biomimetische Morphologie und Funktion des Gewebes. Darüber hinaus gibt es nur wenige direkte Vergleiche veröffentlichter Methoden. Hier wird ein direkter Vergleich durch die Untersuchung von Unterschieden in Organoid-Generierungsprotokollen, mit bereitgestellten Ergebnissen gemacht. Vier archetypische Erzeugungsmethoden: (1) 2D ECM-frei, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-frei und (4) 3D-ECM-Kultur werden beschrieben. Zur Beurteilung der Hodenorganoid-Erzeugung wurden drei primäre Benchmarks verwendet. Dabei handelt es sich um zelluläre Selbstmontage, Die Einbeziehung wichtiger Zelltypen (Sertoli, Leydig, Keime und peritubäre Zellen) und entsprechend abgeschottete Gewebearchitektur. Von den vier getesteten Umgebungen erzeugten 2D ECM- und 3D-ECM-freie Kulturen Organoide mit internen Morphologien, die nativen Hoden am ähnlichsten sind, einschließlich der De-Novo-Abschottung von röhrenförmigen versus interstitiellen Zelltypen, der Entwicklung von Tubule-ähnlichen Strukturen und einer etablierten langfristigen endokrinen Funktion. Alle untersuchten Methoden nutzten unsortierte, primäre murine Hodenzellsuspensionen und nutzten allgemein zugängliche Kulturressourcen. Diese Hodenorganoid-Generierungstechniken bieten ein hochzugängliches und reproduzierbares Toolkit für Forschungsinitiativen zur Hodenorganogenese und Physiologie in vitro.

Organoide Erzeugung wurde als erfolglos, wenn Hodenzellen nicht selbst-assemble innerhalb 72 h der Kultur, jedoch, alle Methoden hier präsentiert montieren innerhalb von 24 h bei der Verwendung von juvenilen (5 dpp) murinen Zellen. Versagen der biologischen Konstrukterzeugung als Fortsetzung frei schwebender Zellen dargestellt (0 h Spalte in Abbildung 1) auch nach erweiterter Kultur (72 h). In Ermangelung einer Gewebeselbstmontage dispergierten sich alle scheinbaren Zellcluster bei schonend...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Hier werden vier Methoden zur Erzeugung von Hodenorganoiden aus primären neonatalen murinen Hodenzellzellen beschrieben, d.h. extrazelluläre Matrix (ECM) und ECM-freie 2D- und 3D-Kulturumgebungen. Diese Techniken haben mehrere Forschungsanwendungen und sind besonders nützlich für das Studium der Hodenentwicklung und Physiologie in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based und Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Hodenorganoide

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Diese Protokolle ermöglichen es dem Anwender, eine große Anzahl von strukturell mimetischen und endokinen funktionellen Hodenorganoiden sowohl in ECM- als auch in DCM-freien Umgebungen unter 2D- oder 3D-Kulturbedingungen herzustellen. Diese Techniken sind sehr reproduzierbar, leicht auf biologische Standardlaboreinstellungen anzuwenden und verwenden nur gängige Werkzeuge und Materialien. Hodenorganoide sind ein neuartiges Werkzeug zur Simulation der Spermatogenese und der reproduktiven Endokrinologie in vitro und könnten eines Tages die Untersuchung der In-vitro-Gametogenese ermöglichen.Beginnen Sie, indem Sie die eingeschläferte Maus-Supine auf eine Seziermatte legen und den Bauch mit 70% Ethanol sterilisieren. Die Haut des Unterbauchs mit Zangen aufstellen und mit einer Schere öffnen. Suchen Sie die Hoden in den unteren linken und rechten Leistenregionen des Bauches und schneiden Sie ihre Verbindungen zu den Vas deferens und jedem verankernden Bindegewebe.Dann heben Sie die gesamten Hoden vom Tier. Legen Sie es in eine Petrischale aus vorausgeglichenen BM. Unter einem Seziermikroskop einen kleinen Schnitt in der Tunika albuginea an einem Ende jedes Hodens entweder mit einer kleinen Mikrosektionsschere oder durch sanftes Reißen mit zwei feinen Zangen machen. Während Sie die Hoden vom anderen Ende des Einschnitts halten, drücken Sie sie vorsichtig mit feiner Zange und schieben Sie sie in einer schwungvollen Bewegung in Richtung des Lochs in der Tunika, das das Hodengewebe als ein kohäsives Stück freisetzt.Schneiden Sie das Gewebe in kleinere Stücke. Legen Sie die Stücke in einen Milliliter Vorwärmedissoziationslösung ein und bebrüten Sie sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Nach der Inkubation die Hodenstücke 50 Mal mit einer P1000 Pipette sanft trituieren.Stellen Sie sicher, dass sich die Tubuli voneinander und vom interstitiellen Gewebe trennen. Wenn Klumpen bleiben, für weitere fünf Minuten inkubieren und wieder trituieren. Fügen Sie 33 Mikroliter Hyaluronidase-Stammlösung pro Milliliter der Dissoziationsmischung hinzu.Dann trituieren Sie 50 Mal mit einer P1000 Pipette und inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach der Inkubation 50 Mal mit einer P200 Pipette trituieren. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass keine sichtbaren Tubuli oder Zellklumpen vorhanden sind, löschen Sie die Dissoziationsenzyme, indem Sie FBS zu 10 % des Gesamtvolumens der Probe hinzufügen und sie mehrmals mit einer P200-Pipette trituieren.Befeuchten Sie die Mitte eines 40-Mikrometer-Zellsiebes mit Medien und aspirieren Sie es weg, fügen Sie die Probe dann dem vorbenetzten Sieb hinzu und filtern Sie sie, um eine einzellige Suspension zu erzeugen. Zentrifugieren Sie die Suspension bei 100 mal g für sieben Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in frischem BM wieder auf. Zählen Sie die lebensfähigen Zellen auf einem Hämozytometer mit Trypanblau-Ausschluss, dann zentrifugieren und setzen Sie sie in frischem BM wieder aus. Für 2D ECM-freie Kultur, Platte einzellige Suspensionen direkt auf Vier-Well-Kammer-Dias und legen Sie die Dias in einem 35 Grad Celsius Inkubator.Für die 2D-ECM-Kultur 100 Mikroliter kaltes eins-zu-eins verdünntes extrazelluläres Matrixmedium in eine Vier-Well-Kammerrutsche geben, um sicherzustellen, dass das Gel den Tellerboden bedeckt. Legen Sie das Dia für mindestens 30 Minuten in den Inkubator, damit das ECM in ein Gel polymerisiert, und fügen Sie dann die Zellsuspension oben hinzu. Für eine 3D ECM-freie Kultur, legen Sie Agarose 3D Petri-Gerichte in ein 24-Well-Kulturgericht und decken Sie sie mit einem Milliliter BM. Lassen Sie die Gerichte in BM für mindestens 30 Minuten in einem 35 Grad Celsius Inkubator aushalten, dann entsorgen Sie die BM und wiederholen Sie die Ausgleiche noch einmal mit einem Milliliter frischer BM. Entfernen Sie alle BM aus dem Brunnen und geben Sie 200 Mikroliter frische BM um, aber nicht innerhalb der mittleren Aussparung der 3D Petrischale, dann sammeln Sie alle verbleibenden BM aus dem Inneren der Mittleren Zelle Saat aus dem Mikrobrunneneinsatz.Geben Sie die einzellige Aufhängung in die mittlere Aussparung und trituieren Sie sanft nach oben und unten. Legen Sie das Gericht in einen befeuchteten 35 Grad Celsius Brutkasten für Kultur. Am nächsten Tag, langsam und sorgfältig entfernen vorhandene Medien aus der Agarose 3D Petrischale und ersetzen mit einem Milliliter frischen BM. Die Organoide sollten über Nacht verdichtet haben, so dass sie am Boden ruhen können.Für die 3D-ECM-Kultur bereiten Sie eine einzellige Suspension vor, indem Sie gleiche Teile der Zellsuspension in BM mit kaltem vorgetautem ECM kombinieren. Trituieren Sie mehrmals, um sicherzustellen, dass es gut gemischt ist. Geben Sie das Gemisch dann sofort in eine Vier-Well-Kammerrutsche, um sicherzustellen, dass es den gesamten Boden der Platte bedeckt.Inkubieren Sie die Kammer bei 35 Grad Celsius und lassen Sie ihren Inhalt für mindestens 30 Minuten polymerisieren. Nach der Polymerisation 500 Mikroliter BM zusätzlich zur Kultur hinzufügen. Kultur alle organoiden Modelltypen bei 35 Grad Celsius.Für alle Kulturtypen tauschen Sie alle zwei Tage die Hälfte ihrer Medien mit frischem BM aus. Dieses Protokoll wurde verwendet, um organoide Erzeugung innerhalb von 24 Stunden mit juvenilen murinhorischen Hodenzellen zu erreichen. Erfolgreich erzeugtes Gewebe wurde zunächst als 3D-Zellcluster beobachtet.In ECM-Umgebungen besaßen die Zellcluster klare Ränder zwischen dem Cluster und seiner Umgebung. Zellcluster wurden auch beobachtet, um über das ECM zu migrieren und miteinander zu verschmelzen. Die 3D-ECM-Kultur benötigte deutlich mehr Zeit, um de novo-Strukturen zusammenzustellen als alle anderen Kulturmethoden.Und die 3D-ECM-freie Kultur produzierte die größten Cluster mit einem einzigen großen und kompakten Cluster in jedem Brunnen der 3D-Agarose Petrischale. Um zu beurteilen, ob die Organoidmodelle dem nativen Gewebe ähneln, wurden die biologischen Konstrukte auf zellspezifische Marker untersucht und mit Immunfluoreszenz visualisiert. Die 2D-ECM- und 3D-ECM-freien Methoden produzierten Organoide mit einer inneren Morphologie, die die Hodenkompartimentialisierung stark mimetisch war.Eine Langzeitanalyse wurde an den 3D ECM-freien zusammengesetzten Organoiden durchgeführt. Die Organoide wurden 14 Tage lang kultiviert und dann auf zell- und strukturspezifische Marker untersucht. Tubule-ähnliche Strukturen wurden beobachtet.Die 3D ECM-freien Organoide wurden auch für die endokrine Funktion in einer 12-Wochen-Kultur mit Gonadotropin Stimulation untersucht. Testosteron und Inhibin B wurden beide aus organoid-konditionierten Medium quantifiziert. Nach 12 Wochen, Gonadotropine wurden für 48 Stunden entfernt, was testosteron und Inhibin B-Konzentrationen zu verringern.Wenn die Gonadotropine zurückgegeben wurden, beide Hormonkonzentrationen deutlich erhöht, zeigt richtige endokrine Reaktionsfähigkeit. Organoid-Montage nutzt das autonome Verhalten lebensfähiger unreifer Hodenzellen. Kreative Experimente lassen sich einfach mit kundenspezifischen zellsortierten oder hybriden Zellmischungen entwickeln.Nach der Zellaussaat können Live-Videoaufnahmen oder Zeitraffer-Bildgebungen zur Quantifizierung der organoiden Selbstmontage verwendet werden. Kulturübergreifend können Organoide und Konditionsmedium für histologische und Amino-Assay-Analysen gesammelt werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Herstellung von genetisch veränderten Organotypische Hautkulturen Mit devitalisierten Menschen Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Bewertung von Verletzungen-Induzierte Seneszenz und In Vivo eine Anpassung in der Skelettmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking der menschlichen Fettgewebe mesenchymalen Stammzellen in einem Rattenmodell Knie Arthrose mit fluoreszierenden lipophile Membran Farbstoff

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisierung von zellulären elektrische Aktivität im frühen Zebrafish Embryos und Tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation von Gerüst-frei, dreidimensionale Insulin mit dem Ausdruck Pancreatoids vom Maus Pankreas Stammväter In-vitro-

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Induktion und Validierung der zellulären Seneszenz in primären humanen Zellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Generierung von mehrzelligen humanen primären Endometrium-Organoiden

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...