Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) F31 HD089693, המכון הלאומי למדעי בריאות הסביבה / המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ו 4UH3ES029073-03, ואת הפרופסור לזכר תומאס J. Watkin.
המחברים רוצים להודות לאריק ו. רות' על עזרתם במיקרוסקופ אלקטרונים. עבודה זו עשתה שימוש במתקן BioCryo של מרכז NUANCE של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, אשר קיבל תמיכה ממשאב ננוטכנולוגיה רכה והיברידית (SHyNE) משאבים (NSF ECCS-1542205); תוכנית MRSEC (NSF DMR-1720139) במרכז לחקר החומרים; המכון הבינלאומי לננוטכנולוגיה (IIN); ו מדינת אילינוי, דרך ה-IIN. הוא גם עשה שימוש בציוד CryoCluster, אשר קיבל תמיכה מתכנית MRI (NSF DMR-1229693). גרפיקה באות 1 תוכננה באמצעות BioRender.com.

כל ניסויי העכבר אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת נורת'ווסטרן, וכל ההליכים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על-ידי IACUC.
1. הכנת פתרונות לדיסוציאציה אנזימטית לרקמות
<ol><li>השתמש בשני פתרונות אנזימטיים שונים (פתרון 1 ופתרון 2), שניהם מיוצרים באמצ...

עם השלמת פרוטוקול זה דור אורגנואיד, המשתמש יהיו ארבע טכניקות תרבות שונות זמינות להם להרכבת מבנים אשכים אורגנואידים בסביבות ECM או ECM ללא. חשוב לציין, כל ארבע השיטות מאפשרות לחוקר להתבונן באופן לא פולשני בהרכבה עצמית של אורגנואידים לאורך זמן באמצעות הדמיית זמן או הקלטת וידאו, ולאסוף באופן לא...

אורגנואידים אשכים הם טכניקה חלוצית ללימוד התפתחות האשכים, spermatogenesis, ופיזיולוגיהבמבחנה 1,,2,,3,,4. מספר שיטות נחקרו עבור דור אורגנואיד; אלה כוללים מגוון של מערכות תרבות חוץ-תאיות (ECM) ו-ECM ללא ECM, הן בכיוון דו-ממדי (דו-ממדי) והן בכיוון תלת-ממדי (תלת-ממדי). שיטות ייצור שונות יכולות לקדם אסטרטגיות הרכבה תאיות נפרדות; התוצאה היא רמה גבוהה של השתנות מורפולוגית ופונקציונלית בין מודלים אורגנואידים שפורסמו. מטרת מאמר זה היא לדון במצב הנוכחי של מודלים אשכים במבחנה, ולשמש כתבנית עבור חוקרים עתידיים, בעת עיצוב ניסויי אורגנואיד האשכים. במסגרת המחקר הנוכחי, ארבעה ארכיטיפים שונים של מערכת תרבות מוגדרים ומאופיין בתהליך ניסיוני ותוצאה ביולוגית. אלה כוללים: שיטות תרבות ECM ללא ECM 2D, 3D-ללא ECM ותו לא. האסטרטגיות המוצגות בהן נועדו להיות פשוטות, נגישות ותורמות מאוד בין מעבדות וקבוצות מחקר שונות.
מבחינה היסטורית עבור האשכים, הכינוי "במבחנה", שימש עבור מספר שיטות תרבות שונות של רקמות אשכים ותאים. אלה כוללים שיטות רקמות אורגנוטיפיקות / תרבות איברים (כלומר, תרבות explant)5,תרבות צינורית סמיניפריתמבודדת 6,תרבות תאהאשכים 7, ושיטותשל מורפוגנזה רקמת דה נובו (כלומר, מבנים ביולוגיים אורגנואידים)1. החקירות הראשונות בזרע חוץ-חוץ-כוכבי בוצעו לפני כ-100 שנה, כאשר תרבות האשכים של הארנבים נתלו ב-19208- ומאוחר יותר ב-1937עם תפוצות עכבר 9. בתוך ניסויים ראשוניים אלה spermatogonia נצפו במידה רבה מנוון לאורך השבוע הראשון של התרבות, אם כי כמה תאים מבדיל meiotically זוהו. מזכיר דוחות היסטוריים אלה, testis explant תרבות התחדשה אופטימיזציה 2011 כדי להפוך טכניקה אפשרית ללימוד האשכיםהוא 10. מאז 2011, תרבות explant הפיקה זרע כשיר פוריות במספר דיווחים11,12,13. עם זאת, בשל ההסתמכות של תרבות explant על צינורות אשכים מקומיים קיימים מראש, אלה ההתקדמות האחרונה מתוארים בצורה מדויקת יותר כדוגמאות של "ex vivo" תפקוד האשכים spermatogenesis, פונקציית רקמות ש נשמרה או חודשה עם הסרת מגופו של אורגניזם. למרות השכיחות שלה בספרות, תחזוקה ארוכת טווח של תאי נבט והידול בתוך explants האשכים מאתגרלשכפל 14 , 15,16,17,18,במיוחד על פני מסגרותזמן מספיק זמן כדי להתבונן באופן מלא זרע חוץית (~ 35 ימיםבעכברים 19 ו 74 בבניאדם 20). זה מסקרן להעריך כי רבים מאותם אתגרים שחוו לפני 100 שנים, עדיין מנוסים בתוך זרע ויו לשעבר היום.
שונה מאשר גישות ויוו לשעבר, אורגנואידים האשכים הם דה נובו מורכב microtissues שנוצר כולו במבחנה ממקורות סלולריים (כלומר, תאי האשכים העיקריים). אורגנואידים אשכים מספקים אסטרטגיה יצירתית לעקוף את ההסתמכות ההיסטורית של השדה על רקמה מקומית קיימת מראש, ולסיכום הביולוגיה האשכים לחלוטין במבחנה. ישנן דרישות מרובות המשותפות על ידי רוב מודלים רקמת אורגנואיד; אלה כוללים (1) מורפולוגיה או ארכיטקטורה של רקמות vivo-mimetic, (2) סוגי תאים עיקריים מרובים של הרקמה המיוצגת, (3) הרכבה עצמית או ארגון עצמי בדורם, ו-(4) את היכולת לדמות רמה מסוימת של תפקוד הרקמה המיוצגתופיזיולוגיה 21,22,23,,24. עבור האשכים, זה יכול להיות נתפס בארבעה סימני היכר עיקריים: (1) הכללה של סוגי תאי אשכים עיקריים, נבט, Sertoli, Leydig, peritubular, ותאים interstitial אחרים, (2) הרכבת רקמות בהכוונה תא, (3) מתאים ממודר סוגי תאים לתאים צינוריים נפרדים (נבט וSertoli) ואזורים interstitial (כל סוגי התאים האחרים), ו (4) מידה מסוימת של תפקוד רקמות (למשל, הפרשת הורמון הרבייה או תגובות רקמות, ותחזוקת תא נבט ושונות). בהתחשב באתגרים ההיסטוריים בשמירה על בידול תאי הנבט אקס ויוו ובמבחנה, היוון של ארכיטקטורות אשכים vivo-mimetic (כלומר, מבנים הדומים צינורות סמיניפרים) עם סמנים נוספים מציע סימולציה של פיזיולוגיה אשכים (למשל, פונקציה אנדוקרינית), הם אבני דרך עדיפות לקראת יצירת איברים אשר עשוי יום אחד לקיים במבחנה spermgenesis.
רוב שיטות האורגנואידים האשכים שפורסמו לנצל ECM זמין מסחרית (למשל, קולגן או קניינית ניסוחים ECM)25,26,27 או ECMs ממקור מותאם אישית (כלומר, אשכים decellularized נגזר ECM הידרוג'לים)28,,29,30. ECM אקסוגני מקדם היווצרות רקמת דה נובו באמצעות מתן פיגומים תומכים הרכבה עבור יצירת רקמות. שיטות ECM העניקו רמה מרשימה של היווצרות רקמות, כולל כמה נוכחות תא נבט מורפולוגיה רקמות-mimetic25,28. עם זאת, ECMs הם משתמשים אינם תמיד זמינים אוניברסלית (כלומר, הידרוג'לים נגזר ECM decellularized), ושיטות מסוימות דורשות ג'ל מתוחכם ותאים זריעה כיוונית (למשל, מעברי צבע תלת שכבתיים של ECM והדפסה 3D)25,,31,,32. שיטות ללא פיגומים (למשל, צניפה תלויה וצלחות תרבות לא דביקות)33,34,35יצרו גם אורגנואידים חזקים ותו לא רקים ללא צורך בג'לים או פיגומים של ECM. עם זאת, מורפולוגיה רקמות של אורגנואידים אלה ללא פיגומים הוא לעתים קרובות שונה במבחן vivo, ורוב הדיווחים האלה לשלב תוסף ECM ביוכימיכדי לקדם היווצרות רקמות 33,34,36, או לחילופין, להסתמך על צנטריפוגה עבור צנטריפוגה של תאיםכפויים וקומפקטיות 34, מה שהופך אותם פחות אידיאליים ללימוד הגירה מכוונת תא וארגון עצמי.
ארבע שיטות דור האורגנואידים המוצגות בכתב יד זה כוללות הן אסטרטגיות תלויות ECM והן אסטרטגיות עצמאיות, שכל אחת מהן משתמשת בזרעת תאים פשוטה המאפשרת תצפית על הרכבה עצמית של אורגנואידים מונחי תאים. ניתן לבצע את כל ארבע הטכניקות מאותן מתלי תאים או לעשות שימוש באוכלוסיות מועשרות מותאמות אישית וסוג תא. כוחן של שיטות אלה הוא היכולת להתבונן באורגניואידים בהרכבה עצמית בזמן אמת, ולהשוות ישירות את האופן שבו מבנים אשכים מרכיבים את עצמם בין מיקרו-סביבה של תרבות שונה. ההבדלים הפנוטיפיים בין ארבע שיטות תרבות אלה צריכים להיחשב להשפעתם על שאלת המחקר או הנושא של החוקר. כל שיטה מייצרת מבנים ביולוגיים או אורגנואידים בתוך 24 שעות או פחות. לסיכום, השיטות המוצגות כאן מספקות ערכת כלים של טכניקות הרכבה אורגנואידית ללימוד הרכבה אורגנואיד אשכים, פיתוח רקמות, ופיזיולוגיה אשכים במבחנה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

אורגנואידים אשכים מספקים כלי לחקר התפתחות האשכים, spermatogenesis, אנדוקרינולוגיה במבחנה. מספר שיטות פותחו על מנת ליצור אורגנואידים האשכים. רבות משיטות אלה מסתמכות על מטריצה חוץ-תאית (ECM) כדי לקדם את הרכבת רקמת דה נובו, עם זאת, ישנם הבדלים בין שיטות במונחים של מורפולוגיה ביומימטית ותפקוד של רקמות. יתר על כן, יש כמה השוואות ישירות של שיטות שפורסמו. כאן, השוואה ישירה נעשתה על ידי לימוד הבדלים בפרוטוקולים דור אורגנואיד, עם תוצאות שסופקו. ארבע שיטות לדור ארכיטיפי: (1) ללא ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) ללא ECM תלת-מיוד, ו-(4) תרבות ECM תלת-מיידה מתוארות. שלושה מבחני ביצועים עיקריים שימשו להערכת דור אורגנואיד האשכים. אלה הם הרכבה עצמית תאית, הכללה של סוגי תאים עיקריים (Sertoli, Leydig, נבט, ותאים פריטבולר), וארכיטקטורת רקמות ממופרת כראוי. מתוך ארבע סביבות שנבדקו, תרביות 2D ECM ו-3D-ECM שנוצרו אורגנואידים עם מורפולולוגיות פנימיות הדומות ביותר לאשכים מקומיים, כולל מידור דה נובו של סוגי תאים צינוריים לעומת תאי בין-עירוניים, פיתוח מבנים דמויי צינור, ותפקוד אנדוקריני ארוך טווח מבוסס. כל השיטות שנבדקו מנוצל לא ממוין, מתלים ראשיים של תאים אשכים murine והשתמשו במשאבי תרבות נגישים בדרך כלל. טכניקות אלה של דור אורגנואידים באשכים מספקות ערכת כלים נגישה ותועתקת ביותר ליוזמות מחקר לתוך אורגנוגנזה אשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

דור אורגנואיד נחשב לא מוצלח אם תאי האשכים לא הרכבה עצמית בתוך 72 שעות של תרבות, עם זאת, כל השיטות המוצגות כאן להרכיב בתוך 24 שעות בעת שימוש בתאים מורין ילדותי (5 dpp). כשל בדור המבנה הביולוגי הוצג כהמשך של תאים מושעים באופן חופשי (עמודה של 0 שעות באות 1) גםלאחר תרבות מורחבת (72 ש).) בהי...

Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

כאן, ארבע שיטות ליצירת אורגנואידים אשכים מתאי אשכים מורין ילודים ראשוניים מתוארים כלומר, מטריצה חוץ תאית (ECM) וסביבות תרבות 2D ותלת-מיוד ללא ECM. טכניקות אלה יש יישומי מחקר מרובים והם שימושיים במיוחד ללימוד פיתוח האשכים ופיזיולוגיה במבחנה.

אקסטרה סלולר מבוסס מטריצה ודור נוסף ללא מטריקס סלולרי של אורגנואידים אשכים Murine

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

פרוטוקולים אלה מאפשרים למשתמש לייצר מספר רב של אורגנואידים אשכים פונקציונליים מימטיים ואנדוקריניים מבחינה מבנית בסביבות נטולות ECM ו- DCM בתנאי תרבות דו-מימדיים או תלת-מימדיים. טכניקות אלה ניתנות לשחזור רב, מיושמות בקלות על הגדרות מעבדה ביולוגיות סטנדרטיות, ומשתמשות רק בכלים וחומרים נפוצים. אורגנואידים האשכים הם כלי חדשני להדמיית זרע ו אנדוקרינולוגיה הרבייה במבחנה, והוא עשוי יום אחד לאפשר את המחקר של גמטוגנזה במבחנה.התחל על ידי הנחת עלה העכבר המתת חיטוי על מחצלת ניתוח ועיקור הבטן עם 70% אתנול. אוהל את העור של הבטן התחתונה עם מדפים ולפתוח אותו עם מספריים. אתר את האשכים באזורים הימניים והשמאליים התחתונים של הבטן וחתכו את הקשרים שלהם לאגרטלים וכל רקמת חיבור מעגנת.ואז להרים את כל האשכים מהחיה. מניחים אותו בצלחת פטרי של BM שמצוי מראש. תחת מיקרוסקופ ניתוח, לעשות חתך קטן ב tunica albuginea בקצה אחד של כל האשכים עם מספריים ניתוח מיקרו קטן או על ידי קרע בעדינות עם שני מדפים עדין. תוך החזקת האשכים מהקצוות הנגדיים של החתך, לסחוט אותו בעדינות עם מדחפים עדין ולדחוף בתנועה גורפת לכיוון החור בטוניקה, אשר ישחרר את רקמת האשכים כמו חתיכה אחת מגולח.חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות יותר. מניחים את החלקים למיליליטר אחד של פתרון דיסוציאציה לפני המלחמה אחד ו דגירה אותם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, בעדינות triturate את החלקים האשכים 50 פעמים עם פיפטה P1000.ודאו שהפקעות נפרדות זו מהן ומהרקמה הבין-מערכתית. אם גושים נשארים, דגירה במשך חמש דקות נוספות ו triturate שוב. מוסיפים 33 מיקרוליטרים של תווי היאלאורונידס למיליליטר אחד של תערובת הדיסוציאציה.ואז triturate 50 פעמים עם פיפטה P1000 ודגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר הדגירה, triturate אותו 50 פעמים עם פיפטה P200. לאחר הבטחת כי אין צינוריות גלוי או גושים של תאים קיימים, מרווה את אנזימי הדיסוציאציה על ידי הוספת FBS ל 10% מהנפח הכולל של המדגם triturate אותו מספר פעמים עם פיפטה P200.הרטב את המרכז של מסננת תאים של 40 מיקרומטר עם מדיה ושוכך אותו משם, ולאחר מכן להוסיף את המדגם מסננת רטובה מראש ולסנן אותו כדי לייצר השעיה של תא יחיד. צנטריפוגה ההשעיה ב 100 פעמים g במשך שבע דקות. השלך את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- BM טרי. לספור את התאים קיימא על hemocytometer באמצעות הדרה כחולה trypan, ואז מחדש צנטריפוגה מחדש resuspend אותם BM טרי. לתרבות דו-מימדית נטולת ECM, צלחת מתלים חד-תאיים ישירות על מגלשות תא ארבע בארות וממקמים את המגלשות באינקובטור של 35 מעלות צלזיוס.לתרבות ה-ECM הדו-מימדית, מחלקים 100 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית מדוללת קרה של אחד לאחד לשקופית תאית של ארבע בארות, ומבטיחים שהג'ל יכסה את תחתית המנה. מניחים את השקופית באינקובטור למשך 30 דקות לפחות כדי לאפשר ל- ECM להפוך לפולימריזציה לג'ל, ולאחר מכן להוסיף את השעיית התא על גבי. לתרבות נטולת ECM תלת מימדית, מניחים מנות פטרי תלת מימדיות בצלחת תרבות של 24 בארות ומכסים אותן במיליליטר אחד של BM. תן את הכלים לצייד BM לפחות 30 דקות באינקובטור 35 מעלות צלזיוס, ואז להשליך את BM ולחזור על שיווי המשקל שוב עם מיליליטר אחד של BM טרי. הסר את כל BM מן הבאר ולחלק 200 microliters של BM טרי מסביב אבל לא בתוך ההפסקה המרכזית של צלחת פטרי 3D, ולאחר מכן לאסוף כל BM שנותר מתוך הפסקה זריעת התא המרכזי של מיקרו היטב להוסיף.מחלקים את ההשעיה החד-תאית להפסקה המרכזית ומערבבים בעדינות למעלה ולמטה. מניחים את המנה לתוך חממה לחה 35 מעלות צלזיוס לתרבות. ביום שלמחר, לאט ובזהירות להסיר מדיה קיימת מרחבי צלחת פטרי 3D agarose ולהחליף עם מיליליטר אחד של BM טרי. האורגנואידים היו צריכים לדחוס בן לילה, ולאפשר להם לנוח בתחתית.עבור תרבות ECM תלת-מימדית, הכן השעיה חד-תאית על-ידי שילוב חלקים שווים של ההשעיה של התא ב- BM עם ECM קר מופשר מראש. טריטוראט מספר פעמים כדי להבטיח שהוא מעורבב היטב. לאחר מכן מחלקים מיד את התערובת למגלשה קאמרית בת ארבע בארות, ומבטיחים שהיא מכסה את כל תחתית הצלחת.דגירה שקופיות התא ב 35 מעלות צלזיוס ולאפשר את התוכן שלה כדי polymerize לפחות 30 דקות. לאחר הפילמור, להוסיף 500 microliters של BM על גבי התרבות. תרבות כל סוגי המודל האורגנואידים ב 35 מעלות צלזיוס.עבור כל סוגי התרבות, החלף חצי מהמדיה שלהם עם BM טרי כל יומיים. פרוטוקול זה שימש להשגת דור האורגנואידים תוך 24 שעות באמצעות תאי אשכים של מורין לנוער. רקמות שנוצרו בהצלחה נצפו בתחילה כמו אשכולות תאים תלת-מימדיים.בסביבות ECM, לאשכולות התאים היו שוליים ברורים בין האשכול לסביבתם הסובבת אותם. אשכולות תאים נצפו גם נודדים ברחבי ה- ECM ומתמזגים יחד. תרבות ה-ECM התלת-מימדית דרשה זמן רב יותר באופן משמעותי להרכבת מבני דה נובו מאשר כל שיטות התרבות האחרות.ותרבות ללא ECM תלת מימדית ייצרה את האשכולות הגדולים ביותר עם אשכול אחד גדול וקומפקטי בתוך כל באר של צלחת פטרי 3D agarose. כדי להעריך אם המודלים האורגנואידיים דומים לרקמה המקורית, המבנים הביולוגיים נבדקו עבור סמנים ספציפיים לתאים והודמיו עם כשל חיסוני. השיטות הדו-ממדיות נטולות ה-ECM וה-ECM התלת-ממד ייצרו אורגנואידים עם מורפולוגיה פנימית מימטית מאוד של מידור האשכים.ניתוח ארוך טווח בוצע על אורגנואידים מורכבים ללא ECM תלת-מימדי. האורגנואידים היו מתורבתים במשך 14 ימים ולאחר מכן נבדקו עבור סמנים ספציפיים לתאים ומבנה. מבנים דמויי תובל נצפו.האורגנואידים נטולי ה-ECM התלת מימד נחקרו גם לתפקוד אנדוקריני בתרבות של 12 שבועות עם גירוי גונדוטרופין. טסטוסטרון ו inhibin B היו שניהם מכומתים מדיום מותנה organoid. לאחר 12 שבועות, גונדוטרופינים הוסרו במשך 48 שעות, גורם ריכוזי טסטוסטרון ו inhibin B לרדת.כאשר גונדוטרופינים הוחזרו, שני ריכוזי ההורמונים גדלו באופן משמעותי, הוכחת היענות אנדוקרינית נכונה. הרכבה אורגנואידית מנצלת את ההתנהגות האוטונומית של תאים אשכים לא בוגרים בני קיימא. ניתן לתכנן בקלות ניסויים יצירתיים באמצעות תערובות תאים ממוינות או היברידיות מותאמות אישית.לאחר זריעת תאים, ניתן להשתמש בהדמיית וידאו חי או בהדמיית זמן לשגות כדי לכמת הרכבה עצמית אורגנואידית. על פני תרבות, אורגנואידים ובינוני מצב ניתן לאסוף לניתוחים היסטולוגיים אמינו.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

דור של תרבויות עור Organotypic מהונדסות גנטי שימוש חסר חיוניות עור אדם

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

הערכה של פציעה-induced הזדקנות ביולוגית, In Vivo התכנות בשריר השלד

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

אין ויוו מעקב של האדם נגזר שומן בתאי גזע Mesenchymal במודל דלקת מפרקים ניוונית של הברך עכברוש עם קרום Lipophilic פלורסנט לצבוע

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

דור של אינסולין נטולת לגרדום, תלת מימדי לבטא Pancreatoids העכבר אבות הלבלב במבחנה

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...