Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) F31 HD089693, dal National Institute for Environmental Health Sciences / National Center for Advancing Translational Sciences (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 e 4UH3ES029073-03 e dalla Cattedra commemorativa di Thomas J. Watkin.
Gli autori ringraziano Eric W. Roth per la loro assistenza nella microscopia elettronica a trasmissione. Questo lavoro ha fatto uso della struttura BioCryo del NUANCE Center della Northwestern University, che ha ricevuto il supporto della risorsa soft and hybrid nanotechnology experimental (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); il programma MRSEC (NSF DMR-1720139) presso il Centro ricerche materiali; l'Istituto Internazionale di Nanotecnologia (IIN); e lo Stato dell'Illinois, attraverso l'IIN. Ha anche fatto uso dell'apparecchiatura CryoCluster, che ha ricevuto supporto dal programma MRI (NSF DMR-1229693). La grafica nella figura 1 è stata progettata utilizzando BioRender.com.

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Northwestern University, e tutte le procedure sono state eseguite secondo protocolli approvati dalla IACUC.
1. Preparazione di soluzioni enzimatiche di dissociazione tissutale
<ol><li>Utilizzare due diverse soluzioni enzimatiche (Soluzione 1 e Soluzione 2), entrambe realizzate utilizzando una soluzione media di coltura basale (BM).</li>
	<li>Per preparare il BM, aggiungere siero...

Con il completamento di questo protocollo di generazione organoide, l'utente avrà a disposizione quattro diverse tecniche di coltura per assemblare costrutti testicolari e organoidi in ambienti privi di ECM o ECM. È importante sottolineare che tutti e quattro i metodi consentono al ricercatore di osservare in modo non invasivo l'auto-assemblaggio organoide nel tempo attraverso l'imaging time-lapse o la registrazione video, e di raccogliere in modo non invasivo mezzi condizionati per l'analisi di ormoni e citochine secr...

Gli organoidi testicolari sono una tecnica pionieristica per lo studio dello sviluppo testicolare, della spermatogenesi e della fisiologia in vitro1,,2,,3,,4. Diversi metodi sono stati esplorati per la generazione organoide; questi includono una varietà di sistemi di coltura extracellulari (ECM) e senza ECM, sia negli orientamenti bidimensionali (2D) che tridimensionali (3D). Diversi metodi di generazione possono promuovere strategie di assemblaggio cellulare distinte; ciò si traduce in un alto livello di variabilità morfologica e funzionale tra i modelli organoidi pubblicati. Lo scopo di questo articolo è discutere lo stato attuale dei modelli testicolari in vitro e servire da modello per i futuri ricercatori, quando si progettano esperimenti organoidi testicolari. All'interno del presente studio, quattro diversi archetipi del sistema di coltura sono definiti e caratterizzati in processo sperimentale e risultato biologico. Questi includono: metodi di coltura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. Le strategie qui presentate sono destinate ad essere semplici, accessibili e altamente riproducibili tra diversi laboratori e gruppi di ricerca.
Storicamente per il testicolo, la designazione "in vitro", è stata utilizzata per diversi metodi di coltura di tessuti e cellule testicolari. Questi includono metodi dicolturaorganotipico di tessuti/organi (cioè coltura di espianto) 5 , coltura isolata di tubuli seminiferi6,coltura cellulare testicolare7e metodi di morfogenesi dei tessuti de novo (cioè costrutti biologici e organoidi)1. Le prime ricerche sulla spermatogenesi in vitro sono state eseguite circa 100 anni fa, con la coltura di espianto di testicoli di coniglio nel 19208e successivamente nel 1937 con espianto di topi9. All'interno di questi esperimenti iniziali la spermatogonia è stata osservata degenerare in gran parte durante la prima settimana di coltura, sebbene siano state identificate alcune cellule meioticamente differenzianti. Ricordando questi rapporti storici, la cultura dell'espianto del testicolo è stata ripresa e ottimizzata nel 2011 per diventare una tecnica fattibile per lo studio del testicolo10. Dal 2011, la coltura di espianto ha prodotto sperma competente per la fertilità in piùrapporti11,12,,13. Tuttavia, a causa della dipendenza della coltura di espianto dai tubuli dei testicoli nativi preesistenziati, questi recenti progressi sono descritti più accuratamente come esempi di funzione testicolare "ex vivo" e spermatogenesi, funzione tissutale che è stata mantenuta o ripresa al momento della rimozione dal corpo di un organismo. Nonostante la sua prevalenza in letteratura, il mantenimento e la differenziazione a lungo termine delle cellule germinali all'interno delle espianto,testicolari è difficile da replicare14,,15,16,17,18, specialmente in tempi abbastanza lunghi da osservare pienamente la spermatogenesi in vitro (~ 35 giorni neitopi 19 e 74 nell'uomo20).15 È intrigante apprezzare che molte delle stesse sfide vissute 100 anni fa, sono ancora oggi vissute all'interno della spermatogenesi ex vivo.
Diversi dagli approcci ex vivo, gli organoidi testicolari sono microtissue assemblate de novo generate interamente in vitro da fonti cellulari (cioè cellule testicolari primarie). Gli organoidi testicolari forniscono una strategia creativa per aggirare la dipendenza storica del campo dal tessuto nativo preesiste e per ricapitolare la biologia testicolare completamente in vitro. Ci sono più requisiti condivisi dalla maggior parte dei modelli di tessuto organoide; questi includono (1) morfologia o architettura del tessuto in vivo-mimetico, (2) più tipi di cellule principali del tessuto rappresentato, (3) auto-assemblaggio o auto-organizzazione nella loro generazione e (4) la capacità di simulare un certo livello della funzione e della fisiologia del tessuto rappresentato21,22,23,24. Per il testicolo, questo può essere catturato in quattro segni distintivi principali: (1) l'inclusione dei principali tipi di cellule testicolari, germe, Sertoli, Leydig, cellule peritubulari e altre cellule interstiziali, (2) assemblaggio di tessuti diretti a cellule, (3) tipi di cellule opportunamente compartimentate in compartimenti tubolari separati (germe e Sertoli) e regioni interstiziali (tutti gli altri tipi di cellule) e (4) un certo grado di funzione tissutale (ad esempio, secrezione o risposte dei tessuti dell'ormone riproduttivo, mantenimento e differenziazione delle cellule germinali). Considerando le sfide storiche nel mantenimento della differenziazione delle cellule germinali ex vivo e in vitro, la ricapitolazione di architetture testicolari in vivo-mimetiche (cioè strutture simili a tubuli seminiferi) con marcatori aggiuntivi che suggeriscono la simulazione della fisiologia testicolare (ad esempio, la funzione endocrina), sono pietre miliari prioritarie verso la generazione di organoidi che un giorno potrebbero sostenere la spermatogenesi in vitro.
La maggior parte dei metodi organoidi testicolari pubblicati sfrutta l'ECM disponibile in commercio (ad esempio, collagene o formulazioni ECM proprietarie)25,26,,27 o ECM di origine personalizzata (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da testis ECM)28,29,30. L'ECM esogeno promuove la formazione di tessuti de novo fornendo un'impalcatura di supporto all'assemblaggio per la generazione di tessuti. I metodi ECM hanno offerto un livello impressionante di formazione dei tessuti, tra cui una certa presenza di cellule germinali e morfologia tessuto-mimetica25,,28. Tuttavia, gli EMM che utilizzano non sono sempre universalmente disponibili (ad esempio, idrogel decellularizzati derivati da ECM) e alcuni metodi richiedono sofisticati orientamenti di semina in gel e cellule (ad esempio, gradienti a 3 strati di ECM e stampa 3D)25,,31,32. I metodi senza impalcature (ad esempio, caduta sospesa e piastre di coltura non aderenti)33,34,35 hanno anche generato organoidi robusti e altamente riproducibili senza la necessità di gel O impalcature ECM. Tuttavia, la morfologia tissutale di questi organoidi senza impalcature è spesso dissimile dai testi in vivo, e la maggior parte di questi rapporti incorpora un additivo biochimico ECM per promuovere laformazione dei tessuti 33,34,36o, in alternativa, fare affidamento sulla centrifugazione per l'aggregazione forzata delle cellule e lacompattazione 34,rendendoli meno ideali per studiare la migrazione e l'auto-organizzazione dirette dalle cellule.
I quattro metodi di generazione organoide presentati in questo manoscritto includono sia strategie dipendenti dall'ECM che strategie indipendenti, ognuna delle quali utilizza una semplice semina cellulare che consente l'osservazione dell'auto-assemblaggio organoide guidato dalle cellule. Tutte e quattro le tecniche possono essere eseguite dalle stesse sospensioni cellulari o possono utilizzare popolazioni arricchite personalizzate e di tipo cellulare. Un punto di forza di questi metodi è la capacità di osservare gli organoidi auto-assemblarsi in tempo reale e di confrontare direttamente come le strutture testicolari si auto-assemblano tra diversi microambientati di coltura. Le differenze fenotipiche tra questi quattro metodi di coltura dovrebbero essere prese in considerazione per il loro impatto sulla questione della ricerca o sull'oggetto dello sperimentatore. Ogni metodo produce costrutti biologici o organoidi entro 24 ore o meno. In conclusione, i metodi qui presentati forniscono un toolkit di tecniche di assemblaggio organoide per lo studio dell'assemblaggio organoide testicolare, dello sviluppo tissutale e della fisiologia testicolare in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Gli organoidi testicolari forniscono uno strumento per studiare lo sviluppo testicolare, la spermatogenesi e l'endocrinologia in vitro. Sono stati sviluppati diversi metodi per creare organoidi testicolari. Molti di questi metodi si basano sulla matrice extracellulare (ECM) per promuovere l'assemblaggio dei tessuti de novo, tuttavia, ci sono differenze tra i metodi in termini di morfologia biomimetica e funzione dei tessuti. Inoltre, vi sono pochi confronti diretti dei metodi pubblicati. Qui, viene effettuato un confronto diretto studiando le differenze nei protocolli di generazione organoide, con i risultati forniti. Vengono descritti quattro metodi di generazione archetipica: (1) 2D ECM-free, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM-free e (4) 3D ECM culture. Tre parametri di riferimento primari sono stati utilizzati per valutare la generazione organoide testicolare. Questi sono l'auto-assemblaggio cellulare, l'inclusione dei principali tipi di cellule (Sertoli, Leydig, germe e cellule peritubulari) e l'architettura dei tessuti opportunamente compartimentata. Dei quattro ambienti testati, le colture 2D ECM e 3D ECM-free hanno generato organoidi con morfologie interne più simili ai tester nativi, tra cui la compartimentazione de novo dei tipi di cellule tubolari rispetto a quelle interstiziali, lo sviluppo di strutture simili a tubuli e una funzione endocrina consolidata a lungo termine. Tutti i metodi studiati utilizzavano sospensioni cellulari testicolari murine primarie nonsortite e usavano risorse di coltura comunemente accessibili. Queste tecniche di generazione organoide testicolare forniscono un toolkit altamente accessibile e riproducibile per iniziative di ricerca sull'organogenesi testicolare e la fisiologia in vitro.

La generazione organoide è stata considerata non riuscita se le cellule testicolari non si sono auto-assemblate entro 72 ore dalla coltura, tuttavia, tutti i metodi qui presentati si assemblano entro 24 ore quando si utilizzano cellule murine giovanili (5 dpp). Fallimento della generazione di costrutti biologici presentato come una continuazione di cellule liberamente sospese (colonna 0 h nella figura 1) anche dopo una coltura estesa (72 h). In assenza di auto-assemblaggio dei tessuti, tutt...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Qui vengono descritti quattro metodi per generare organoidi testicolari da cellule testicolari murine neonatale primarie, cioè matrice extracellulare (ECM) e ambienti di coltura 2D e 3D senza ECM. Queste tecniche hanno molteplici applicazioni di ricerca e sono particolarmente utili per studiare lo sviluppo testicolare e la fisiologia in vitro.

Generazione extra di organoidi testicolari murini basati su matrice cellulare ed extra cellulare

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Questi protocolli consentono all'utente di produrre un gran numero di organoidi testicolari funzionali strutturalmente mimetici ed endocrini in ambienti ecm e senza DCM in condizioni di coltura 2D o 3D. Queste tecniche sono altamente riproducibili, facilmente applicabili alle impostazioni standard del laboratorio biologico e utilizzano solo strumenti e materiali comuni. Gli organoidi testicolari sono un nuovo strumento per simulare la spermatogenesi e l'endocrinologia riproduttiva in vitro, e potrebbero un giorno consentire lo studio della gametogenesi in vitro.Inizia posizionando la supina di topo eutanasiata su un tappetino di dissezione e sterilizzando l'addome con il 70% di etanolo. Tenda la pelle dell'addome inferiore con le forcep e aprila con le forbici. Individuare i teste nelle regioni inguinali in basso a sinistra e a destra dell'addome e tagliare le loro connessioni ai deferenti vas e a qualsiasi tessuto connettivo ancorante.Quindi sollevare l'intero teste dall'animale. Mettilo in una piastra di Petri di BM pre-equilibrato. Al microscopio a dissezione, fare una piccola incisione nella tunica albuginea su un'estremità di ogni testicolo con piccole forbici a micro dissezione o strappando delicatamente con due forcep fini. Tenendo il testicolo dall'estremità opposta dell'incisione, spremere delicatamente con forcep fini e spingere in un movimento di spazzamento verso il foro nella tunica, che rilascerà il tessuto testicolare come un unico pezzo coeso.Tagliare il tessuto a pezzi più piccoli. Posizionare i pezzi in un millilitro di soluzione di dissociazione prebellica uno e incubarli a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, triturare delicatamente le provette 50 volte con una pipetta P1000.Assicurarsi che i tubuli si separino l'uno dall'altro e dal tessuto interstiziale. Se rimangono grumi, incubare per altri cinque minuti e triturare di nuovo. Aggiungere 33 microlitri di soluzione di materiale ialuronidasi per un millilitro della miscela di dissociazione.Quindi triturare 50 volte con una pipetta P1000 e incubare il campione a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo l'incubazione, triturarlo 50 volte con una pipetta P200. Dopo aver fatto in modo che non siano presenti tubuli visibili o grumi di cellule, dissetare gli enzimi di dissociazione aggiungendo FBS al 10% del volume totale del campione e triturarlo più volte con una pipetta P200.Bagnare il centro di un colino a celle da 40 micrometri con mezzi e aspirarlo via, quindi aggiungere il campione al filtro pre-bagnato e filtrarlo per produrre una sospensione a cella singola. Centrifugare la sospensione a 100 volte g per sette minuti. Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in BM fresco. Contare le cellule vitali su un emocitometro usando l'esclusione blu del tripano, quindi ri-centrifugarle e rimescolarle in BM fresco. Per la coltura priva di ECM 2D, le sospensioni a cella singola a piastre direttamente su vetrini a camera a quattro pozzi e posizionano le diapositive in un incubatore Celsius di 35 gradi.Per la coltura 2D ECM, erogare 100 microlitri di mezzo a matrice extracellulare diluito uno-a-uno freddo in uno scivolo a camera a quattro porri, assicurando che il gel copra il fondo del piatto. Posizionare lo scivolo nell'incubatore per un minimo di 30 minuti per consentire all'ECM di polimerizzare in un gel, quindi aggiungere sopra la sospensione cellulare. Per una cultura senza ECM 3D, metti i piatti 3D Petri in agarosio in un piatto di coltura da 24 pozzetti e coprili con un millilitro di BM. Lasciare equilibrare i piatti in BM per almeno 30 minuti in un incubatore di 35 gradi Celsius, quindi scartare il BM e ripetere ancora una volta l'equilibrazione con un millilitro di BM fresco. Rimuovere tutti i BM dal pozzo e erogare 200 microlitri di BM fresco intorno ma non all'interno della rientranza centrale della piastra di Petri 3D, quindi raccogliere l'eventuali BM rimanenti dall'interno della rientranza di semina della cella centrale del micro inserto del pozzo.Erogare la sospensione a cella singola nella rientranza centrale e triturare delicatamente su e giù. Mettere il piatto in un incubatore umidificato di 35 gradi Celsius per la coltura. Il giorno successivo, rimuovere lentamente e con cura i supporti esistenti da intorno alla piastra di Petri 3D di agarosio e sostituirli con un millilitro di BM fresco. Gli organoidi avrebbero dovuto compattarsi durante la notte, permettendo loro di riposare sul fondo.Per le impostazioni cultura 3D ECM, preparare una sospensione a cella singola combinando parti uguali della sospensione cellulare in BM con ECM pre-scongelato a freddo. Triturare più volte per assicurarsi che sia ben miscelato. Quindi erogare immediatamente la miscela in uno scivolo a camera a quattro po porsi, assicurandosi che copra l'intero fondo della piastra.Incubare i vetrini della camera a 35 gradi Celsius e lasciare che il suo contenuto polimerizzi per almeno 30 minuti. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 500 microlitri di BM sopra la coltura. Cultura tutti i tipi di modello organoide a 35 gradi Celsius.Per tutti i tipi di cultura, scambia metà dei loro supporti con BM fresco ogni due giorni. Questo protocollo è stato utilizzato per ottenere la generazione di organoidi entro 24 ore utilizzando cellule testicolari murine giovanili. I tessuti generati con successo sono stati inizialmente osservati come ammassi cellulari 3D.Negli ambienti ECM, i cluster di celle possedevano margini chiari tra il cluster e l'ambiente circostante. Sono stati osservati anche cluster cellulari che migrano attraverso l'ECM e si fondono insieme. La cultura 3D ECM richiedeva molto più tempo per assemblare strutture de novo rispetto a tutti gli altri metodi di coltura.E la cultura 3D ECM-free ha prodotto i cluster più grandi con un unico cluster grande e compatto all'interno di ogni pozzo della piastra di Petri di agarosio 3D. Per valutare se i modelli organoidi assomigliano al tessuto nativo, i costrutti biologici sono stati sondati per marcatori specifici delle cellule e visualizzati con immunofluorescenza. I metodi 2D ECM e 3D ECM-free producevano organoidi con una morfologia interna altamente mimetica di compartimentazione testicolare.Un'analisi a lungo termine è stata eseguita sugli organoidi assemblati senza ECM 3D. Gli organoidi sono stati coltivati per 14 giorni e quindi sondati per marcatori specifici della cellula e della struttura. Sono state osservate strutture simili a tubuli.Gli organoidi senza ECM 3D sono stati studiati anche per la funzione endocrina in una coltura di 12 settimane con stimolazione della gonadotropina. Il testosterone e l'inibina B sono stati entrambi quantificati da mezzi con condizione organoide. Dopo 12 settimane, le gonadotropine sono state rimosse per 48 ore, causando una diminuzione delle concentrazioni di testosterone e inibina B.Quando le gonadotropine sono state restituite, entrambe le concentrazioni ormonali sono aumentate significativamente, dimostrando una corretta reattività endocrina. L'assemblaggio organoide sfrutta il comportamento autonomo delle cellule testicolari immature vitali. Gli esperimenti creativi possono essere facilmente ideati utilizzando miscele cellulari personalizzate ordinate o ibride.Dopo il seeding cellulare, l'imaging video in diretta o l'imaging time-lapse possono essere utilizzati per quantificare l'auto-assemblaggio organoide. Attraverso la coltura, gli organoidi e il mezzo di condizione possono essere raccolti per analisi istologiche e aminoacidi.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ricerca

Biologia dello sviluppo

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