Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

이 작품은 국립 보건원, 국립 아동 보건 및 인간 개발 연구소 (NICHD) F31 HD089693, 국립 환경 보건 과학 연구소 / 국립 환경 보건 센터 (NIEHS / NCATS) UH3TR01207 및 4UH3ES029073-03, 그리고 토마스 Jkin의 기념 교수에 의해 지원되었다.
저자는 전송 전자 현미경 검사법에 그들의 도움을 에릭 W. 로스 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 노스 웨스턴 대학의 NUANCE 센터의 BioCryo 시설을 사용, 이는 소프트 및 하이브리드 나노 기술 실험 (SHyNE) 자원 (NSF ECCS-1542205)의 지원을받고있다; 재료 연구 센터에서 MRSEC 프로그램 (NSF DMR-1720139); 국제 나노 기술 연구소 (IIN); 그리고 일리노이 주, IIN을 통해. 또한 MRI 프로그램(NSF DMR-1229693)의 지원을 받은 CryoCluster 장비를 사용했습니다. 그림 1의 그래픽은 BioRender.com 사용하여 설계되었습니다.

모든 마우스 실험은 노스웨스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었으며, 모든 절차는 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었습니다.
1. 효소 조직 해리 솔루션의 준비
<ol><li>기저 배양 배지 솔루션(BM)을 사용하여 만들어진 두 가지 효소 솔루션(솔루션 1 및 솔루션 2)을 사용합니다.</li>
	<li>BM을 준비하려면 혈청과 페니실린 연쇄 절제술을 최소 필수 매?...

이 organoid 생성 프로토콜이 완료되면 사용자는 ECM 또는 ECM이 없는 환경에서 고환 구조 및 오르가노이드를 조립할 수 있는 네 가지 문화 기술을 사용할 수 있습니다. 중요한 것은, 4가지 방법 모두를 통해 연구원은 시간 경과 화상 진찰 또는 비디오 기록을 통해 시간이 지남에 따라 비침습적으로 기관지 자기 조립을 관찰하고, 문화 도중 조직을 방해하지 않고, 분비한 호르몬과 사이토카인의 분석을 ...

고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및생리학을연구하기 위한 선구적인 기술이다1,2,,3,,4. 몇 가지 방법은 오르가노이드 생성을 위해 탐구되었습니다; 여기에는 2차원(2D) 및 3차원(3D) 방향 모두에서 다양한 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM 프리 배양 시스템이 포함됩니다. 다른 세대 방법은 별개의 세포 조립 전략을 촉진 할 수있다; 이로 인해 게시된 오르가노이드 모델 간의 높은 수준의 형태학적 및 기능적 가변성을 초래합니다. 이 문서의 목적은 시험관 내 고환 모델의 현재 상태를 논의하고 고환 오르가노이드 실험을 설계 할 때 미래의 조사자를위한 템플릿 역할을하는 것입니다. 본 연구에서는, 4개의 상이한 배양 시스템 원형이 실험 과정 및 생물학적 결과로 정의되고 특징지입니다. 여기에는 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free 및 3D ECM 배양 방법이 포함됩니다. 여기에 제시된 전략은 다른 실험실과 연구 그룹 간에 간단하고 접근 가능하며 매우 재현할 수 있도록 하기 위한 것입니다.
역사적으로 고환에 대 한, 지정 "시험관", 고환 조직 및 세포의 몇 가지 다른 문화 방법에 대 한 사용 되었습니다. 이들 로는 조직/장기 배양 방법(즉, 절제배)5,분리된 반열성 관배기 배양6,고환 세포 배양7,및 드노보 조직 형태발생(즉, 생물학적 구조 및 오르가노이드)1을포함한다. 체외 정자 발생에 대한 첫 번째 조사는 약 100년 전에 수행되었으며, 1920년8년에토끼 고환의 배양, 그리고 1937년 후반에는 마우스 이식9로수행되었다. 이러한 초기 실험 내에서 정자는 문화의 첫 주에 걸쳐 크게 퇴화하는 것으로 관찰되었다, 일부 메이오티분스 분화 세포가 확인되었지만. 이러한 역사적 보고서를 연상시키는 고환 절제 문화는 2011년에 부활하여 최적화되어 testis10을연구할 수 있는 가능한 기술이 되었습니다. 2011년부터, 절제문화는다중 보고11,,12,13에서불임 유능한정자를생산하고 있다. 그러나, 기존의 네이티브 고환 튜블러에 대한 절제 문화의 의존으로 인해, 이러한 최근의 발전은 "ex vivo"고환 기능 및 정자 발생, 유기체의 신체에서 제거 시 유지되거나 재개된 조직 기능의 예로 보다 정확하게 설명된다. 문학에 그것의 보급에도 불구하고, 고환 이질 내의 장기 세균 세포 유지 및 분화는14,,15,,16,,17,,18,특히 완전히 체외 정자 발생 (인간20에서마우스19 및 74에서 35 일)에서 완전히 관찰하기에 충분한 기간 동안 복제하기 어렵다. 100년 전에 경험한 많은 도전들이 오늘날에도 전 생체 내 정자 발생에서 여전히 경험된다는 사실에 흥미롭습니다.
전 생체 내 접근법과 는 달리, 고환 오르가노이드는 세포 공급원(즉, 1차 고환 세포)으로부터 시험관내에서 완전히 생성된 데 노보 조립 마이크로티슈이다. 고환 오르가노이드는 기존의 토착 조직에 대한 필드의 역사적 의존을 회피하고 시험관 내에서 고환 생물학을 완전히 재구성하는 창의적인 전략을 제공합니다. 대부분의 오르가노이드 조직 모델에 의해 공유 되는 여러 요구 사항이 있다; 이들(1)은 생체-모방 조직 형태 또는 건축, (2) 전이 조직의 다중 주요 세포 유형, (3) 자체 조립 또는 자가 조직 생성, (4) 표현된 조직의 기능 및 생리학의 어느 수준을 시뮬레이션하는능력(21,,22,,23,,24)을포함한다. 고환의 경우, 이것은 4가지 주요 특징에서 포착될 수 있습니다: (1) 주요 고환 세포 모형의 포함, 세균, 세르톨리, 레이디그, 관류 및 기타 간질 세포, (2) 세포 지향 조직 조립, (3) 적절한 구획화된 세포 유형이 별도의 관구구체(세균 및 세르톨리) 및 간질 영역(다른 모든 세포 유형), 및 (4) 조직 기능(예를 들어, 생식 호르몬 비결 반응 및 조직 유지 관리)의 어느 정도. 생식 세포 분화 전 생체 외및 시험관 내의 역사적 과제를 고려하여, 생체 내 모방 고환 아키텍처(즉, 반전류 관과 유사한 구조)의 재구성은 고환 생리학의 시뮬레이션(예: 내분비 기능)을 생성하는 데 우선순위가 될 수 있습니다.
공표된 고환 오르가노이드 방법의 대부분은 시판되는 ECM(예를 들어, 콜라겐 또는 독점 ECM 제형)25,,26,,27 또는 맞춤형 C롬(즉, 탈세포화된 고환 ECM 유래 하이드로겔)28,,29,,30을이용한다. 외인성 ECM은 조직 생성을 위한 조립 지원 발판을 제공함으로써 드 노보 조직 형성을 촉진한다. ECM 방법은 일부 생식 세포 존재 및 조직 모방 형태25, 28을,포함하여 조직 형성의 인상적인 수준을부여하고있다. 그러나, 이들이 사용하는 EM은 항상 보편적으로 이용가능한 것은 아니며(즉, 세포제거 ECM 유래 하이드로겔) 및 일부 방법은 정교한 젤 및 세포 파종(예: ECM 및 3D 프린팅의 3층 그라데이션)을25,,,31,32로필요로 한다. 스캐폴드 없는 방법(예: 매달려 있는 드롭 및 비부착 배양 판)33,,34,,35도 ECM 젤이나 스캐폴드 없이 견고하고 재현성이 높은 오르가노이드를 생성하였다. 그러나, 이러한 비계없는 오르가노이드의 조직 형태는 종종 생체 내 고환과 유사하며, 이들 보고서의 대부분은 조직 형성을 촉진하기 위해 생화학 ECM 첨가제를통합33,,34,,36,또는 대안적으로, 강제 세포 집계 및 다짐에 대한 원심분리에 의존34, 세포 지향 적 이주 조직을 연구하는 데 덜 이상적으로 만들기.34
이 원고에 제시된 4개의 organoid 생성 방법은 세포 중심 의 오르가노이드 자기 조립을 가능하게 하는 간단한 세포 파종을 사용하여 각각 ECM 의존성 및 독립적인 전략을 둘 다 포함합니다. 모든 4가지 기술은 동일한 세포 현탁액에서 수행될 수 있거나 사용자 지정 및 세포 형 농축 된 집단을 사용할 수 있습니다. 이러한 방법의 강점은 오르가노이드가 실시간으로 자체 조립되는 것을 관찰하고 고환 구조가 다른 배양 마이크로환경 사이에서 어떻게 자체 조립되는지 직접 비교할 수 있는 능력입니다. 이 4개의 문화 방법 사이 현상 차는 연구 질문 또는 조사자의 주제에 그들의 영향에 대 한 고려 되어야 한다. 각 방법은 24시간 이하 의 생물학적 구조 또는 오르가노이드를 생성합니다. 결론적으로, 여기에 제시된 방법은 시험관 내 고환 기관지 조립, 조직 발달 및 고환 생리학을 연구하기 위한 오르가노이드 조립 기술의 툴킷을 제공한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

고환 오르간노이드는 시험관 내 고환 발달, 정자 발생 및 내분비학을 연구하기위한 도구를 제공합니다. 고환 오르가노이드를 만들기 위해 여러 가지 방법이 개발되었습니다. 이러한 방법의 대부분은 세포외 매트릭스에 의존 (ECM) 드 노보 조직 조립을 촉진하기 위해, 그러나, 생물 모방 형태와 조직의 기능 측면에서 방법 사이에 차이가있다. 또한 게시된 메서드에 대한 직접 비교는 거의 없습니다. 여기서, 직접적인 비교는 제공된 결과와 함께 오르가노이드 생성 프로토콜의 차이를 연구함으로써 이루어집니다. 4개의 고풍화 생성 방법: (1) 2D ECM 프리, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM 프리, 및 (4) 3D ECM 배양이 설명된다. 3개의 1차 벤치마크는 고환 오르간성 생성을 평가하기 위하여 이용되었습니다. 이들은 세포 자기 조립, 주요 세포 모형의 포함 (세르톨리, Leydig, 세균 및 peritubular 세포), 및 적당하게 구획조직 건축입니다. 테스트된 4개의 환경 중, 2D ECM 및 3D ECM 없는 배양은 관과 간질 세포 유형의 드 노보 구획화, 튜블러 유사 구조의 개발 및 확립된 장기 내분비 기능을 포함하여 네이티브 고환과 가장 유사한 내부 형태와 함께 오르가노이드를 생성했습니다. 모든 방법은 분류되지 않은, 1 차적인 골린 고환 세포 현탁액을 활용하고 일반적으로 접근 가능한 배양 자원을 이용했습니다. 이러한 고환 기관지 생성 기술은 시험관 내 고환 기관발생 및 생리학에 대한 연구 이니셔티브를 위한 매우 접근가능하고 재현 가능한 툴킷을 제공합니다.

오르가노이드 생성은 고환 세포가 배양의 72 h 이내에 자가 조립하지 않으면 실패한 것으로 간주되었지만, 여기에 제시된 모든 방법은 청소년 (5 dpp) 뮤린 세포를 사용할 때 24 시간 이내에 조립됩니다. 생물학적 구조 생성의 실패는 확장 배양(72h)이 후에도 자유롭게 중단된 세포(도 1에서0h 컬럼)의 연속으로 제시된다. 조직 자체 조립이 없는 경우, 모든 명백한 세포 클러스터는...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

여기서, 1차 신생아 골린 고환 세포로부터 고환 오르가노이드를 발생시키는 네 가지 방법은 즉, 세포외 매트릭스(ECM) 및 ECM-없는 2D 및 3D 배양 환경으로 기술된다. 이러한 기술은 여러 연구 응용 프로그램을 가지고 있으며 시험관 내고 발달 및 생리학을 연구하는 데 특히 유용합니다.

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

이러한 프로토콜을 통해 사용자는 2D 또는 3D 배양 조건에서 ECM 및 DCM 이없는 환경에서 많은 수의 구조적 모방 및 내분비 기능성 고환 오르가노이드를 생성할 수 있습니다. 이러한 기술은 매우 재현 가능하며 표준 생물학적 실험실 설정에 쉽게 적용되며 일반적인 도구와 재료만 활용합니다. 고환 오르간노이드는 체외에서 정자 발생 및 생식 내분비학을 시뮬레이션하기위한 새로운 도구이며, 언젠가 체외 게임 발생의 연구를 가능하게 할 수 있습니다.먼저 안락사 마우스 수핀을 해부 매트에 놓고 70%에탄올로 복부를 살균하는 것으로 시작합니다. 집게로 하복부의 피부를 텐트로 하고 가위로 엽니다. 복부의 왼쪽 아래 및 오른쪽 잉구인 영역에서 고환을 찾아 꽃병 연기 및 모든 고정 결합 조직에 그들의 연결을 잘라.그런 다음 동물에서 전체 고환을 들어 올립니다. 미리 평형된 BM의 페트리 접시에 놓습니다. 해부 현미경의 밑에, 작은 마이크로 해부 가위로 각 고환의 한쪽 끝에 튜니카 알부진에 있는 작은 절개를 하거나 2개의 미세 한 집게로 부드럽게 찢어서. 절개 반대쪽 끝에서 고환을 들고 있는 동안, 부드럽게 미세한 집게로 짜내고 튜니카의 구멍을 향해 스위핑 모션을 밀어 내고, 이는 고환 조직을 하나의 응집력 있는 조각으로 방출합니다.조직을 작은 조각으로 자른다. 조각을 예동 전열 용해 용액 1 밀리리터에 넣고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 P1000 파이펫으로 고환 조각을 50회 부드럽게 세리라세이션합니다.튜블러가 서로 분리되어 있는지, 그리고 간질 조직으로부터 분리되는지 확인합니다. 덩어리가 남아 있으면 5분 동안 배양하고 다시 세리라울 수 있습니다. 해리 혼합물의 1 밀리리터당 33마이크로리터의 히알루로니다제 스톡 용액을 추가합니다.그런 다음 P1000 파이펫으로 50회 세리라기하고 샘플을 섭씨 37도에서 5분간 배양합니다. 인큐베이션 후 P200 파이펫으로 50회 세리라위드합니다. 눈에 보이는 튜블러 나 세포의 덩어리가 존재하지 않도록 한 후, 샘플의 총 부피의 10 %에 FBS를 추가하여 해리 효소를 담금하고 P200 파이펫으로 여러 번 세례합니다.40 마이크로미터 셀 스트레이너의 중앙을 미디어로 적시고 흡인한 다음 미리 젖은 여조기에 샘플을 추가하고 필터링하여 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 7분 동안 100배 g의 서스펜션을 원심분리합니다. 상체를 버리고 신선한 BM에서 세포를 다시 중단합니다. 트라이판 블루 제외를 사용하여 혈종계에서 실행 가능한 세포를 계산한 다음 원심 분리기를 다시 원심분리기를 다시 사용하여 신선한 BM에서 다시 중단하십시오. 2D ECM 프리 배양의 경우, 플레이트 단일 셀 서스펜션을 4웰 챔버 슬라이드에 직접 플레이트하고 슬라이드를 섭씨 35도 인큐베이터에 넣습니다.2D ECM 배양의 경우, 차가운 일대일 희석 세포 외 매트릭스 배지 100 마이크로리터를 4웰 챔버 슬라이드에 분배하여 젤이 접시 바닥을 덮도록 합니다. ECM이 젤로 중합할 수 있도록 최소 30분 동안 인큐베이터에 슬라이드를 넣은 다음 위에 셀 서스펜션을 추가합니다. 3D ECM 프리 문화를 원해보려면 아가로즈 3D 페트리 요리를 24웰 문화 요리에 넣고 BM 1밀리리터로 덮습니다. 요리는 35도 섭씨 인큐베이터에서 적어도 30 분 동안 BM에서 평형화 한 다음 BM을 버리고 신선한 BM의 1 밀리리터로 다시 한 번 평형을 반복하십시오. 모든 BM을 우물에서 제거하고 3D Petri 접시의 중앙 오목 내부가 아닌 신선한 BM의 200 마이크로 리터를 분배한 다음 마이크로 웰 인서트의 중앙 셀 파종 내부에서 남은 BM을 수집합니다.단일 셀 서스펜션을 중앙 오목으로 분배하고 위아래로 부드럽게 세트리튜트합니다. 문화를 위해 가습섭 씨 35도 인큐베이터에 접시를 넣습니다. 다음 날, 아가로즈 3D 페트리 접시 주변에서 기존 미디어를 천천히 조심스럽게 제거하고 신선한 BM1 밀리리터로 대체하십시오. 오르가노이드는 하룻밤 동안 압축되어 바닥에서 휴식을 취할 수 있어야합니다.3D ECM 배양의 경우, BM내 세포 현탁액의 동일한 부분을 차가운 사전 해동 ECM과 결합하여 단일 셀 서스펜션을 준비한다. 잘 혼합되어 있는지 확인하기 위해 여러 번 세리라위. 그런 다음 즉시 혼합물을 4웰 챔버 슬라이드에 분배하여 플레이트의 전체 바닥을 덮습니다.챔버 슬라이드를 섭씨 35도에서 배양하고 내용물들이 적어도 30분 동안 중합되도록 합니다. 중합 후, 배양 위에 BM의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 문화는 섭씨 35도에서 모든 오르가노이드 모델 유형.모든 문화 유형의 경우 미디어의 절반을 2일마다 신선한 BM으로 교환하십시오. 이 프로토콜은 청소년 골린 고환 세포를 사용하여 24 시간 이내에 오르가노이드 생성을 달성하는 데 사용되었습니다. 성공적으로 생성된 조직은 처음에 3D 세포 클러스터로 관찰되었다.ECM 환경에서 셀 클러스터는 클러스터와 주변 환경 사이에 명확한 여백을 가지고 있습니다. 세포 클러스터는 또한 ECM을 통해 마이그레이션하고 함께 융합하는 것을 관찰했습니다. 3D ECM 배양은 다른 모든 문화 방법보다 드 노보 구조를 조립하는 데 훨씬 더 많은 시간이 필요했습니다.그리고 3D ECM 프리 문화는 3D 아가로즈 페트리 접시의 각 우물 내에서 하나의 크고 컴팩트한 클러스터로 가장 큰 클러스터를 생산했다. 오르가노이드 모델이 토착 조직과 유사한지 여부를 평가하기 위해 생물학적 구조는 세포 별 마커를 위해 프로브되고 면역 형광으로 시각화되었습니다. 2D ECM 및 3D ECM 프리 방법은 고환 구획화의 매우 모방내형태가 있는 오르가노이드를 생산했습니다.3D ECM 이없는 조립 된 오르가노이드에서 장기 분석을 수행했습니다. 오르가노이드는 14 일 동안 배양 된 다음 세포 및 구조 별 마커를 조사했습니다. 튜블러 와 같은 구조물이 관찰되었다.3D ECM 없는 오르가노이드는 또한 생식선 자극을 가진 12 주 문화에 있는 내분비 기능을 위해 공부되었습니다. 테스토스테론과 인히빈 B는 모두 오르가노이드 조절 배지에서 정량화되었다. 후 12 주, gonadotropins에 대 한 제거 되었다 48 시간, 남성 호르몬과 inhibin B 농도 감소 원인.생식선 호르몬 반환 될 때, 두 호르몬 농도 크게 증가, 적절 한 내 분 비 응답성을 보여주는. Organoid 어셈블리는 실행 가능한 미성숙 고환 세포의 자율적 행동을 활용합니다. 창의적인 실험은 맞춤형 셀 정렬 또는 하이브리드 세포 혼합물을 사용하여 쉽게 고안될 수 있습니다.세포 파종 에 이어, 라이브 비디오 이미징 또는 시간 경과 이미징은 오르가노이드 자체 조립을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 전반에 걸쳐, 오르가노이드 및 상태 배지는 조직학 및 아미노 분석 분석을 위해 수집될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

마우스 해마 조직의 예 자궁 Electroporation에와 Organotypic 슬라이스 문화

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

연구

발생학

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

약화 된 인간의 진피를 사용하여 유전자 변형의 Organotypic 피부 문화의 생성

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

부상-유도 노화 및 골격 근육에서 프로그래밍을 Vivo에서 의 평가

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo에서 인간 지방 유래 중간 엽 줄기 세포 형광 질 성 막 염료와 쥐 무릎 관절염 모델에서의 추적

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

유도 및 기본 인간 세포에서 세포 노화의 유효성 검사

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...