Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano (NICHD) F31 HD089693, instituto nacional de ciências da saúde ambiental / Centro Nacional de Promoção de Ciências Translacionais (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 e 4UH3ES029073-03, e o Professor Memorial Thomas J. Watkin.
Os autores gostariam de agradecer a Eric W. Roth por sua ajuda com a microscopia eletrônica de transmissão. Este trabalho fez uso da instalação BioCryo do NUANCE Center da Northwestern University, que recebeu apoio do Recurso Experimental de Nanotecnologia Macia e Híbrida (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); o programa MRSEC (NSF DMR-1720139) no Centro de Pesquisa de Materiais; o Instituto Internacional de Nanotecnologia (IIN); e o Estado de Illinois, através do IIN. Também fez uso do equipamento CryoCluster, que recebeu apoio do programa de ressonância magnética (NSF DMR-1229693). Os gráficos na Figura 1 foram projetados usando BioRender.com.

Todos os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade northwestern, e todos os procedimentos foram realizados sob protocolos aprovados pela IACUC.
1. Preparação de soluções enzimáticas de dissociação de tecidos
<ol><li>Use duas soluções enzimáticas diferentes (Solução 1 e Solução 2), ambas feitas utilizando uma solução média de cultura basal (BM).</li>
	<li>Para preparar bm, adicione soro e penic...

Com a conclusão deste protocolo de geração organoide, o usuário terá quatro técnicas de cultura diferentes disponíveis para a montagem de construtos testiculares e organoides em ambientes livres de ECM ou ECM. É importante ressaltar que todos os quatro métodos permitem ao pesquisador observar não invasivamente a automontagem organoide ao longo do tempo através de imagens de lapso de tempo ou gravação de vídeo, e coletar mídias não invasivamente condicionadas para análise de hormônios e citocinas secreta...

Organoides testiculares são uma técnica pioneira para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e fisiologia in vitro1,2,,3,4. Vários métodos têm sido explorados para a geração organoide; estes incluem uma variedade de sistemas de cultura extracelular (ECM) e sem ECM, tanto em orientações bidimensionais (2D) quanto tridimensionais (3D). Diferentes métodos de geração podem promover estratégias distintas de montagem celular; isso resulta em um alto nível de variabilidade morfológica e funcional entre modelos organoides publicados. O objetivo deste artigo é discutir o estado atual dos modelos testiculares in vitro, e servir de modelo para futuros pesquisadores, ao projetar experimentos organoides testiculares. No presente estudo, quatro arquétipos diferentes do sistema cultural são definidos e caracterizados em processo experimental e desfecho biológico. Estes incluem: métodos de cultura 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free e 3D ECM. As estratégias aqui apresentadas destinam-se a ser simples, acessível e altamente reprodutível entre diferentes laboratórios e grupos de pesquisa.
Historicamente para os testis, a designação "in vitro", tem sido usada para vários métodos culturais diferentes de tecidos e células testiculares. Estes incluem métodos organotípicos de tecido/cultura de órgãos (ou seja, cultura explant)5, cultura de túbulos seminiferosisolados 6,cultura celular testicular7, e métodos de morfogênese de novo tecido (ou seja, construções biológicas e organoides)1. As primeiras investigações sobre espermatogênese in vitro foram realizadas há aproximadamente 100 anos, com a cultura de explants de testígenos de coelho em 19208, e mais tarde em 1937 com explants de camundongos9. Dentro desses experimentos iniciais, a espermatogonia foi observada para se degenerar em grande parte durante a primeira semana de cultura, embora algumas células meioticamente diferenciadas tenham sido identificadas. Lembrando esses relatos históricos, a cultura explant testis foi revivida e otimizada em 2011 para se tornar uma técnica viável para o estudo do testis10. Desde 2011, a cultura explant produz esperma competente em múltiplos relatórios11,12,13. No entanto, devido à dependência da cultura explant em túbulos de testículos nativos pré-existentes, esses avanços recentes são descritos com mais precisão como exemplos de função testicular "ex vivo" e espermatogênese, função tecidual que foi mantida ou retomada após a remoção do corpo de um organismo. Apesar de sua prevalência na literatura, a manutenção de células germinativas de longo prazo e a diferenciação dentro de explants testiculares são desafiadoras para replicar14,15,16,17,18, especialmente em períodos longos o suficiente para observar totalmente a espermatogênese in vitro (~35 dias em camundongos19 e 74 em humanos20). É intrigante perceber que muitos dos mesmos desafios experimentados há 100 anos, ainda são experimentados dentro da espermatogênese ex vivo hoje.
Diferente das abordagens ex vivo, os organoides testiculares são microtissues montados de novo gerados inteiramente in vitro a partir de fontes celulares (ou seja, células testiculares primárias). Organoides testiculares fornecem uma estratégia criativa para contornar a dependência histórica do campo sobre o tecido nativo pré-existente, e para recapitular a biologia testicular completamente in vitro. Existem múltiplos requisitos compartilhados pela maioria dos modelos de tecido organoide; estes incluem (1) morfologia ou arquitetura de tecido simicoético vivo, (2) múltiplos tipos de células principais do tecido representado, (3) auto-montagem ou auto-organização em sua geração, e (4) a capacidade de simular algum nível da função e fisiologia do tecido representado21,,22,,23,,24. Para os testis, isso pode ser capturado em quatro grandes marcas: (1) a inclusão de grandes tipos de células testiculares, germe, Sertoli, Leydig, peritubular, e outras células intersticiais, (2) conjunto de tecidos direcionados por células, (3) tipos de células compartimentadas apropriadamente em compartimentos tubulares separados (germe e Sertoli) e regiões intersticiais (todos os outros tipos de células), e (4) algum grau de função tecidual (por exemplo, secreção hormonal reprodutiva ou respostas teciduais, germe e manutenção celular e diferenciação). Considerando os desafios históricos na manutenção da diferenciação de células germinativas ex vivo e in vitro, a recapitulação de arquiteturas testiculares intramicéticas (ou seja, estruturas semelhantes a túbulos seminiferos) com marcadores adicionais sugerindo simulação de fisiologia testicular (por exemplo, função endócrina), são marcos prioritários para a geração de organoides que podem um dia sustentar na espergenena.
A maioria dos métodos organoides testiculares publicados aproveitam as formulações de ECM disponíveis comercialmente (por exemplo, colágeno ou ecm proprietário)25,,26,27 ou ECMs de origem personalizada (ou seja, testis descelularizados)28,,29,,30. O ECM exógeno promove a formação de tecidos de novo através do fornecimento de um andaime de suporte à montagem para a geração de tecidos. Os métodos de ECM têm proporcionado um nível impressionante de formação tecidual, incluindo alguma presença de células germinativas e morfologia mímica tecidual25,,28. No entanto, os ECMs que utilizam nem sempre estão disponíveis universalmente (ou seja, hidrogéis derivados do ECM), e alguns métodos requerem orientações sofisticadas de gel e semeadura celular (por exemplo, gradientes de 3 camadas de ECM e impressão 3D)25,,31,,32. Métodos livres de andaimes (por exemplo, gota suspensa e placas de cultura não adesê),33,,34,35 também geraram organoides robustos e altamente reprodutíveis sem a necessidade de géis ECM ou andaimes. No entanto, a morfologia tecidual desses organoides livres de andaimes é muitas vezes diferente dos testículos in vivo, e a maioria desses relatórios incorpora um aditivo bioquímico de ECM para promover a formação de tecidos33,,34,,36ou, alternativamente, dependem de centrifugação para agregação celular forçada e compactação34, tornando-os menos ideais para estudar migração e auto-organização dirigidas por células.
Os quatro métodos de geração organoide apresentados neste manuscrito incluem estratégias dependentes do ECM e independentes, cada uma utilizando semeadura celular simples que permite a observação da automontagem organoide orientada por células. Todas as quatro técnicas podem ser realizadas a partir das mesmas suspensões celulares ou podem fazer uso de populações personalizadas e enriquecidas do tipo celular. Uma força desses métodos é a capacidade de observar organoides auto-montados em tempo real, e comparar diretamente como estruturas testiculares se auto-reúnem entre diferentes microambientes culturais. As diferenças fenotípicas entre esses quatro métodos culturais devem ser consideradas por seu impacto na questão da pesquisa ou assunto do pesquisador. Cada método produz construções biológicas ou organoides dentro de 24 h ou menos. Em conclusão, os métodos aqui apresentados fornecem um kit de ferramentas de técnicas de montagem organoide para o estudo do montagem organoide testicular, desenvolvimento de tecidos e fisiologia testicular in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Organoides testiculares fornecem uma ferramenta para estudar desenvolvimento testicular, espermatogênese e endocrinologia in vitro. Vários métodos foram desenvolvidos para criar organoides testiculares. Muitos desses métodos dependem da matriz extracelular (ECM) para promover a montagem de novos tecidos, no entanto, há diferenças entre métodos em termos de morfologia biomimética e função dos tecidos. Além disso, há poucas comparações diretas de métodos publicados. Aqui, uma comparação direta é feita estudando diferenças nos protocolos de geração organoide, com resultados fornecidos. São descritos quatro métodos de geração arquetípica: (1) cultura ECM 2D, (2) ECM 2D, (3) 3D ECM livre e (4) cultura ECM 3D. Foram utilizados três benchmarks primários para avaliar a geração organoide testicular. São células de automontagem celular, inclusão de grandes tipos celulares (sertoli, Leydig, germes e células peritubulares) e arquitetura de tecido compartimentalizada adequadamente. Dos quatro ambientes testados, culturas 2D ECM e 3D sem ECM geraram organoides com morfologias internas mais semelhantes aos testículos nativos, incluindo a compartimentação de novo dos tipos de células tubulares versus intersticiais, o desenvolvimento de estruturas semelhantes a túbulos e uma função endócrina estabelecida a longo prazo. Todos os métodos estudados utilizaram suspensões de células testiculares murinas não variadas e utilizaram recursos culturais comumente acessíveis. Essas técnicas de geração organoide testicular fornecem um kit de ferramentas altamente acessível e reprodutível para iniciativas de pesquisa sobre organogênese testicular e fisiologia in vitro.

A geração organoide foi considerada sem sucesso se as células testiculares não se auto-montarem dentro de 72 h de cultura, no entanto, todos os métodos aqui apresentados se reúnem dentro de 24 horas quando se utiliza células murinas juvenis (5 dpp). Falha na geração de construções biológicas apresentada como continuação de células livremente suspensas (coluna 0 h na Figura 1) mesmo após cultura estendida (72 h). Na ausência de auto-montagem tecidual, quaisquer aglomerados ce...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Aqui, são descritos quatro métodos para a geração de organoides testiculares testiculares de células testiculares neonatais primárias, ou seja, matriz extracelular (ECM) e ambientes de cultura 2D e 3D livres de ECM. Essas técnicas possuem múltiplas aplicações de pesquisa e são especialmente úteis para estudar desenvolvimento testicular e fisiologia in vitro.

Geração extra-baseada em matriz celular e extra-celular livre de organoides testiculares de murina

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Esses protocolos permitem ao usuário produzir um grande número de organoides testiculares funcionais estruturalmente miméticos e endócrinos em ambientes livres de ECM e DCM em condições de cultura 2D ou 3D. Essas técnicas são altamente reprodutíveis, facilmente aplicadas a configurações de laboratório biológicos padrão, e utilizam apenas ferramentas e materiais comuns. Organoides testiculares são uma nova ferramenta para simular endocrinologia endocrinologia reprodutiva in vitro, e podem um dia permitir o estudo da gametogênese in vitro.Comece colocando o supino de rato eutanizado em um tapete de dissecção e esterilizando o abdômen com 70% de etanol. Tenda a pele do abdômen inferior com fórceps e abra-a com uma tesoura. Localize os testículos nas regiões inferior esquerda e direita do abdômen e corte suas conexões com os vasos deferidores e qualquer tecido conjuntivo de ancoragem.Então levante todos os testículos do animal. Coloque-o em uma placa de Petri de BM pré-equilibrada. Sob um microscópio de dissecção, faça uma pequena incisão na tunica albuginea em uma extremidade de cada teste com uma pequena tesoura de micro dissecção ou rasgando suavemente com dois fórceps finos. Enquanto segura o testículo da extremidade oposta da incisão, aperte-o suavemente com fórceps finos e empurre em um movimento de varredura em direção ao buraco na tunica, que liberará o tecido testicular como uma peça coesa.Corte o tecido em pedaços menores. Coloque as peças em um mililitro de solução de dissociação pré-dia e incuba-as a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após a incubação, triturar suavemente as peças de testículos 50 vezes com uma pipeta P1000.Certifique-se de que os túbulos se separem um do outro e do tecido intersticial. Se os aglomerados permanecerem, incubar por mais cinco minutos e triturar novamente. Adicione 33 microlitros de solução de estoque de hialuronidase por um mililitro da mistura de dissociação.Em seguida, triturar 50 vezes com uma pipeta P1000 e incubar a amostra a 37 graus Celsius por cinco minutos. Após a incubação, tritura-a 50 vezes com uma pipeta P200. Depois de garantir que não há túbulos visíveis ou aglomerados de células, saciie as enzimas de dissociação adicionando FBS a 10% do volume total da amostra e tritura-a várias vezes com uma pipeta P200.Molhe o centro de um coador de células de 40 micrômetros com mídia e aspire-o, em seguida, adicione a amostra ao coador pré-molhado e filtre-o para produzir uma suspensão unicelular. Centrifugar a suspensão a 100 vezes g por sete minutos. Descarte o supernatante e resuspenque as células em BM fresco. Conte as células viáveis em um hemócito usando a exclusão azul trypan, em seguida, re-centrífugas e resuspensá-las em BM fresco. Para a cultura livre de ECM 2D, as suspensões de placa única de células diretamente em lâminas de câmara de quatro poços e colocam os slides em uma incubadora de 35 graus Celsius.Para cultura 2D ECM, dispense 100 microliters de meio de matriz extracelular diluído frio de um para um em um slide de câmara de quatro poços, garantindo que o gel cubra o fundo do prato. Coloque o slide na incubadora por um mínimo de 30 minutos para permitir que o ECM polimerize em um gel e adicione a suspensão da célula por cima. Para uma cultura 3D sem ECM, coloque pratos 3D Petri em uma placa de cultura de 24 poços e cubra-os com um mililitro de BM. Deixe os pratos equilibrados em MMC por pelo menos 30 minutos em uma incubadora Celsius de 35 graus, depois descarte o BM e repita o equilíbrio mais uma vez com um mililitro de BM fresco. Remova todo o BM do poço e dispense 200 microliters de BM fresco ao redor, mas não dentro do recesso central da placa 3D Petri, em seguida, coletar qualquer BM restante de dentro da célula central recesso de semeadura da inserção do micro poço.Dispense a suspensão de célula única no recesso central e tritura suavemente para cima e para baixo. Coloque o prato em uma incubadora umidificada de 35 graus Celsius para a cultura. No dia seguinte, remova lentamente e cuidadosamente a mídia existente de toda a placa 3D Petri agarose e substitua por um mililitro de BM fresco. Os organoides deveriam ter compactado durante a noite, permitindo que descansassem na parte inferior.Para a cultura 3D ECM, prepare uma suspensão unicelular combinando partes iguais da suspensão celular em BM com ECM pré-descongelado a frio. Triturar várias vezes para garantir que está bem misturado. Em seguida, dispense imediatamente a mistura em um slide de câmara de quatro poços, garantindo que ela cubra toda a parte inferior da placa.Incubar os slides da câmara a 35 graus Celsius e permitir que seu conteúdo polimerize por pelo menos 30 minutos. Após a polimerização, adicione 500 microliters de MMC em cima da cultura. Cultura todos os tipos de modelo organoide a 35 graus Celsius.Para todos os tipos de cultura, troque metade de seus meios de comunicação com BM fresco a cada dois dias. Este protocolo foi usado para alcançar a geração organoide dentro de 24 horas usando células testiculares murinas juvenis. Tecidos gerados com sucesso foram inicialmente observados como aglomerados de células 3D.Em ambientes ECM, os aglomerados celulares possuíam margens claras entre o aglomerado e seu ambiente circundante. Também foram observados aglomerados celulares para migrar através do ECM e fundir-se juntos. A cultura 3D ECM exigiu significativamente mais tempo para montar estruturas de novo do que todos os outros métodos culturais.E a cultura 3D livre de ECM produziu os maiores clusters com um único grande e compacto cluster dentro de cada poço da placa 3D agarose Petri. Para avaliar se os modelos organoides se assemelham ao tecido nativo, os construtos biológicos foram sondados para marcadores específicos de células e visualizados com imunofluorescência. Os métodos 2D ECM e 3D ECM produzidos organoides com uma morfologia interna altamente mimética de compartimentação testicular.Foi realizada uma análise de longo prazo nos organoides montados sem ECM 3D. Os organoides foram cultivados por 14 dias e, em seguida, sondados para marcadores específicos de células e estruturas. Foram observadas estruturas semelhantes a túbulos.Os organoides livres de ECM 3D também foram estudados para função endócrina em uma cultura de 12 semanas com estimulação de gonadotropina. Testosterona e inhibina B foram quantificadas do meio organoide. Após 12 semanas, as gonadotropinas foram removidas por 48 horas, fazendo com que as concentrações de testosterona e inhibin B diminuíssem.Quando as gonadotropinas foram devolvidas, ambas as concentrações hormonais aumentaram significativamente, demonstrando a resposta endócrina adequada. A montagem organoide aproveita o comportamento autônomo de células testiculares imaturas viáveis. Experimentos criativos podem ser facilmente concebidos através do uso de misturas personalizadas de células classificadas ou híbridas.Após a semeadura celular, imagens de vídeo ao vivo ou imagens de lapso de tempo podem ser usadas para quantificar a automontagem organoide. Em toda a cultura, organoides e meios de condição podem ser coletados para análises histológicas e de ensaios aminosinos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

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Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Biologia do Desenvolvimento

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Geração de Culturas Geneticamente Modificados Pele organotï¿½icas Usando desvitalizado derme humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento de células embrionárias de murino hegemônicos endoteliais

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

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Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Na Vivo Rastreamento de adiposo-derivados mesenquimais células estaminais humanas em um modelo de osteoartrite do joelho de rato com corante fluorescente membrana lipofílico

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Geração de insulina tridimensional, livre de andaime expressando Pancreatoids do Mouse progenitoras pancreáticas em Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Geração de Organoids de vias biliares extra-hepáticas Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Geração de organóides endometriais primários humanos multicelulares

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...