Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano (NICHD) F31 HD089693, el Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental / Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 y 4UH3ES029073-03, y el Profesor Memorial de Thomas J. Watkin.
Los autores quieren agradecer a Eric W. Roth por su ayuda con la microscopía electrónica de transmisión. Este trabajo hizo uso de las instalaciones de BioCryo del Centro NUANCE de la Universidad Northwestern, que ha recibido el apoyo del Recurso Experimental de Nanotecnología Suave e Híbrida (SHyNE) (NSF ECCS-1542205); el programa MRSEC (NSF DMR-1720139) en el Centro de Investigación de Materiales; el Instituto Internacional de Nanotecnología (IIN); y el estado de Illinois, a través del IIN. También hizo uso del equipo CryoCluster, que ha recibido apoyo del programa de RMN (NSF DMR-1229693). Los gráficos de la Figura 1 se diseñaron con BioRender.com.

Todos los experimentos con ratones fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad Northwestern, y todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo protocolos aprobados por la CICIC.
1. Preparación de soluciones enzimáticas de disociación tisular
<ol><li>Utilice dos soluciones enzimáticas diferentes (Solución 1 y Solución 2), ambas realizadas con una solución de medio de cultivo basal (BM).</li>
	<li>Para preparar BM, añada suero y peni...

Con la finalización de este protocolo de generación de organoides, el usuario tendrá cuatro técnicas de cultivo diferentes disponibles para ensamblar construcciones testiculares y organoides en entornos libres de ECM o ECM. Es importante destacar que los cuatro métodos permiten al investigador observar no invasivamente el autoensamble organoide a lo largo del tiempo a través de imágenes de lapso de tiempo o grabación de vídeo, y recopilar de forma no invasiva medios condicionados para el análisis de hormonas y ...

Los organoides testiculares son una técnica pionera para el estudio del desarrollo testicular, la espermatogénesis y la fisiología in vitro1,2,3,4. Se han explorado varios métodos para la generación de organoides; estos incluyen una variedad de sistemas de cultivo libre de ECM y matriz extracelular (ECM), tanto en orientaciones bidimensionales (2D) como tridimensionales (3D). Diferentes métodos de generación pueden promover estrategias de ensamblaje celular distintas; esto da como resultado un alto nivel de variabilidad morfológica y funcional entre los modelos organoides publicados. El propósito de este artículo es discutir el estado actual de los modelos testiculares in vitro, y servir como una plantilla para futuros investigadores, al diseñar experimentos organoides testiculares. Dentro del presente estudio, se definen y caracterizan cuatro arquetipos diferentes del sistema de cultivo en el proceso experimental y el resultado biológico. Estos incluyen: 2D ECM-Free, 2D ECM, 3D ECM-Free, y 3D ECM métodos de referencia cultural. Las estrategias presentadas en el presente documento pretenden ser sencillas, accesibles y altamente reproducibles entre diferentes laboratorios y grupos de investigación.
Históricamente para los testículos, la designación "in vitro", se ha utilizado para varios métodos de cultivo diferentes de tejidos testiculares y células. Estos incluyen métodos de cultivo de tejidos/órganos organotípicos (es decir, cultivo de explantes)5, cultivo aislado de tubulos semíferos6,cultivo celular testicular7, y métodos de morfogénesis de tejido de novo (es decir, construcciones biológicas y organoides)1. Las primeras investigaciones sobre espermatogénesis in vitro se realizaron hace aproximadamente 100 años, con el cultivo de conejo testis explants en 19208,y más tarde en 1937 con explantes de ratón9. Dentro de estos experimentos iniciales se observó que la espermatogonia degeneraba en gran medida a lo largo de la primera semana de cultivo, aunque se identificaron algunas células meiotically diferenciadoras. Reminiscente de estos informes históricos, el cultivo de explant testis fue revivido y optimizado en 2011 para convertirse en una técnica factible para el estudio de los testis10. Desde 2011, el cultivo de explant ha producido espermatozoides competentes para la fertilidad en múltiples informes11,12,13. Sin embargo, debido a la dependencia del cultivo explantado de los túbulos nativos preexistentes, estos avances recientes se describen con mayor precisión como ejemplos de función testicular "ex vivo" y espermatogénesis, función tisular que se mantuvo o se reanudó al extraerse del cuerpo de un organismo. A pesar de su prevalencia en la literatura, el mantenimiento y la diferenciación de células germinales a largo plazo dentro de los explantes testiculares es difícil replicar14,15,16,17,18, especialmente en los períodos de tiempo suficiente para observar completamente la espermatogénesis in vitro (35 días en ratones19 y 74 en humanos20).18 Es intrigante apreciar que muchos de los mismos desafíos experimentados hace 100 años, todavía se experimentan dentro de la espermatogénesis ex vivo hoy en día.
Diferentes de los enfoques ex vivo, los organoides testiculares son microtiss ensambladas de novo generadas enteramente in vitro a partir de fuentes celulares (es decir, células testiculares primarias). Los organoides testiculares proporcionan una estrategia creativa para eludir la dependencia histórica del campo del tejido nativo preexistente, y para recapitular la biología testicular completamente in vitro. Hay múltiples requisitos compartidos por la mayoría de los modelos de tejido organoides; estos incluyen (1) morfología o arquitectura de tejido in vivo-mimético, (2) múltiples tipos celulares principales del tejido representado, (3) autoensamble o auto-organización en su generación, y (4) la capacidad de simular algún nivel de la función del tejido representado y la fisiología21,,22,,23,,24. Para los testículos, esto se puede capturar en cuatro señas de identidad principales: (1) la inclusión de los principales tipos de células testiculares, germen, Sertoli, Leydig, células peritubulares y otras células intersticiales, (2) conjunto de tejidos dirigidos por células, (3) tipos de células adecuadamente compartimentadas en compartimentos tubulares separados (germen y sertoli) y regiones intersticiales (todos los demás tipos de células), y (4) cierto grado de función tisular (por ejemplo, secreción de hormonas reproductivas o respuestas de tejidos, y mantenimiento y diferenciación de células germinales). Teniendo en cuenta los desafíos históricos en el mantenimiento de la diferenciación de células germinales ex vivo e in vitro, la recapitulación de arquitecturas testiculares in vivo-miméticas (es decir, estructuras que se asemejan a túbulos seminíferos) con marcadores adicionales que sugieren la simulación de la fisiología testicular (por ejemplo, función endocrina), son hitos prioritarios hacia la generación de organoides que algún día podrían sostener espermatogénesis in vitro.
La mayoría de los métodos organoides testiculares publicados aprovechan el ECM disponible comercialmente (por ejemplo, formulaciones de colágeno o ECM patentadas)25,26,27 o ECM de origen personalizado (es decir, testículos decelularizados hidrogeles derivados de ECM)28,,29,30. El ECM exógeno promueve la formación de tejido de novo proporcionando un andamio de apoyo al ensamblaje para la generación de tejidos. Los métodos de ECM han dado un nivel impresionante de formación de tejidos, incluyendo cierta presencia de células germinales y morfología de los tejidos miméticos25,,28. Sin embargo, los ECM que utilizan no siempre están disponibles universalmente (es decir, hidrogeles descelularizados derivados de ECM), y algunos métodos requieren sofisticadas orientaciones de siembra de gel y células (por ejemplo, gradientes de 3 capas de ECM e impresión 3D)25,,31,,32. Los métodos libres de andamios (por ejemplo, gota colgante y placas de cultivo no adherentes)33,34,35 también han generado organoides robustos y altamente reproducibles sin necesidad de geles ECM o andamios. Sin embargo, la morfología tisular de estos organoides libres de andamios es a menudo diferente a los testículos in vivo, y la mayoría de estos informes incorporan un aditivo ECM bioquímico para promover la formación de tejidos33,,34,36, o alternativamente, dependen de la centrifugación para la agregación de células forzadas y la compactación34,haciéndolos menos ideales para el estudio de la migración dirigida por células y la autoorganización.
Los cuatro métodos de generación de organoides presentados en este manuscrito incluyen estrategias tanto dependientes de ECM como estrategias independientes, cada una de las dos utilizando una simple siembra celular que permite la observación del autoensamble organoide impulsado por células. Las cuatro técnicas se pueden realizar desde las mismas suspensiones celulares o pueden hacer uso de poblaciones personalizadas y enriquecidas de tipo celular. Una fuerza de estos métodos es la capacidad de observar organoides autoensamblados en tiempo real, y comparar directamente cómo las estructuras testiculares se autoensamblan entre diferentes microambientes de cultivo. Las diferencias fenotípicas entre estos cuatro métodos de cultivo deben ser consideradas por su impacto en la cuestión de investigación o sujeto del investigador. Cada método produce construcciones biológicas u organoides dentro de 24 h o menos. En conclusión, los métodos presentados aquí proporcionan un conjunto de herramientas de técnicas de ensamblaje organoides para el estudio del ensamblaje organoide testicular, desarrollo de tejidos y fisiología testicular in vitro.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Los organoides testiculares proporcionan una herramienta para estudiar el desarrollo testicular, espermatogénesis, y la endocrinología in vitro. Se han desarrollado varios métodos para crear organoides testiculares. Muchos de estos métodos se basan en la matriz extracelular (ECM) para promover el ensamblaje de tejido de novo, sin embargo, hay diferencias entre los métodos en términos de morfología biomimética y función de los tejidos. Además, hay pocas comparaciones directas de métodos publicados. Aquí, se hace una comparación directa mediante el estudio de las diferencias en los protocolos de generación de organoides, con los resultados proporcionados. Se describen cuatro métodos de generación arquetípica: (1) 2D sin ECM, (2) ECM 2D, (3) sin ECM 3D y (4) se describe la referencia cultural 3D ECM. Se utilizaron tres puntos de referencia primarios para evaluar la generación de organoides testiculares. Se trata de autoensamble celular, inclusión de los principales tipos celulares (Sertoli, Leydig, germen y células peritubulares), y arquitectura de tejido compartimentada adecuadamente. De los cuatro entornos probados, los cultivos libres de ECM 2D y ECM 3D generaron organoides con morfologías internas más similares a los testículos nativos, incluyendo la compartimentación de novo de los tipos de células tubulares frente a intersticiales, el desarrollo de estructuras similares a los tubulos y una función endocrina establecida a largo plazo. Todos los métodos estudiados utilizaron suspensión de células testiculares murinas primarias no ordenadas y utilizaron recursos de cultivo comúnmente accesibles. Estas técnicas de generación de organoides testiculares proporcionan un conjunto de herramientas altamente accesible y reproducible para iniciativas de investigación en organogénesis testicular y fisiología in vitro.

La generación de organoides se consideró infructuosa si las células testiculares no se autoensamblaban dentro de 72 h de cultivo, sin embargo, todos los métodos presentados aquí se ensamblan dentro de las 24 h cuando se utilizan células murinas juveniles (5 dpp). Fallo de la generación de construcción biológica presentada como una continuación de células suspendidas libremente (columna de 0 h en la Figura 1) incluso después del cultivo extendido (72 h). En ausencia de autoensambl...

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Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Aquí, se describen cuatro métodos para generar organoides testiculares a partir de células testiculares murinas neonatales primarias, es decir, matriz extracelular (ECM) y entornos de cultivo 2D y 3D libres de ECM. Estas técnicas tienen múltiples aplicaciones de investigación y son especialmente útiles para el estudio del desarrollo testicular y la fisiología in vitro.

Extra Cellular Matrix-Based y Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Estos protocolos permiten al usuario producir un gran número de organoides testiculares funcionales estructuralmente miméticos y endocrinos en entornos libres de ECM y DCM en condiciones de cultivo 2D o 3D. Estas técnicas son altamente reproducibles, se aplican fácilmente a entornos de laboratorio biológicos estándar, y sólo utilizan herramientas y materiales comunes. Los organoides testiculares son una herramienta novedosa para simular la espermatogénesis y la endocrinología reproductiva in vitro, y algún día podrían permitir el estudio de la gametogénesis in vitro.Comience colocando el ratón eutanizado supino en una estera de disección y esterilizando el abdomen con 70%etanol. Carpa la piel de la parte inferior del abdomen con fórceps y abrirlo con tijeras. Localice los testículos en las regiones inguinales inferiores izquierda y derecha del abdomen y corte sus conexiones con los vasos deferentes y cualquier tejido conectivo de anclaje.A continuación, levante todos los testículos del animal. Colóquelo en un plato Petri de BM preequilibrado. Bajo un microscopio de disección, haz una pequeña incisión en la tunica albuginea en un extremo de cada testículo con pequeñas tijeras de micro disección o rasgando suavemente con dos fórceps finos. Mientras sostiene los testículos desde el extremo opuesto de la incisión, apriételo suavemente con fórceps finos y empuje en un movimiento de barrido hacia el agujero en la túnica, que liberará el tejido testicular como una pieza cohesiva.Corta el tejido en trozos más pequeños. Coloque las piezas en un mililitro de solución de disociación precalentada uno e incubarlas a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, tritura suavemente las piezas de los testículos 50 veces con una pipeta P1000.Asegúrese de que los túbulos se separan entre sí y del tejido intersticial. Si quedan grumos, incubar durante cinco minutos más y triturar de nuevo. Añadir 33 microlitros de solución de material de hialuronidasa por mililitro de la mezcla de disociación.A continuación, triturar 50 veces con una pipeta P1000 e incubar la muestra a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de la incubación, triturarlo 50 veces con una pipeta P200. Después de asegurarse de que no haya túbulos visibles o grupos de células, apague las enzimas de disociación añadiendo FBS al 10% del volumen total de la muestra y triturarlo varias veces con una pipeta P200.Humedezca el centro de un colador celular de 40 micrómetros con medios y aspirarlo, luego agregue la muestra al colador pre-humedeido y filtre para producir una suspensión de una sola célula. Centrifugar la suspensión a 100 g durante siete minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células en BM fresco. Contar las células viables en un hemocicómetro usando exclusión azul trypan, luego volver a centrifugarlas y resuspenderlas en BM fresco. Para el cultivo libre de ECM 2D, placa suspensión de una sola célula directamente en los portaobjetos de cuatro pozos de la cámara y coloque los portaobjetos en una incubadora de 35 grados Celsius.Para el cultivo ECM 2D, dispensar 100 microlitros de medio de matriz extracelular diluido en frío uno a uno en un portaobjetos de cámara de cuatro pozos, asegurando que el gel cubra el fondo del plato. Coloque el portaobjetos en la incubadora durante un mínimo de 30 minutos para permitir que el ECM se polimerice en un gel y, a continuación, agregue la suspensión celular en la parte superior. Para una cultura libre de ECM 3D, coloque los platos de agarosa 3D Petri en un plato de cultivo de 24 pozos y cúbralos con un mililitro de BM. Deje que los platos se equilibren en BM durante al menos 30 minutos en una incubadora de 35 grados Celsius, luego deseche el BM y repita el equilibrio una vez más con un mililitro de BM fresco. Retire todo BM del pozo y dispensar 200 microlitros de BM fresco alrededor pero no dentro del hueco central de la placa 3D Petri, luego recoja cualquier BM restante desde el interior del hueco de siembra de la celda central del micro inserto de pozo.Dispensar la suspensión de una sola célula en el hueco central y triturar suavemente hacia arriba y hacia abajo. Coloque el plato en una incubadora humidificada de 35 grados Celsius para el cultivo. Al día siguiente, retire lentamente y cuidadosamente los medios existentes de alrededor de la placa de agarosa 3D Petri y sustitúyalo con un mililitro de BM fresco. Los organoides deben haberse compactado durante la noche, lo que les permite descansar en la parte inferior.Para el cultivo de ECM 3D, prepare una suspensión de una sola célula combinando partes iguales de la suspensión celular en BM con ECM predescongelado en frío. Triturar varias veces para asegurar que está bien mezclado. A continuación, dispensar inmediatamente la mezcla en un portaobjetos de cuatro pozos, asegurándose de que cubra toda la parte inferior de la placa.Incubar los portaobjetos de la cámara a 35 grados centígrados y permitir que su contenido se polimerice durante al menos 30 minutos. Después de la polimerización, añadir 500 microlitros de BM en la parte superior del cultivo. Cultivo de todos los tipos de modelos organoides a 35 grados Celsius.Para todos los tipos de cultivo, cambie la mitad de sus medios con BM fresco cada dos días. Este protocolo se utilizó para lograr la generación de organoides en 24 horas utilizando células testiculares murinas juveniles. Los tejidos generados con éxito se observaron inicialmente como grupos celulares 3D.En entornos ECM, los clústeres de celdas poseían márgenes claros entre el clúster y su entorno circundante. También se observaron clústeres celulares para migrar a través del ECM y fusionarse. La cultura 3D ECM requirió mucho más tiempo para ensamblar estructuras de novo que todos los demás métodos de cultivo.Y el cultivo libre de ECM 3D produjo los clusters más grandes con un solo racimo grande y compacto dentro de cada pozo de la agarosa Petri 3D. Para evaluar si los modelos organoides se asemejan al tejido nativo, las construcciones biológicas fueron sondeadas para marcadores específicos de la célula y visualizadas con inmunofluorescencia. Los métodos libres de ECM 2D y ECM 3D produjeron organoides con una morfología interna altamente mimética de compartimentación testicular.Se realizó un análisis a largo plazo en los organoides ensamblados 3D sin ECM. Los organoides fueron cultivados durante 14 días y luego sondeados en busca de marcadores celulares y específicos de la estructura. Se observaron estructuras similares a tubulas.Los organoides libres de ECM 3D también fueron estudiados para la función endocrina en un cultivo de 12 semanas con estimulación de gonadotropina. Testosterona e inhibición B se cuantificaron a partir de medio condicionado organoides. Después de 12 semanas, gonadotropinas fueron eliminados durante 48 horas, causando testosterona y concentraciones de inhibición B para disminuir.Cuando se devolvieron las gonadotropinas, ambas concentraciones hormonales aumentaron significativamente, demostrando una capacidad de respuesta endocrina adecuada. El ensamblaje organoide aprovecha el comportamiento autónomo de las células testiculares inmaduras viables. Los experimentos creativos se pueden idear fácilmente mediante el uso de mezclas de celdas personalizadas ordenadas o híbridas.Después de la siembra celular, se pueden utilizar imágenes de video en vivo o imágenes de lapso de tiempo para cuantificar el autoensamble organoide. En todo el cultivo, se pueden recolectar organoides y medios de condición para análisis histológicos y de ensayos amino.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Investigación

Biología del Desarrollo

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Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Aislamiento de las células murinas embrionarias Hemogenic endoteliales

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Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

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Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

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In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

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Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

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