Name: extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids
Uploaded: 2020-10-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsangelişimi Enstitüsü (NICHD) F31 HD089693, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü / Ulusal Merkezi İlerletme Çeviri Bilimleri (NIEHS/NCATS) UH3TR001207 ve 4UH3ES029073-03 ve Thomas J. Watkin's Professor Memorialship tarafından finanse edilmiştir.
Yazarlar iletim elektron mikroskobu ile yardım için Eric W. Roth teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma, Yumuşak ve Hibrid Nanoteknoloji Deneysel (SHyNE) Kaynak (NSF ECCS-1542205) destek aldı Northwestern Üniversitesi'nin NUANCE Merkezi, BioCryo tesisi kullanımı yaptı; Malzeme Araştırma Merkezi'ndeki MRSEC programı (NSF DMR-1720139); Uluslararası Nanoteknoloji Enstitüsü (IIN); ve Illinois Eyaleti, IIN aracılığıyla. Ayrıca MRI programından (NSF DMR-1229693) destek alan CryoCluster ekipmanından da yararlanmıştır. Şekil 1'deki grafikler BioRender.com kullanılarak tasarlanmıştır.

Tüm fare deneyleri Northwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve tüm prosedürler IACUC onaylı protokoller altında gerçekleştirildi.
1. Enzimatik doku-dissosiyasyon çözeltilerinin hazırlanması
<ol><li>Her ikisi de bazal kültür orta çözeltisi (BM) kullanılarak yapılan iki farklı enzimatik çözüm (Çözüm 1 ve Çözüm 2) kullanın.</li>
	<li>BM hazırlamak için serum ve penisilin-streptomisini sırasıyla %10 ve ...

Bu organoid nesil protokolünün tamamlanması ile, kullanıcı testis yapıları ve organoidler ecm veya ECM içermeyen ortamlarda montajı için onlara mevcut dört farklı kültür teknikleri olacaktır. Daha da önemlisi, dört yöntem de araştırmacının zaman atlamalı görüntüleme veya video kaydı yoluyla organoid kendi kendini birleştirmeyi zaman içinde non-invaziv olarak gözlemlemesine ve kültür sırasında dokuları rahatsız etmeden salgılanan hormonların ve sitokinlerin analizi için koşullandır...

Testis organoidleri testis gelişimi, spermatogenez ve in vitro1,2,,3,,4fizyolojisi üzerinde çalışmak için öncü bir tekniktir. Organoid nesil için çeşitli yöntemler araştırılmıştır; bunlar, hem iki boyutlu (2B) hem de üç boyutlu (3D) oryantasyonlarda çeşitli hücre dışı matris (ECM) ve ECM içermeyen kültür sistemlerini içerir. Farklı nesil yöntemleri farklı hücresel montaj stratejileri teşvik edebilir; bu da yayınlanmış organoid modeller arasında yüksek düzeyde morfolojik ve fonksiyonel değişkenlik ile sonuçlanır. Bu makalenin amacı in vitro testis modellerinin mevcut durumunu tartışmak ve testis organoid deneylertasarlarken, gelecekteki araştırmacılar için bir şablon olarak hizmet etmektir. Bu çalışmada, deneysel süreç ve biyolojik sonuç olarak dört farklı kültür sistemi arketipi tanımlanmış ve karakterize edilse de. Bunlar: 2D ECM'siz, 2D ECM, 3D ECM-Free ve 3D ECM kültür yöntemleri. Burada sunulan stratejilerin farklı laboratuvarlar ve araştırma grupları arasında basit, erişilebilir ve son derece tekrarlanabilir olması amaçlanmıştır.
Tarihsel testisler için, "in vitro" adı, testis dokuları ve hücrelerinin birkaç farklı kültür yöntemleri için kullanılmıştır. Bunlar arasında organotipik doku/organ kültürü yöntemleri (örn. eksplant kültürü)5,izole seminiferous tübül kültürü6, testis hücre kültürü7, de novo doku morfogenezi (yani, biyolojik yapılar ve organoidler)1. In vitro spermatogenez ile ilgili ilk araştırmalar yaklaşık 100 yıl önce, tavşan testis explants kültürü ile 19208, ve daha sonra 1937 yılında fare eksplants9ile yapılmıştır . Bu ilk deneylerde spermatogonia'nın kültürün ilk haftasında büyük ölçüde dejenere olduğu gözlenmiştir, ancak bazı meiotically ayırıcı hücreler tanımlanmıştır. Bu tarihsel raporları hatırlatan testis explant kültürü 2011 yılında yeniden canlandırıldı ve testis10'unincelenmesi için uygun bir teknik haline getirilmiş ve optimize edilebilmektedir. 2011 yılından bu yana, eksplant kültürü birden fazla rapor11,12,,13doğurganlık yetkili sperm üretti. Ancak, explant kültürünün önceden var olan yerli testis tübüllerine olan güveni nedeniyle, bu son gelişmeler daha doğru bir şekilde "ex vivo" testiküler fonksiyon ve spermatogenez, bir organizmanın vücudundan çıkarıldıktan sonra sürdürülen veya sürdürülen doku fonksiyonunun örnekleri olarak tanımlanır. Literatürde yaygınlığına rağmen, testis ekseksilerde uzun süreli germ hücre bakımı ve farklılaşması14, 15,,1616,17,18, özellikle in vitro spermatogenezi tam olarak gözlemlemek için yeterince uzun zaman dilimleri nde (~35 gün farelerde19 ve 74 insanlarda20)çoğaltmak zordur. Bu 100 yıl önce yaşanan aynı zorlukların çoğu, hala ex vivo spermatogenesis bugün içinde deneyimli olduğunu takdir etmek ilginçtir.
Ex vivo yaklaşımlardan farklı olarak, testis organoidleri hücresel kaynaklardan (yani primer testis hücrelerinden) tamamen in vitro olarak üretilen de novo birleştirilmiş mikrodokulardır. Testis organoidleri, alanın önceden var olan doğal dokuya olan tarihsel güvenini aşmak ve testis biyolojisini tamamen in vitro olarak yeniden özetlemek için yaratıcı bir strateji sağlar. Çoğu organoid doku modeli tarafından paylaşılan birden fazla gereksinim vardır; bunlar arasında (1) in vivo-mimetik doku morfolojisi veya mimarisi, (2) temsil edilen dokunun birden fazla ana hücre tipi, (3) kendi kuşağında kendi kendini birleştirme veya kendi kendine örgütlenme, ve (4) temsil edilen dokunun fonksiyonu ve fizyolojisinin bir kısmını simüle etme yeteneği21,22,23 ,23,24. Testisler için, bu dört ana işaretle yakalanabilir: (1) majör testis hücre tiplerinin dahil edilmesi, mikrop, Sertoli, Leydig, peritubular ve diğer interstisyel hücreler, (2) hücre yönelimli doku montajı, (3) uygun şekilde bölümlere ayrılmış hücre tipleri ayrı tübüler bölmelere (mikrop ve Sertoli) ve interstisyel bölgelere (diğer tüm hücre tipleri) ve (4) bir derecedoku fonksiyonu (örneğin, üreme hormonu salgılanması veya doku yanıtları ve germ bakım hücre ve selamiasyon). Germ hücre farklılaşması ex vivo ve in vitro bakımında tarihsel zorluklar göz önüne alındığında, in vivo-mimetik testis mimarileri recapitulation (yani, seminiferous tübüller benzeyen yapılar) testis fizyolojisi simülasyonu öneren ek belirteçleri ile (örneğin, endokrin fonksiyon), bir gün vitrospermatoto sürdürmek olabilir organoidler üreten doğru öncelikli kilometre taşlarıdır.
Yayınlanan testis organoid yöntemlerin çoğunluğu ticari olarak kullanılabilir ECM yararlanmak (örneğin, kollajen veya tescilli ECM formülasyonları)25,26,27 veya özel kaynaklı EMI'ler (yani, hücreli testis ECM kaynaklı hidrojeller)28,29,30. Eksojen ECM doku üretimi için montaj destekleyici iskele sağlayarak de novo doku oluşumunu teşvik eder. ECM yöntemleri doku oluşumu etkileyici bir düzeyde, bazı germ hücre varlığı ve doku-mimetikmorfolojisi 25,,28dahil olmak üzere göze almış. Ancak, kullandıkları EkM'ler her zaman evrensel olarak mevcut değildir (örneğin, hücredışı ECM kaynaklı hidrojeller) ve bazı yöntemler sofistike jel ve hücre tohumlama oryantasyonları gerektirir (örneğin, ECM ve 3D baskı 3 katmanlı degradeler)25,31,32. İskele içermeyen yöntemler (örneğin, asma damla ve yapışmaz kültür plakaları)33,34,35 de ECM jelleri veya iskeleler gerek kalmadan sağlam ve son derece tekrarlanabilir organoidler üretti. Ancak, bu iskele içermeyen organoidlerin doku morfolojisi genellikle in vivo testisler farklı, ve bu raporların çoğu doku oluşumunu teşvik etmek için bir biyokimyasal ECM katkı dahil33,34,36, ya da alternatif olarak, zorla hücre toplama ve sıkıştırma için santrifüj güveniyor34, onları hücre yönelimli göç ve kendi kendine organizasyon eğitimi için daha az ideal hale.
Bu el yazmasında sunulan dört organoid üretim yöntemi, her biri hücre güdümlü organoid öz montajın gözlemlenmesini sağlayan basit hücre tohumlamalarını kullanan, Hem ECM'ye bağlı hem de bağımsız stratejileri içermektedir. Dört teknik de aynı hücre süspansiyonlarından gerçekleştirilebilir veya özel ve hücre tipi zenginleştirilmiş popülasyonlardan yararlanabilir. Bu yöntemlerin bir gücü organoidlerin gerçek zamanlı olarak kendi kendine biraraya gelip testis yapılarının farklı kültür mikroortamları arasında nasıl biraraya getirildiğini doğrudan karşılaştırma yeteneğidir. Bu dört kültür yöntemi arasındaki phenotipik farklılıklar araştırma sorusu veya araştırmacının konusu üzerindeki etkileri açısından göz önünde bulundurulmalıdır. Her yöntem 24 saat veya daha az içinde biyolojik yapılar veya organoidler üretir. Sonuç olarak, burada sunulan yöntemler, testis organoid montaj, doku gelişimi ve testis fizyolojisi in vitro incelenmesi için organoid montaj teknikleri bir araç seti sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 um Media Sterile Filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>scgpu05re</td>
			<td>For sterile filtering media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3&#946;HSD primary antibody</td>
			<td>Cosmo Bio Co</td>
			<td>K0607</td>
			<td>Leydig cell marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 568 &#945;-Rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>Fluorescence-tagged secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha Minimum Essential Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11-095-080</td>
			<td>Base of culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase I</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS004197</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Matrigel Membrane Matrix, LDEV-free</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix used for casting 2D and 3D ECM culture gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10227</td>
			<td>Autmated cell counter (hemacytometer machine)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>C10228</td>
			<td>Hemacytometer slide for use with Countess automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDX4 primary antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>138540</td>
			<td>Spermatogonia marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (2,280 u/mgDW)</td>
			<td>Worthington Bio</td>
			<td>LS002140</td>
			<td>For dissociation solution 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1X, + CaCl + MgCl</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040182</td>
			<td>For reconstituting Hyaluronidase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline +Ca/+Mg</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14040117</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo Grade H2O</td>
			<td>MIllipore Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>For reconstituting Collagenase I and Dnase I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For quencing enzyme dissocation solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Follicle stimulating hormone</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab51888</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human chorionic gonadotropin</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>For long-term organoid culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase, from bovine testes</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H4272</td>
			<td>For dissociation solution 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhibin B Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Ansh Labs</td>
			<td>AL-107</td>
			<td>Inhibin B ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>Serum source for Basal media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroTissues 3D Petri Dish micro-mold spheroids (24-35, 5x7 array)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z764051</td>
			<td>For 3D ECM-Free organoid fabrication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc, Lab Tek II Chamber Slide System, 4-well</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-7</td>
			<td>For 2D ECM-free, and 2D, 3D ECM culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Antibiotic for media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Richard-Allan Scientific; Histogel, Specimen processing gel</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td>For aiding paraffin embedding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SOX9 primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>AB5535</td>
			<td>Sertoli Marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Breeder)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2920</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tedklad Global Mouse Chow (Maintenance)</td>
			<td>Teklad Global</td>
			<td>2916</td>
			<td>Mouse food without phytoestrogens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Testosterone Enzyme-linked Immunosorbent Assay</td>
			<td>Calbiotech</td>
			<td>TE373S</td>
			<td>Testosterone ELISA Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td>For cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;SMA primary antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>A2547</td>
			<td>Peritubular marker, 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;Catenin primary antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>610154</td>
			<td>Sertoli Cytoplasm marker, 1:100 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extra cellular matrix-based and extra cellular matrix-free generation of murine testicular organoids

Testis organoidleri in vitro testis gelişimi, spermatogenez ve endokrinolojiyi incelemek için bir araç sağlar. Testis organoidleri oluşturmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin çoğu de novo doku montajını teşvik etmek için hücre dışı matriks (ECM) güveniyor, ancak, biyomimetik morfolojisi ve dokuların fonksiyonu açısından yöntemler arasında farklılıklar vardır. Ayrıca, yayınlanan yöntemlerin birkaç doğrudan karşılaştırmalar vardır. Burada organoid üretim protokollerinde sağlanan sonuçlarla ilgili farklılıklar incelenerek doğrudan bir karşılaştırma yapılır. Dört arketipik nesil yöntemi: (1) 2D ECM'siz, (2) 2D ECM, (3) 3D ECM'siz ve (4) 3D ECM kültürü tanımlanmıştır. Testis organoid neslini değerlendirmek için üç ana kriter kullanıldı. Bunlar hücresel öz-montaj, büyük hücre tiplerinin dahil edilmesi (Sertoli, Leydig, mikrop ve peritubüler hücreler) ve uygun şekilde bölümlere ayrılmış doku mimarisidir. Test edilen dört ortamdan 2D ECM ve 3D ECM'siz kültürler, tübüler ve interstisyel hücre tiplerinin de novo kompartmanlaşması, tübüle benzeri yapıların geliştirilmesi ve uzun süreli endokrin fonksiyon dahil olmak üzere iç morfolojilere sahip organoidler üretti. İncelenen tüm yöntemlerde sıralanmamış, primer murine testis hücre süspansiyonları kullanılmıştır ve yaygın olarak erişilebilir kültür kaynakları kullanılmıştır. Bu testis organoid oluşturma teknikleri, testis organogenezi ve in vitro fizyolojisi araştırma girişimleri için son derece erişilebilir ve tekrarlanabilir bir araç seti sağlar.

Organoid nesil, testis hücrelerinin kültürün 72 saat içinde kendi kendine biraraya gelmemesi durumunda başarısız olarak kabul edilirken, burada sunulan tüm yöntemler juvenil (5 dpp) murine hücreleri kullanılırken 24 saat içinde bir araya getirilmiştir. Biyolojik yapı oluşumunun başarısızlığı, genişletilmiş kültürden (72 saat) sonra bile serbestçe askıda olan hücrelerin devamı olarak sunulmuştur (Şekil 1'de0 saat sütun). Doku kendi kendine montaj yokluğunda,...

Watch this Scientific Journal Video about Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids at JoVE.com

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Burada primer neonatal murine testis hücrelerinden testis organoidi üretmek için dört yöntem tanımlanmıştır. Bu teknikler birden fazla araştırma uygulamasına sahiptir ve özellikle testis gelişimi ve fizyolojisi in vitro eğitimi için yararlıdır.

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Bu protokoller, kullanıcının 2D veya 3D kültür koşullarında hem ECM hem de DCM içermeyen ortamlarda çok sayıda yapısal olarak mimetik ve endokrin fonksiyonel testis organoidi üretmesini sağlar. Bu teknikler son derece tekrarlanabilir, kolayca standart biyolojik laboratuvar ayarlarına uygulanan ve sadece ortak araç ve malzemeleri kullanır. Testis organoidleri spermatogenez ve üreme endokrinolojisi in vitro simüle etmek için yeni bir araçtır, ve bir gün in vitro gametogenesis çalışma sağlayabilir.Bir diseksiyon mat üzerinde ötenazi fare supine yerleştirerek ve% 70 etanol ile karın sterilize ederek başlayın. Çadır forceps ile alt karın deri ve makas ile açın. Karın alt sol ve sağ inguinal bölgelerinde testisler bulmak ve vas deferens ve herhangi bir çapa bağ dokusu ile bağlantılarını kesti.Sonra hayvan tüm testisleri kaldırın. Önceden dengede olan BM'den oluşan bir Petri kabına yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, küçük mikro diseksiyonu makasları ile ya küçük mikro diseksiyonu makas veya hafifçe iki ince forseps ile yırtılma ile her testis bir ucunda tunica albuginea küçük bir kesi yapmak. Kesinin karşı ucundan testis tutarken, yavaşça ince forseps ile sıkmak ve tunica deliğe doğru süpürme hareketi ile itin, tek bir uyumlu parça olarak testis dokusu serbest bırakacaktır.Dokuyu daha küçük parçalara ayırın. Parçaları bir mililitre lik prewarm dissociation çözeltisine yerleştirin ve 37 derecede 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra testis parçalarını P1000 pipetle 50 kez hafifçe triturate edin.Tübüllerin birbirinden ve interstisyel dokudan ayrı olduğundan emin olun. Kümeler kalırsa, beş dakika daha kuluçkaya yatve tekrar triturate. Dissosiasyon karışımının bir mililitrebaşına 33 mikrolitre hyaluronidase stok çözeltisi ekleyin.Daha sonra P1000 pipetiyle 50 kez triturate ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece de örnek kuluçka. Kuluçkadan sonra, P200 pipetiyle 50 kez triturate. Görünür tübül veya hücre kümelerinin bulunmamasını sağladıktan sonra, numunenin toplam hacminin %10'una FBS ekleyerek dissosilasyon enzimlerini söndürün ve p200 pipetle birkaç kez triturate edin.40 mikrometrelik hücre süzgecinin merkezini ortamla ısıtın ve aspire edin, sonra numuneyi önceden ıslak süzgeçe ekleyin ve tek hücreli süspansiyon üretmek için filtreleyin. Süspansiyonu 100 kez g olarak yedi dakika santrifüj edin. Supernatant atın ve taze BM hücreleri resuspend. Trippan mavisi dışlama kullanarak bir hemositometre üzerinde canlı hücreleri saymak, sonra yeniden santrifüj ve taze BM onları resuspend. 2B ECM'siz kültür için, tek hücreli süspansiyonları doğrudan dört kuyulu oda slaytlarına yerleştirin ve slaytları 35 derece lik bir inkübatöre yerleştirin.2B ECM kültürü için, jel çanak alt kapsar sağlanması, dört iyi bir oda slayt içine soğuk bire bir seyreltilmiş hücre dışı matriks orta 100 mikrolitre dağıtmak. ECM bir jel içine polimerize sağlamak için en az 30 dakika kuvöz de slayt yerleştirin, sonra üstüne hücre süspansiyon ekleyin. 3D ECM'siz bir kültür için agarose 3D Petri yemeklerini 24 kuyulu bir kültür kabına yerleştirin ve bir mililitre BM ile kaplayın. 35 derece lik bir kuvözde en az 30 dakika bm'de bulaşıkları dengeleyin, sonra BM'yi atın ve bir mililitre taze BM ile dengeyi bir kez daha tekrarlayın. Kuyudan tüm BM çıkarın ve etrafında taze BM 200 mikrolitre dağıtmak ama 3D Petri kabın merkezi girinti içinde değil, sonra mikro iyi eklemek merkezi hücre tohumlama girinti içinde kalan BM toplamak.Tek hücreli süspansiyonu orta girintiye dağıtın ve hafifçe yukarı ve aşağı triturate. Kültür için nemlendirilmiş 35 derece santigrat kuvöz içine çanak yerleştirin. Ertesi gün, yavaş ve dikkatli bir şekilde agarose 3D Petri çanak çevresinde mevcut medya kaldırmak ve taze BM bir mililitre ile değiştirin. Organoidler bir gecede sıkıştırılmış olmalı, onları alt dinlenmeye izin.3D ECM kültürü için, BM'deki hücre süspansiyonunun eşit kısımlarını soğuk önceden çözülmüş ECM ile birleştirerek tek hücreli süspansiyon hazırlayın. Iyi karışık olduğundan emin olmak için birkaç kez triturate. Sonra hemen dört kuyulu bir oda slayt içine karışımı dağıtmak, bu plakanın tüm alt kapsar sağlanması.35 santigrat derece oda slaytlar kuluçka ve içeriğini en az 30 dakika polimerize sağlar. Polimerizasyondan sonra, kültürün üstüne 500 mikrolitre BM ekleyin. Kültür tüm organoid model tipleri 35 santigrat derece.Tüm kültür tipleri için, her iki günde bir yeni BM ile medyalarının yarısını değiştirin. Bu protokol, juvenil murine testis hücreleri kullanılarak 24 saat içinde organoid üretimi elde etmek için kullanılmıştır. Başarılı bir şekilde oluşturulan dokular başlangıçta 3D hücre kümeleri olarak gözlenmiştir.ECM ortamlarında, hücre kümeleri küme ve çevre çevreleri arasında net kenar boşluklarına sahipti. Hücre kümelerinin de ECM boyunca göç edip kaynaşmaya başladıkları gözlenmiştir. 3D ECM kültürü, de novo yapılarını birleştirmek için diğer tüm kültür yöntemlerine göre önemli ölçüde daha fazla zamana ihtiyaç du.Ve 3D ECM içermeyen kültür 3D agarose Petri çanak her kuyu içinde tek bir büyük ve kompakt küme ile en büyük kümeleri üretti. Organoid modellerin doğal dokuya benzeyip benzemediğini değerlendirmek için, biyolojik yapılar hücreye özgü belirteçler için incelenmiş ve immünoresans ile görselleştirilmiştir. 2D ECM ve 3D ECM içermeyen yöntemler, testis kompartmanizasyonunun yüksek mimetik bir iç morfolojisi olan organoidler üretti.3D ECM içermeyen birleştirilmiş organoidler üzerinde uzun süreli analiz yapıldı. Organoidler 14 gün boyunca kültürlendi ve daha sonra hücre ve yapıya özgü belirteçler için incelendi. Tübül benzeri yapılar gözlendi.3D ECM içermeyen organoidler de gonadotropin stimülasyonu ile 12 haftalık bir kültürde endokrin fonksiyon için çalışıldı. Testosteron ve inhibin B hem organoid klimalı ortamdan ölçüldü. 12 hafta sonra, gonadotropinler 48 saat boyunca çıkarıldı, testosteron ve inhibin B konsantrasyonlarının azalmasına neden.Gonadotropinler geri verildiğinde, her iki hormon konsantrasyonu da önemli ölçüde artarak uygun endokrin duyarlılığı gösterdi. Organoid montaj canlı olgunlaşmamış testis hücrelerinin otonom davranışı yararlanır. Yaratıcı deneyler kolayca özelleştirilmiş hücre sıralanmış veya hibrid hücre karışımları kullanılarak icat edilebilir.Hücre tohumlama sonrasında, canlı video görüntüleme veya zaman atlamalı görüntüleme organoid kendini montaj ölçmek için kullanılabilir. Histolojik ve amino analizler için kültür genelinde organoidler ve durum ortamı toplanabilir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Fare Hipokampal Doku Ex Utero Elektroporasyon ve Organotipik Dilim Kültür

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Güçsüz İnsan dermis kullanma Genetiği Değiştirilmiş Organotipik Cilt Kültürlerin Üretimi

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Fare Embriyonik Hemogenic endotel hücrelerinin izolasyonu

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Yaralanma kaynaklı yaşlanma ve In Vivo kas iskelet yeniden programlama değerlendirilmesi

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

In Vivo Tracking of Human Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells in a Rat Knee Osteoarthritis Model with Fluorescent Lipophilic Membrane Dye

Vivo İnsan yağ elde edilen Mezenkimal kök hücrelerin sıçan diz osteoartrit modelinde floresan lipofilik membran boya ile izleme

In order to support the clinical application of human adipose-derived mesenchymal stem cell (haMSC) therapy for knee osteoarthritis (KOA), we examined the ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

İskele-free, üç boyutlu insülin ifade Pancreatoids fare pankreas ataları Vitro gelen nesil

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

İndüksiyon ve birincil insan hücrelerinde hücresel yaşlanma doğrulama

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...