Name: generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Wij danken Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Verenigde Staten), die vriendelijk de NRC-cellijn verzorgde.
Dit werk kreeg de financiële steun van zowel het iLite RHU-programma (subsidie ANR-16-RHUS-0005) als de DHU Hepatinov.
Wij danken Isabelle Garcin en Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay voor hun steun op het beeldvorming.

1. Generatie van cysten
OPMERKING: Dit protocol kan worden uitgevoerd met elk type hydrogel, als de gelatie het mogelijk maakt inbedding van cellen.
<ol><li>Hydrogel coating OPMERKING: Een goede hydrogelcoating van de kamerdia is een kritieke stap om de vorming van 2D-cellagen op de bodem van de put te voorkomen, die de daaropvolgende cystebeeldvorming kunnen verstoren en de berekening van cystevormingsefficiëntie kunnen aantasten.<ol>
<li>Om de homogeniteit van de geloplossing te garand...

<ol>
	<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Mart&#237;n-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis.">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cells+in+Three-Dimensional+Collagen+Matrix.">Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix.</a> Current Procotols in Cell Biology. , (2010).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).</li><li>Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hepatocyte+spheroids+immobilization+technique+using+alternative+encapsulation+method.">Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).</li><li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+plant+isoflavonoid+that+causes+biliary+atresia.">Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia.</a> Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).</li><li>Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+GAG-matrices+to+promote+mammary+epithelial+morphogenesis+in+vitro.">Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 112, 20-30 (2017).</li><li>Miroshnikova, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Strategies+to+Recapitulate+Epithelial+Morphogenesis+Within+Synthetic+Three-Dimensional+Extracellular+Matrix+With+Tunable+Mechanical+Properties.">Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties.</a> Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).</li><li>Ozdemir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Hydrogel+Properties+to+Promote+the+Assembly+of+Salivary+Gland+Spheroids+in+3D.">Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).</li><li>Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+3D+culture+in+Matrigel+microbeads+to+analyze+clonal+acinar+development.">Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development.</a> Biomaterials. 52, 347-357 (2015).</li><li>Laperrousaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transfection+of+clonal+organoids+in+Matrigel+microbeads:+a+promising+approach+toward+organoid-based+genetic+screens.">Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).</li><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiopathies+-+Towards+a+molecular+understanding.">Cholangiopathies - Towards a molecular understanding.</a> EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).</li><li>Loarca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+cholangioids+from+normal+and+diseased+human+cholangiocytes+as+an+in+vitro+model+to+study+primary+sclerosing+cholangitis.">Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis.</a> Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).</li><li>De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+and+the+biliary+tree.">Regenerative medicine and the biliary tree.</a> Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).</li><li>Dianat, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+cholangiocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+and+HepaRG+cells.">Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells.</a> Hepatology. 60, 700-714 (2014).</li><li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+autophagy+contributes+to+hepatic+cystogenesis+in+polycystic+liver+disease+and+represents+a+potential+therapeutic+target.">Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target.</a> Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile.">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li><li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds.">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions.">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Organoids+from+Mouse+Extrahepatic+Bile+Ducts.">Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).</li><li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides.">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment.">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Annexin+V/Propidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death.">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).</li><li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Cholangiocytes.">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li><li>Spirl&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarity+of+Na+/H++and+Cl-/HCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line.">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li></ol>

Om organogenese en het onderhoud van 3D cellulaire structuren te bestuderen, zijn verschillende weefsels gemodelleerd, met behulp van verschillende cellulaire oorsprong, maar ook verschillende soorten extracellulaire matrices, waaronder synthetische hydrogels8,9,10,21. Echter, als gevolg van gebrek aan 3D kwantitatieve analyse die het mogelijk maakt voor vergelijkingen tussen methoden in termen...

In de afgelopen drie decennia is het gebied van in vitro onderzoek gevorderd in de richting van 3D-cultuursystemen. Er zijn een aantal protocollen opgedoken voor het kweken van cellen in 3D als sferoïden of aggregaten in aanwezigheid of afwezigheid van een steiger/matrix, in een druppel, in agitatie, in microfluïde apparaten of drijvend1. Het gebruik van 3D-cultuurmethoden heeft zijn voordelen bewezen ten opzichte van 2-dimensionale (2D) culturen, met name voor epitheliale cellen, waarvan werd aangetoond dat ze zichzelf organiseren in 3D-structuren, cysten of acini. In dit geval vormen de cellen een monolaag die een lumen omringt, waar cellen hun volledige epitheliale fenotype verwerven met verbeterde fysiologische specifieke functies2.
Talrijke studies hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van methoden voor de vorming van deze epitheliale organoïden in natuurlijke matrices. Dit heeft het mogelijk om te recapituleren in vivo cel-cel en cel-micro-omgeving interacties, om de oprichting en de stabiliteit van de epitheel fenotype3,4,5,6,7. Onlangs, en met name met het oog op de ontwikkeling van transplanteerbare organoïden en het ontcijferen van de eis van de micro-omgeving voor het orkestreren van het epitheliale programma, synthetische hydrogels zijn ontwikkeld om de vorming van epitheel acini8,9,10te verbeteren . Helaas rapporteren deze studies over kwalitatieve gegevens, of presenteren ze berekeningsmethoden met behulp van interne referenties, zoals de verhouding tussen cysten en niet-cysten in een 2D-vlak8,9,10. Dit sluit elke vergelijking tussen verschillende studies in termen van efficiëntie, stabiliteit, of morfologische en fysiologische karakterisering van de epitheel organoïden.
Micro-inkapseling van epitheelcellen in kralen met behulp van microfluïde apparaten heeft gezorgd voor meer realistische kwantitatieve en vergelijkende resultaten. Met behulp van deze technologie werden organoïden van verschillende celtypen gevormd en gedifferentieerd op basis van de morfologie tussen verschillende 3D cellulaire structuren11,12. Deze technologie is echter niet eenvoudig om mee te werken en vereist het gebruik van schone ruimten om de microfluïde apparaten te produceren. Deze technologie is opgezet voor een paar soorten hydrogels, maar vereist technische aanpassing toe te passen aan andere hydrogels, het beperken van de veelzijdigheid. Daarom zijn de meeste studies bedoeld om epitheliale organoïden te ontwikkelen afhankelijk van de inbedding van epitheliale cellen in een hydrogel bulk. Bij deze methoden wordt de hoge heterogeniteit van gelstructuratie en celverdeling in de hele 3D-cultuur vaak verwaarloosd. Daarom hebben de meeste analyses betrekking op enkele 2D-beelden, die slechts zeer ruwweg de verdeling van de verschillende cellulaire objecten in het hele 3D-volume vertegenwoordigen.
Ziekten die galwegen beïnvloeden, zoals cholangiocarcinoom, galatresie, primaire sclerosing cholangitis, onder andere, zijn een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit. Behalve voor levertransplantatie, zijn er geen effectieve behandelingen voor deze aandoeningen13. Inspanningen om galkanaalvorming, ziekteoorzaken en progressie te onderzoeken, zullen de ontwikkeling van nieuwe therapieën mogelijk maken14.
Biliaire organotypic modellen van cysten, sferoïden of buisachtige structuren met behulp van normale of patiënt-afgeleide, gedifferentieerde, of voorloper afgeleide cholangiocyten cellijnen zijn ontwikkeld15,16,17,18,19,20. Verschillende studies hebben samengevat cholangiocyte polariteit, expressie van cholangiocyte markers, aanwezigheid van trilharen, cholangiocyte secretory en reabsorptief vermogen, en lumen vorming en obstructie; die allemaal belangrijke kenmerken van cholangiocyten fenotype, morfologie en functie15,17,19vertegenwoordigen . Anderen hebben gemeld onderhoud van patiënt-afgeleide galorganoïden voor langere tijd20. Onlangs onderzochten we de rol van biochemische en biofysische signalen op galcysten organogenese21. Belangrijk is dat de pathogenese van galatresie werd bestudeerd in galvormige sferoïden en buizen7,22. Bovendien werden de belangrijkste kenmerken van primaire scleroserende cholangitis zoals cholangiocytenscentie, afscheiding van pro-inflammatoire cytokinen en macrofaagwerving met succes onderzocht met behulp van galsferoïden15,20. Echter, reproduceerbare in vitro 3D kwantitatieve modellen die fysiologisch moduleren cholangiocyte fenotype, fysiologie, en micro-omgeving waar deze vragen kunnen worden aangepakt zijn nog steeds nodig. Bovendien hebben slechts weinig publicaties melding gemaakt van cystevorming efficiëntie21,23. Dit is een belangrijk punt vast te stellen, met name bij het onderzoeken van organogenese, ziekte oorzaak, en correlatie van de reacties van geneesmiddelen met cholangiocyte functie en polarisatie. Bovendien, met verschillen in steiger / matrix gebruikt van protocol tot protocol, is het moeilijk te vergelijken tussen systemen. Om deze problemen op te lossen, stellen we een kwantitatieve, betrouwbare en universele methode voor om galcysten te genereren die de vorming van lumen, cholangiocytepolarisatie en cholangiocytensecretoire functie nabootsen. Belangrijk is dat we een systematische analyse presenteren die langs de Z-as over de 3D-gel wordt uitgevoerd bij de evaluatie in de tijd, cystevormingsefficiëntie, grootte, levensvatbaarheid, polarisatie en functionaliteit. Verder gebruikten we een natuurlijke hydrogel en normale rattencholangiocyten (NRC)s, als voorbeeld voor het protocol, maar andere natuurlijke of synthetische hydrogels, evenals epitheelcellen kunnen worden gebruikt voor de vorming van 3D-cystische structuren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">10 &#181;l- Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000020</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">100 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1000 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1X PBS</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">14190-094</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">200 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">T5516</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetic acid</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">VWR</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20104-298</td>
			<td>0.02N final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 10 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707439</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 1000 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707404</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 200 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707430</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Antibiotic Antimicotic Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A5955</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">13028-014</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 30 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine serum albumin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A2153</td>
			<td style="width:261px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11905-031</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Collagen high concentration, rat tail</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">354249</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Dexamethasone</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">D4902</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.393 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">DMEM F12</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">21331-020</td>
			<td style="width:261px;">NRC complete medium final concentration = 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">PA5-32178</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:408px;">Eclipse TE300 inverted microscope</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Ethanolamine</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">E9508</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.32 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal calf serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">10270-106</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">F6057</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Formaldehyde 16% (W/V)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">28906</td>
			<td>4% (W/V)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Goat serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">16210-064</td>
			<td style="width:261px;">1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:408px;">Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td>
			<td style="width:180px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Hoechst 33258</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">B1155</td>
			<td style="width:261px;">5 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A32733</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">51300-044</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25030-024</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">356231</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">4:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements software version 4.50.00</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>image acquisition and display</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11140-035</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&#8734;/1.2 WD 15.2)</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Propidium Iodide (PI)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P4170</td>
			<td>20 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Rhodamine Phalloidin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">R415</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">16.2 nM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sir-Actin / Verapamil kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Spirochrome</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">SC001</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">10 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">17075-029</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile cell strainer 40 &#181;m (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811E</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811D</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11926955</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">7200886</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">553913</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sucrose</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">S0389</td>
			<td>5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="24" style="height:24px;width:408px;">Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">353108</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Triton X-100</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>5:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25300-054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Tween-20</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P1379</td>
			<td>5:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Vitamin (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11120-037</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">&#956;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Clinisciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">80826</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts

Cholangiocyten, de epitheelcellen die de galwegen in de lever line-up, toezicht houden op galvorming en modificatie. In de afgelopen twintig jaar zijn in de context van leverziekten 3-dimensionale (3D)-modellen op basis van cholangiocyten ontstaan, zoals cysten, sferoïden of buisachtige structuren om weefseltopologie na te bootsen voor organogenese, ziektemodellering en onderzoeken naar geneesmiddelenscreening. Deze structuren zijn voornamelijk verkregen door het inbedden van cholangiocyten in een hydrogel. Het belangrijkste doel was om zelforganisatie te bestuderen door epitheliale polariteit, functionele en morfologische eigenschappen aan te pakken. Echter, zeer weinig studies richten zich op cyste vorming efficiëntie. Wanneer dit het geval is, wordt de efficiëntie vaak gekwantificeerd uit afbeeldingen van een enkel vlak. Functionele testen en structurele analyse worden uitgevoerd zonder de potentiële heterogeniteit van cystedistributie als gevolg van hydrogelpolymerisering heterogeniteiten en bijwerkingen weer te vertegenwoordigen. Daarom kan de kwantitatieve analyse, wanneer gedaan, niet worden gebruikt voor vergelijking van het ene artikel naar het andere. Bovendien staat deze methode geen vergelijkingen toe van 3D-groeipotentieel van verschillende matrices en celtypen. Bovendien is er geen melding gemaakt van de experimentele probleemoplossing voor immunostaining cysten. In dit artikel bieden we een betrouwbare en universele methode om aan te tonen dat de initiële celverdeling gerelateerd is aan de heterogene verticale verdeling van cystevorming. Cholangiocyte cellen ingebed in hydrogel worden gevolgd met Z-stacks analyse langs de hydrogel diepte in de tijd van 10 dagen. Met deze methode wordt een robuuste kinetiek van cystevormingsefficiëntie en -groei verkregen. We presenteren ook methoden om cyste polariteit en secretoire functie te evalueren. Tot slot worden aanvullende tips gegeven voor het optimaliseren van immunostaining protocollen om cyste-instorting voor beeldvorming te beperken. Deze aanpak kan worden toegepast op andere 3D-celkweekstudies, waardoor de mogelijkheden worden geopend om het ene systeem met het andere te vergelijken.

Vorming en karakterisering van cysten 3D-celkweeksystemen zijn een belangrijk instrument om organogenese en ziektemodellering te bestuderen25. Helaas zijn de meeste van deze methoden kwalitatieve of gebruik interne kwantificering uitgevoerd op een enkel vlak door het vergelijken van het aantal cysten versus niet-cysten, in variabele en vaak niet-gespecificeerde volumes, het voorkomen van een vergelijking in termen van cyste vorming efficiëntie tussen de verschillende studies<s...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Driedimensionale (3D) cellulaire systemen zijn relevante modellen voor het onderzoeken van organogenese. Een hydrogel-gebaseerde methode voor biliaire cysten productie en hun karakterisering wordt voorgesteld. Dit protocol ontrafelt de barrières van 3D-karakterisering, met een eenvoudige en betrouwbare methode om de efficiëntie, maten en grootte van cystevorming te beoordelen en hun functionaliteit te testen.

Generatie en kwantitatieve karakterisering van functionele en gepolariseerde galeelcyten

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Dit is het eerste protocol voor het genereren van biliaire cysten, het verstrekken van een systematische analyse die het mogelijk maakt de evaluatie van cystevorming, efficiëntie en grootte in de tijd. Deze methode maakt kwantitatieve beoordeling van epitheelcyste cystevorming mogelijk en maakt het mogelijk om dit proces te evalueren als functie van het type epitheliale cellen of hydrogel. Aangezien de therapeutische opties voor biliaire aandoeningen beperkt zijn, opent dit protocol de deur voor het standaardiseren van medicijnstudies, het identificeren van normale therapeutische doelen en het begrijpen van ziektemechanismen.De eenvoudige methode maakt het mogelijk om belangrijke vragen over de mechanismen van nieuwe informatie binnen de bio-engineering van buisstructuren veld worden aangepakt. Ontdooi voor het begin van een experiment een geschikte hydrogeloplossing bij vier graden Celsius en precoole pipettips en een achtputkamerglijbaan bij min 20 graden Celsius 's nachts. De volgende ochtend, plaats de hydrogel en een acht goed kamer glijbaan op ijs en voeg de juiste hoeveelheid hydrogel aan koude normale rat cholangiocyte compleet medium om 500 microliters van 40% hydrogel oplossing te verkrijgen.Gebruik vervolgens de koude pipettips om 50 microliters hydrogeloplossing toe te voegen aan het midden van elke put van de kamerschaarste en gebruik een pipetpunt om de oplossing zo gelijkmatig mogelijk over het gehele oppervlak van de putbodem te verspreiden zonder bubbels. Om de cellen voor te bereiden op het experiment, terwijl de hydrogel polymeriseert, was de cellen van een 70%confluent normale rattencholangiocytecultuur met voorverwarmde PBS en ontcubeer de cellen met vijf milliliter verse voorverwarmde PBS gedurende 20 minuten in de incubator van de celkweek. Vervang aan het einde van de incubatie de PBS door één milliliter voorverwarmde Trypsin-EDTA en breng de kolf vijf tot tien minuten terug naar de couveuse van de celkweek.Wanneer de cellen zijn losgemaakt, neutraliseren de reactie met vier milliliter van voorverwarmde volledige normale rat cholangiocyte medium en breng de cellen naar een 15 milliliter buis voor centrifugatie. Dan opnieuw opschorten de pellet in vijf milliliter van voorverwarmd medium en filter de cellen door middel van een 40 micron zeef in een 50 milliliter buis voor het tellen. Om cysten te genereren, voeg het juiste volume hydrogel toe aan koude volledige normale rattencholangiocytenmedium om 1.600 microliter van een 80%hydrogeloplossing op ijs te verkrijgen en de cellen te verdunnen tot een vijf keer 10 tot de vijfde cel per milliliter koude normale rattencholangiocytenmediumconcentratie in 1, 600 microliter medium.Meng onmiddellijk de cel- en hydrogelceloplossingen en voeg 400 microliter cellen toe aan elke put van de hydrogel gecoate kamerglijbaan, waarbij u ervoor zorgt dat bellen worden vermeden. Om de verwerving van reproduceerbare en significante resultaten te garanderen, moet u de hydrogel zorgvuldig behandelen en de initiële celwaterstofoplossing grondig mengen om een homogene oplossing te verkrijgen. Wanneer alle cellen zijn gezaaid, plaats de dia in de celcultuur incubator.Na twee dagen in de cultuur, verwijder 250 microliter van het medium uit een hoek van elke put, zorg ervoor dat niet te spoelen uit de hydrogel, en langzaam vervangen van de afgedankte supernatant met 250 microliter van verse cultuur medium. Voor cystimaging, op de juiste dag van de cultuur, selecteert u de 10 X doelstelling op een fase contrastmicroscoop uitgerust met beeldacquisitie software, schakel de witte lamp en selecteer de brightfield imaging optie. Selecteer afspelen om de camera in te schakelen en je te concentreren op een veld van cysten.Stel de belichtingstijd in en open het venster voor het automatisch vastleggen van de map om automatische besparing van de afbeeldingen mogelijk te maken. Open het capture Z-serie venster, reset de standaardpositie en gebruik de Z-schroef om de boven- en onderkant van de Z-stack te definiëren, waarbij de Z-stap wordt aangepast afhankelijk van het doel en het resolutieniveau. Klik vervolgens nu uitvoeren om de overname te starten.Na beeldvorming, open de Z-stack in Fiji. Als u de stapel wilt dupliceren, klikt u op afbeelding, duplicaat en dubbele stapel. Als u een minimale intensiteitsprojectie wilt maken van de gedupliceerde stapels, selecteert u onder het afbeeldingsmenu stapels en het Z-project.Selecteer de minimale intensiteit voor het projectietype en klik op oke. Als u de achtergrond van de projectie wilt aftrekken, selecteert u onder het procesmenu de achtergrond aftrekken en 500 pixels rollende bolletje en lichte achtergrond selecteren om de cysten meer contrasterend te maken dan de achtergrond. Als u de geschatte cystediameter wilt meten, zoomt u op de doelgerichte cyste, selecteert u het rechte lijngereedschap en drukt u op de T-knop op het toetsenbord.Teken een lijn over de diameter van elke cyste op de uiteindelijke projectie. De volgende regio van belang gemaakt voor elke cyste zal worden toegevoegd aan de regio van belang manager. Wanneer alle cysten zijn geteld, klikt u op het Z-stack venster om het te selecteren en klik op toon alles om de geteld cysten te zien.Verplaats de cursor langs de Z-stack om te controleren of alle cysten zijn geteld in elke afbeelding, het toevoegen van nieuwe cysten aan het gebied van belang manager als dat nodig is. Wanneer alle cysten zijn geteld, selecteert u het gebied van belang en klikt u op meer en slaat u op om de gegevens op te slaan. Klik op meten om de grootte van elke cyste te bepalen, waarbij de interessegebieden nog steeds zijn geselecteerd.Er verschijnt een venster met elke cyste en de geschatte grootte. Sla vervolgens de gegevens op in CSV-indeling. Zoals aangetoond, het registreren van het aantal cysten en hun respectieve maten in de tijd maakt analyse van de evolutie van cystevorming en groei mogelijk.De levensvatbaarheid van de startcelpopulatie en de 10 dagen oude cysten kan worden geëvalueerd door levende/dode vlekken. Dode cellen vertegenwoordigen minder dan 3% van de celpopulatie op dag 10 en bevinden zich meestal buiten de cyste als geïsoleerde cellen of als onderdeel van kleine aggregaten, hoewel sommige necrotische celrestenophoping wordt waargenomen binnen sommige grote cysten. Incubatie met fluoresceïne diacetaat en Hoechst maakt een beoordeling van de vorming en afscheiding van Fluoresceïne mogelijk van het basale naar de apicale luminale ruimte.Met name wordt de afscheiding van Fluoresceïne geremd door voorbehandeling met een multiresistente remmer, wat aangeeft dat fluorescerende fluorescerende fluoresceïneaccumulatie in het lumen te wijten is aan afscheiding via de multiresistente transporter en niet uit de intercellulaire ruimte lekt. Vlekken op E-cadherin expressie blijkt dat de normale rattencholangiocyten hun epitheliale fenotype gedurende ten minste 10 dagen in de hydrogel behouden. Bij de voorbereiding van de cysten op immunofluorescentie is het bijhouden van het boviene serum albumine op 0,1% of minder tijdens verzadiging van cruciaal belang voor het handhaven van de integriteit van de cyste, omdat hogere concentraties resulteren in intrekking van cysten en instorting van lumen.Nachtelijke hydrogel, ontdooien, pipettepunt en kamer dia opname, werken op ijs en het verspreiden van de homogene cel hydrogel mengsel gelijkmatig op de gekweekte kamer dia zijn allemaal van cruciaal belang voor experimenteel succes. Deze methode kan worden gebruikt om cysten te genereren uit andere epitheliale cellen of hydrogels, waardoor vergelijkingen voor een beter begrip van epitheliale polarisatie. Deze kwantitatieve methode kan worden gebruikt om de effecten van geneesmiddelen of genetische mutaties op galfunctie en organogenese te testen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Drug-geïnduceerde Overgevoeligheid van adenylylcyclase: Assay stroomlijning en miniaturisatie voor Small Molecule en siRNA screening Toepassingen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Bouw en karakterisatie van een nieuw Vocal Fold Bioreactor

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabricage en karakterisering van een Conformal Skin-achtige Electronic System for Quantitative, Cutane Wound Management

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Dubbele Emulsion Generation Met een Polydimethylsiloxaan (PDMS) Co-axiale Flow Focus Device

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Verbetering van 2D- en 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen Met behulp van macromoleculaire Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Generatie van ESC afgeleide Mouse epitheelcellen behulp van cellen ontdane Lung Steigers

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Generatie van dynamische omgevingsomstandigheden met behulp van een microfluïdisch apparaat met hoge doorvoer

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...