Name: generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Nous remercions Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, États-Unis), qui a gentiment fourni la ligne cellulaire du CNRC.
Ces travaux ont reçu le soutien financier du programme iLite RHU (subvention ANR-16-RHUS-0005) et du DHU Hepatinov.
Nous remercions Isabelle Garcin et le Réseau d’Imagerie Cellulaire Paris Saclay pour leur soutien à l’imagerie.

1. Génération de kystes
REMARQUE : Ce protocole peut être effectué avec n’importe quel type d’hydrogel, si la gelation permet l’intégration des cellules.
<ol><li>Revêtement Hydrogel REMARQUE : Le revêtement hydrogel approprié de la glissière de chambre est une étape critique pour éviter la formation des couches de cellules 2D sur le fond du puits, qui pourraient interférer avec la formation image suivante de kyste et altérer le calcul de l’efficacité de formation de ...

<ol>
	<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Mart&#237;n-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis.">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. 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M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Annexin+V/Propidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death.">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).</li><li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Cholangiocytes.">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li><li>Spirl&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarity+of+Na+/H++and+Cl-/HCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line.">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li></ol>

Afin d’étudier l’organogenèse et l’entretien des structures cellulaires 3D, divers tissus ont été modélisés, en utilisant différentes origines cellulaires, mais aussi différents types de matrices extracellulaires, y compris les hydrogelssynthétiques 8,9,10,21. Toutefois, en raison de l’absence d’analyse quantitative 3D qui permet des comparaisons entre les méthodes en termes...

Au cours des trois dernières décennies, le domaine de la recherche in vitro a progressé vers les systèmes de culture 3D. Un certain nombre de protocoles ont émergé pour la culture des cellules en 3D sous forme de sphéroïdes ou d’agrégats en présence ou en l’absence d’un échafaudage/matrice, dans une goutte, dans l’agitation, dans les dispositifs microfluidiques, ou flottant1. L’utilisation de méthodes de culture 3D a prouvé ses avantages par rapport aux cultures bidimensionnelles (2D), en particulier pour les cellules épithéliales, qui se sont auto-organiser dans des structures 3D, appelées kystes ou acini. Dans ce cas, les cellules forment un monomouche encerclant un lumen, où les cellules acquièrent leur phénotype épithélial complet avec des fonctions physiologiques spécifiquesaméliorées 2.
De nombreuses études ont contribué au développement de méthodes de formation de ces organoïdes épithéliales chez les matrices naturelles. Cela a permis de récapituler les interactions cellules-cellules in vivo et microenvironnement cellulaire, pour obtenir l’établissement et la stabilité du phénotype épithélial3,4,5,6,7. Récemment, et en particulier dans le but de développer des organoïdes transplantables et de déchiffrer l’exigence du microenvironnement pour orchestrer le programme épithélial, des hydrogels synthétiques ont été développés pour améliorer la formation d’acini épithéliales8,9,10. Malheureusement, ces études font état de données qualitatives, ou présentent des méthodes de calcul utilisant des références internes telles que le rapport des kystes sur les non-kystes dans un plan 2D8,9,10. Cela exclut toute comparaison entre différentes études en termes d’efficacité, de stabilité ou de caractérisation morphologique et physiologique des organoïdes épithéliales.
La microencapsulation des cellules épithéliales dans les perles à l’aide de dispositifs microfluidiques a permis des résultats quantitatifs et comparatifs plus réalistes. En utilisant cette technologie, des organoïdes de divers types de cellules ont été formés et différenciés en fonction de la morphologie entre les différentes structures cellulaires 3D11,12. Cependant, cette technologie n’est pas facile à utiliser et nécessite l’utilisation de salles propres pour produire les appareils microfluidiques. Cette technologie a été établie pour quelques types d’hydrogels, mais nécessite une adaptation technique pour être appliquée à d’autres hydrogels, limitant sa polyvalence. Par conséquent, la plupart des études destinées à développer des organoïdes épithéliales reposent sur l’intégration de cellules épithéliales dans un bloc hydrogel. Dans ces méthodes, l’hétérogénéité élevée de la structuration du gel et de la distribution cellulaire à l’intérieur de toute la culture 3D est souvent négligée. Par conséquent, la plupart des analyses se rapportent à des images 2D uniques, qui ne représentent que très grossièrement la distribution des différents objets cellulaires dans l’ensemble du volume 3D.
Les maladies qui affectent les canaux biliaires, tels que le cholangiocarcinome, l’atrésie biliaire, la cholangite sclérosante primaire, entre autres, sont une cause majeure de mortalité et de morbidité. Excepté la transplantation de foie, il n’y a aucun traitement efficace pour ces conditions13. Les efforts pour étudier la formation de canaux biliaires, les causes de la maladie et la progression permettront le développement de nouvellesthérapies 14.
Des modèles organotypiques biliaires de kystes, de sphéroïdes ou de structures tubulaires utilisant des lignées cellulaires cholangiocytes normales ou dérivées du patient, différenciées ou dérivées d’un ancêtre ontété développées 15,16,17,18,19,20. Diverses études ont récapitulé la polarité cholangiocyte, l’expression des marqueurs cholangiocytes, la présence de cils, la sécrétion cholangiocyte et la capacité réabsorptive, et la formation et l’obstruction de lumen ; qui représentent tous des caractéristiques importantes du phénotype cholangiocyte, de la morphologie et de lafonction 15,17,19. D’autres ont rapporté le maintien des organoïdes biliaires patients-dérivés pendant de longues périodesde temps 20. Récemment, nous avons étudié le rôle des indices biochimiques et biophysiques sur les kystes biliaires organogenèse21. Fait important, la pathogénie de l’atrésie biliaire a été étudiée dans les sphéroïdes biliaires et les tubes7,22. En outre, les dispositifs principaux de cholangitis sclérosé primaire tels que la sénescence de cholangiocyte, la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires, aussi bien que le recrutement de macrophage ont été avec succès étudiés utilisant des sphéroïdes biliaires15,20. Cependant, des modèles quantitatifs 3D in vitro reproductibles qui modulent physiologiquement le phénotype, la physiologie et le microenvironnement cholangiocytes où ces questions peuvent être abordées sont encore nécessaires. En outre, seulement peu de publications ont rapporté l’efficacité de formationde kyste 21,23. C’est un point important à établir, particulièrement en étudiant l’organogenèse, la cause de la maladie, et la corrélation des réponses de drogue avec la fonction et la polarisation de cholangiocyte. En outre, avec les différences dans l’échafaudage / matrice utilisée d’un protocole à l’autre, il est difficile de comparer entre les systèmes. Pour résoudre ces issues, nous proposons une méthode quantitative, fiable, et universelle pour produire des kystes biliaires imitant la formation de lumen, la polarisation de cholangiocyte, et la fonction sécréoire de cholangiocyte. Fait important, nous présentons une analyse systématique effectuée le long de l’axe Z à travers le gel 3D lors de l’évaluation au fil du temps, l’efficacité de la formation de kystes, la taille, la viabilité, la polarisation et la fonctionnalité. De plus, nous avons utilisé un hydrogel naturel et des cholangiocytes normaux de rat (CNRC), comme exemple pour le protocole, mais d’autres hydrogels naturels ou synthétiques, ainsi que des cellules épithéliales pourraient être utilisés pour la formation de structures cystiques 3D.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">10 &#181;l- Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000020</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">100 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1000 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1X PBS</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">14190-094</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">200 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">T5516</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetic acid</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">VWR</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20104-298</td>
			<td>0.02N final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 10 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707439</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 1000 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707404</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 200 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707430</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Antibiotic Antimicotic Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A5955</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">13028-014</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 30 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine serum albumin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A2153</td>
			<td style="width:261px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11905-031</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Collagen high concentration, rat tail</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">354249</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Dexamethasone</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">D4902</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.393 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">DMEM F12</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">21331-020</td>
			<td style="width:261px;">NRC complete medium final concentration = 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">PA5-32178</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:408px;">Eclipse TE300 inverted microscope</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Ethanolamine</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">E9508</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.32 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal calf serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">10270-106</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">F6057</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Formaldehyde 16% (W/V)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">28906</td>
			<td>4% (W/V)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Goat serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">16210-064</td>
			<td style="width:261px;">1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:408px;">Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td>
			<td style="width:180px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Hoechst 33258</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">B1155</td>
			<td style="width:261px;">5 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A32733</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">51300-044</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25030-024</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">356231</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">4:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements software version 4.50.00</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>image acquisition and display</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11140-035</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&#8734;/1.2 WD 15.2)</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Propidium Iodide (PI)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P4170</td>
			<td>20 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Rhodamine Phalloidin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">R415</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">16.2 nM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sir-Actin / Verapamil kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Spirochrome</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">SC001</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">10 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">17075-029</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile cell strainer 40 &#181;m (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811E</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811D</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11926955</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">7200886</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">553913</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sucrose</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">S0389</td>
			<td>5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="24" style="height:24px;width:408px;">Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">353108</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Triton X-100</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>5:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25300-054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Tween-20</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P1379</td>
			<td>5:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Vitamin (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11120-037</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">&#956;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Clinisciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">80826</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts

Les cholangiocytes, les cellules épithéliales qui alignent les canaux biliaires dans le foie, surveillent la formation et la modification de la bile. Au cours des vingt dernières années, dans le contexte des maladies du foie, des modèles tridimensionnels (3D) basés sur des cholangiocytes ont vu le jour comme des kystes, des sphéroïdes ou des structures tubulaires pour imiter la topologie tissulaire pour l’organogenèse, la modélisation des maladies et les études de dépistage des médicaments. Ces structures ont été principalement obtenues en intégrant des cholangiocytes dans un hydrogel. L’objectif principal était d’étudier l’auto-organisation en abordant la polarité épithéliale, les propriétés fonctionnelles et morphologiques. Cependant, très peu d’études se concentrent sur l’efficacité de formation de kyste. Lorsque c’est le cas, l’efficacité est souvent quantifiée à partir d’images d’un seul plan. Des analyses fonctionnelles et structurales sont exécutées sans représenter l’hétérogénéité potentielle de la distribution de kyste résultant des hétérogénéités et des effets secondaires de polymérisation d’hydrogel. Par conséquent, l’analyse quantitative, lorsqu’elle est effectuée, ne peut pas être utilisée à des fins de comparaison d’un article à l’autre. De plus, cette méthodologie ne permet pas de comparer le potentiel de croissance 3D de différents types de matrices et de cellules. En outre, il n’y a aucune mention du dépannage expérimental pour les kystes immunostaining. Dans cet article, nous fournissons une méthode fiable et universelle pour montrer que la distribution initiale de cellules est liée à la distribution verticale hétérogène de la formation de kyste. Les cellules cholangiocytes intégrées dans l’hydrogel sont suivies d’une analyse des piles Z le long de la profondeur de l’hydrogel pendant 10 jours. Avec cette méthode, une cinétique robuste de l’efficacité et de la croissance de formation de kyste est obtenue. Nous présentons également des méthodes pour évaluer la polarité de kyste et la fonction sécrétaire. Enfin, des conseils supplémentaires pour optimiser les protocoles d’immunostaining sont fournis afin de limiter l’effondrement du kyste pour l’imagerie. Cette approche peut être appliquée à d’autres études de culture cellulaire 3D, ouvrant ainsi la possibilité de comparer un système à un autre.

Formation et caractérisation des kystes Les systèmes de culture cellulaire 3D sont un outil important pour étudier l’organogenèse et la modélisation des maladies25. Malheureusement, la plupart de ces méthodes sont qualitatives ou utilisent la quantification interne effectuée sur un seul plan en comparant le nombre de kystes par rapport aux non-kystes, en volumes variables et souvent non spécifiés, empêchant toute comparaison en termes d’efficacité de formation de...

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Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Les systèmes cellulaires tridimensionnels (3D) sont des modèles pertinents pour étudier l’organogenèse. Une méthode hydrogel-basée pour la production biliaire de kystes et leur caractérisation est proposée. Ce protocole démêle les barrières de la caractérisation 3D, avec une méthode simple et fiable pour évaluer l’efficacité de formation de kyste, tailles, et pour tester leur fonctionnalité.

Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

C’est le premier protocole pour générer des kystes biliaires, fournissant une analyse systématique qui permet l’évaluation de la formation de kyste, de l’efficacité, et de la taille au fil du temps. Cette méthode permet l’évaluation quantitative de la formation épithéliale de kyste, et permet d’évaluer ce processus en fonction du type de cellules épithéliales ou hydrogel. Puisque les options thérapeutiques pour des désordres biliaires sont limitées, ce protocole ouvre la porte pour normaliser des études de drogue, identifier des cibles thérapeutiques normales, et comprendre des mécanismes de maladie.La méthode simple permet de répondre à des questions importantes sur les mécanismes de nouvelles informations dans le domaine de la bioingénierie des structures tubulaires. Avant de commencer une expérience, décongelez une solution hydrogel appropriée à quatre degrés Celsius et des pointes de pipette pré-refroidies et une glissade de chambre de huit puits à moins 20 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, placez l’hydrogel et une glissade de chambre de huit puits sur la glace et ajoutez le volume approprié d’hydrogel au cholangiocyte normal froid de rat pour obtenir 500 microlitres de solution d’hydrogel de 40%.Ensuite, utilisez les pointes de pipette froide pour ajouter 50 microlitres de solution hydrogel au centre de chaque puits de la glissière de chambre et utilisez une pointe de pipette pour étendre la solution sur toute la surface du fond du puits aussi uniformément que possible sans bulles. Pour préparer les cellules à l’expérience, pendant que l’hydrogel est polymérisant, lavez les cellules d’une culture normale de cholangiocyte de rat de 70% confluent avec le PBS préchauffé et incubez les cellules avec cinq millilitres de PBS préchauffé frais pendant 20 minutes dans l’incubateur de culture cellulaire. À la fin de l’incubation, remplacer le PBS par un millilitre de Trypsin-EDTA préchauffé et remettre le flacon à l’incubateur de culture cellulaire pendant cinq à dix minutes.Lorsque les cellules se sont détachées, neutralisez la réaction avec quatre millilitres de cholangiocyte normal normal préchauffé et transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres pour centrifugation. Puis suspendez la pastille en cinq millilitres de milieu préchauffé et filtrez les cellules à travers une passoire de 40 microns dans un tube de 50 millilitres pour le comptage. Pour générer des kystes, ajouter le volume approprié d’hydrogel au milieu normal froid de cholangiocyte de rat pour obtenir 1.600 microlitres d’une solution d’hydrogel de 80% sur la glace et diluer les cellules à cinq fois 10 aux cinquièmes cellules par millilitre de concentration normale froide de cholangiocyte de rat dans 1.600 microlitres de milieu.Mélangez immédiatement les solutions cellulaires et hydrogel cellulaires et ajoutez 400 microlitres de cellules à chaque puits de la glissière de chambre recouverte d’hydrogel, en prenant soin d’éviter les bulles. Pour assurer l’acquisition de résultats reproductibles et significatifs, assurez-vous de manipuler l’hydrogel avec soin et de bien mélanger la solution initiale d’hydrogène cellulaire pour obtenir une solution homogène. Lorsque toutes les cellules ont été ensemencées, placez la diapositive dans l’incubateur de culture cellulaire.Après deux jours de culture, retirer 250 microlitres du milieu d’un coin de chaque puits, en prenant soin de ne pas rincer l’hydrogel, et remplacer lentement le supernatant jeté par 250 microlitres de milieu de culture frais. Pour l’imagerie kyste, le jour approprié de la culture, sélectionnez l’objectif 10 X sur un microscope à contraste de phase équipé d’un logiciel d’acquisition d’images, allumez la lampe blanche et sélectionnez l’option d’imagerie brightfield. Sélectionnez jouer pour allumer la caméra et se concentrer sur un champ de kystes.Réglez le temps d’exposition et ouvrez la fenêtre du dossier de capture automatique pour permettre l’enregistrement automatique des images. Ouvrez la fenêtre de la série Z de capture, réinitialisez la position par défaut et utilisez la vis Z pour définir les plaines supérieure et inférieure de la pile Z, en ajustant l’étape Z en fonction de l’objectif et du niveau de résolution. Cliquez ensuite sur exécuter dès maintenant pour lancer l’acquisition.Après l’imagerie, ouvrez la pile Z aux Fidji. Pour dupliquer la pile, cliquez sur l’image, dupliquez et dupliquez la pile. Pour créer une projection d’intensité minimale à partir de la pile dupliquée, sous le menu image, sélectionnez les piles et le projet Z.Sélectionnez l’intensité minimale pour le type de projection et cliquez bien. Pour soustraire l’arrière-plan de la projection, sous le menu de processus, sélectionnez l’arrière-plan de soustraction et sélectionnez 500 pixels de rayon de boule roulante et fond léger pour rendre les kystes plus contrastés que l’arrière-plan. Pour mesurer le diamètre approximatif du kyste, zoomez sur le kyste ciblé, sélectionnez l’outil en ligne droite et appuyez sur le bouton T sur le clavier.Tracez une ligne à travers le diamètre de chaque kyste sur la projection finale. La prochaine région d’intérêt créée pour chaque kyste sera ajoutée à la région du gestionnaire d’intérêt. Lorsque tous les kystes ont été comptés, cliquez sur la fenêtre Z-stack pour le sélectionner et cliquez sur afficher tous pour voir les kystes comptés.Déplacez le curseur le long de la pile Z pour vérifier que tous les kystes ont été comptés dans chaque image, en ajoutant de nouveaux kystes à la région de gestionnaire d’intérêt si nécessaire. Lorsque tous les kystes ont été comptés, sélectionnez la région d’intérêt ensemble et cliquez plus et enregistrer pour enregistrer les données. Pour déterminer la taille de chaque kyste, avec les régions d’intérêts encore sélectionnées, cliquez sur mesurer.Une fenêtre énumérant chaque kyste et sa taille estimée apparaîtront. Enregistrez ensuite les données au format CSV. Comme démontré, l’enregistrement du nombre de kystes et de leurs tailles respectives au fil du temps permet l’analyse de l’évolution de la formation et de la croissance de kyste.La viabilité de la population de cellules de départ et des kystes vieux de 10 jours peut être évaluée par coloration vivante/morte. Les cellules mortes représentent moins de 3% de la population cellulaire au jour 10 et sont principalement situées à l’extérieur du kyste comme cellules isolées ou dans le cadre de petits agrégats, bien que certaines accumulations de débris cellulaires nécrotiques soient observées dans certains gros kystes. L’incubation avec le diacétate de fluorescéine et hoechst permet d’évaluer la formation et la sécrétion de fluorescéine du basal à l’espace luminal apical.Notamment, la sécrétion de fluorescéine est inhibée par prétraitement avec un inhibiteur multirésistant, ce qui indique que l’accumulation fluorescente de fluorescéine dans le lumen est due à la sécrétion par le transporteur multirésistant et non à une fuite de l’espace intercellulaire. La coloration pour l’expression d’E-cadherin indique que les cholangiocytes normaux de rat maintiennent leur phénotype épithélial dans l’hydrogel pendant au moins 10 jours. Lors de la préparation des kystes pour l’évaluation de l’immunofluorescence, le maintien de l’albumine de sérum bovin à 0,1% ou moins pendant la saturation est la clé pour maintenir l’intégrité du kyste, que des concentrations plus élevées entraînent la rétractation des kystes et l’effondrement lumen.L’hydrogel de nuit, le dégel, la pointe de pipette et l’enregistrement de glissière de chambre, le travail sur la glace et l’épandage uniforme du mélange homogène d’hydrogel cellulaire sur la glissière de chambre cultivé sont tous essentiels au succès expérimental. Cette méthode peut être utilisée pour générer des kystes à partir d’autres cellules épithéliales ou hydrogels, permettant des comparaisons pour une meilleure compréhension de la polarisation épithéliale. Cette méthode quantitative peut être utilisée pour tester les effets des médicaments ou des mutations génétiques sur la fonction biliaire et l’organogenèse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Génération de tissu myocardique alignés fonctionnelle grâce à l&#39;impression par microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Recherche

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Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

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