Name: generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Wir danken Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Vereinigte Staaten), der freundlicherweise die NRC-Zelllinie zur Verfügung gestellt hat.
Diese Arbeit wurde sowohl vom iLite RHU-Programm (Grant ANR-16-RHUS-0005) als auch von der DHU Hepatinov finanziell unterstützt.
Wir danken Isabelle Garcin und Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay für ihre Unterstützung bei der Bildgebung.

1. Erzeugung von Zysten
HINWEIS: Dieses Protokoll kann mit jeder Art von Hydrogel durchgeführt werden, wenn die Gegebung das Einbetten von Zellen zulässt.
<ol><li>Hydrogelbeschichtung HINWEIS: Die richtige Hydrogelbeschichtung des Kammerschlittens ist ein kritischer Schritt, um die Bildung von 2D-Zellschichten auf der Unterseite des Brunnens zu vermeiden, die die nachfolgende Zystenbildgebung stören und die Berechnung der Zystenbildungseffizienz beeinträchtigen könnten.<ol>
<li>Um di...

<ol>
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Um die Organogenese und die Erhaltung von 3D-Zellstrukturen zu untersuchen, wurden verschiedene Gewebe modelliert, mit unterschiedlichen zellulären Ursprüngen, aber auch verschiedenen Arten von extrazellulären Matrizen einschließlich synthetischer Hydrogele8,9,10,21. Aufgrund des Fehlens einer quantitativen 3D-Analyse, die Vergleiche zwischen Methoden in Bezug auf Organoidbildung oder Funkt...

In den letzten drei Jahrzehnten hat sich der Bereich der In-vitro-Forschung zu 3D-Kultursystemen entwickelt. Eine Reihe von Protokollen sind für die Kultivierung von Zellen in 3D als Sphäroide oder Aggregate in Gegenwart oder Abwesenheit eines Gerüstes/Matrix, in einem Tropfen, in Deragitation, in mikrofluidischen Geräten oder schwimmend1entstanden. Die Verwendung von 3D-Kulturmethoden hat sich gegenüber 2-dimensionalen (2D) Kulturen bewährt, insbesondere bei Epithelzellen, die sich nachweislich in 3D-Strukturen, zysten oder acini, selbst organisieren. In diesem Fall bilden die Zellen eine Monoschicht, die ein Lumen umgibt, wo Zellen ihren vollen epitheliaalen Phänotyp mit verbesserten physiologischen spezifischen Funktionen erwerben2.
Zahlreiche Studien haben zur Entwicklung von Methoden zur Bildung dieser epitheliale Organoide in natürlichen Matrizen beigetragen. Dies hat es ermöglicht, in vivo Zell-Zell- und Zell-Mikroumgebung-Wechselwirkungen zu rekapitulieren, um die Etablierung und Stabilität des epithelialen Phänotyps3,4,5,6,7zu erhalten. Kürzlich, insbesondere mit dem Ziel, transplantierbare Organoide zu entwickeln und die Anforderung der Mikroumgebung für die Orchestrierung des Epithelprogramms zu entschlüsseln, wurden synthetische Hydrogele entwickelt, um die Bildung von epithelialen Acini8,9,10zu verbessern. Leider berichten diese Studien über qualitative Daten oder präsentieren Berechnungsmethoden mit internen Referenzen wie das Verhältnis von Zysten zu Nichtzysten in einer 2D-Ebene8,9,10. Dies schließt einen Vergleich zwischen verschiedenen Studien in Bezug auf Effizienz, Stabilität oder morphologische und physiologische Charakterisierung der Epithelorganoide aus.
Die Mikroverkapselung von Epithelzellen in Perlen mit mikrofluidischen Geräten hat realistischere quantitative und vergleichende Ergebnisse ermöglicht. Mit dieser Technologie wurden Organoide aus verschiedenen Zelltypen gebildet und anhand der Morphologie zwischen verschiedenen 3D-Zellstrukturen11,12unterschieden. Diese Technologie ist jedoch nicht einfach zu bedienen und erfordert die Verwendung von Reinräumen, um die mikrofluidischen Geräte herzustellen. Diese Technologie wurde für einige Arten von Hydrogelen etabliert, erfordert aber technische Anpassungen, um auf andere Hydrogele angewendet zu werden, was ihre Vielseitigkeit einschränkt. Daher basieren die meisten Studien, die epitheliale Organoide entwickeln sollen, auf der Einbettung von Epithelzellen in eine Hydrogelmasse. Bei diesen Methoden wird die hohe Heterogenität der Gelstrukturierung und Zellverteilung innerhalb der gesamten 3D-Kultur oft vernachlässigt. Daher beziehen sich die meisten Analysen auf einzelne 2D-Bilder, die nur sehr grob die Verteilung der verschiedenen zellulären Objekte im gesamten 3D-Volumen darstellen.
Krankheiten, die Gallengänge beeinflussen, wie Cholangiokarzinom, Gallenatresie, primäre sklerosierende Cholangitis, unter anderem, sind eine der Hauptursachen für Sterblichkeit und Morbidität. Mit Ausnahme der Lebertransplantation gibt es keine wirksamen Behandlungen für diese Bedingungen13. Bemühungen zur Untersuchung der Gallengangbildung, der Krankheitsursachen und des Fortschreitens werden die Entwicklung neuartiger Therapien ermöglichen14.
Biliäre organotypische Modelle von Zysten, Sphäroiden oder röhrenähnlichen Strukturen mit normalen oder patientenabgeleiteten, differenzierten oder von Vorläufern abgeleiteten Cholangiozytenzelllinien wurden15,16,17,18,19,20entwickelt. Verschiedene Studien haben cholangiozyte Polarität, Expression von Cholangiozytenmarkern, Vorhandensein von Zilien, Cholangiocyte sekretot und reabsortive Fähigkeit, und Lumenbildung und Obstruktion rekapituliert; alle stellen wichtige Merkmale des Cholangiocyten-Phänotyps, der Morphologie und der Funktion15,17,19dar. Andere haben berichtet, dass die Aufrechterhaltung von patientenabgeleiteten Gallenorganoiden über einen längeren Zeitraum20berichtet hat. Kürzlich haben wir die Rolle biochemischer und biophysikalischer Hinweise auf gallenzysische Organogeneseuntersucht 21. Wichtig ist, dass die Pathogenese der Gallenatresie in Gallensphäriden und Röhren untersucht wurde7,22. Darüber hinaus wurden Schlüsselmerkmale der primären sklerosierenden Cholangitis wie Cholangiozytenszenz, Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen sowie Makrophagenrekrutierung erfolgreich mit Gallensphäriden15,20untersucht. Reproduzierbare in vitro 3D-quantitative Modelle, die physiologisch modulierencholangioyten Phänotyp, Physiologie und Mikroumgebung, in denen diese Fragen behandelt werden können, sind jedoch noch erforderlich. Darüber hinaus haben nur wenige Veröffentlichungen zystenbildung Effizienzberichtet 21,23. Dies ist ein wichtiger Punkt, um festzustellen, vor allem bei der Untersuchung der Organogenese, Krankheitsursache, und Korrelation der Arzneimittelreaktionen mit Cholangigiocyte Funktion und Polarisation. Darüber hinaus ist es schwierig, mit Unterschieden in Gerüst/Matrix, die von Protokoll zu Protokoll verwendet werden, zwischen Systemen zu vergleichen. Um diese Probleme zu lösen, schlagen wir eine quantitative, zuverlässige und universelle Methode vor, um Gallenzysten zu erzeugen, die Lumenbildung, Cholangiozytenpolarisation und Cholangiozytensekretoriennachlungimitat imitieren. Wichtig ist, dass wir eine systematische Analyse entlang der Z-Achse über das 3D-Gel hinweg präsentieren, wenn wir die Effizienz der Zystenbildung, Größe, Lebensfähigkeit, Polarisation und Funktionalität im Zeitverlauf bewerten. Darüber hinaus verwendeten wir ein natürliches Hydrogel und normale Rattencholangiocyten (NRC)s, als Beispiel für das Protokoll, aber andere natürliche oder synthetische Hydrogele, sowie Epithelzellen könnten für die Bildung von 3D-zystischen Strukturen verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">10 &#181;l- Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000020</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">100 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1000 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1X PBS</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">14190-094</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">200 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">T5516</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetic acid</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">VWR</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20104-298</td>
			<td>0.02N final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 10 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707439</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 1000 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707404</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 200 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707430</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Antibiotic Antimicotic Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A5955</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">13028-014</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 30 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine serum albumin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A2153</td>
			<td style="width:261px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11905-031</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Collagen high concentration, rat tail</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">354249</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Dexamethasone</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">D4902</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.393 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">DMEM F12</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">21331-020</td>
			<td style="width:261px;">NRC complete medium final concentration = 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">PA5-32178</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:408px;">Eclipse TE300 inverted microscope</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Ethanolamine</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">E9508</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.32 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal calf serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">10270-106</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">F6057</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Formaldehyde 16% (W/V)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">28906</td>
			<td>4% (W/V)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Goat serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">16210-064</td>
			<td style="width:261px;">1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:408px;">Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td>
			<td style="width:180px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Hoechst 33258</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">B1155</td>
			<td style="width:261px;">5 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A32733</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">51300-044</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25030-024</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">356231</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">4:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements software version 4.50.00</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>image acquisition and display</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11140-035</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&#8734;/1.2 WD 15.2)</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Propidium Iodide (PI)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P4170</td>
			<td>20 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Rhodamine Phalloidin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">R415</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">16.2 nM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sir-Actin / Verapamil kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Spirochrome</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">SC001</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">10 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">17075-029</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile cell strainer 40 &#181;m (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811E</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811D</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11926955</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">7200886</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">553913</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sucrose</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">S0389</td>
			<td>5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="24" style="height:24px;width:408px;">Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">353108</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Triton X-100</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>5:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25300-054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Tween-20</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P1379</td>
			<td>5:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Vitamin (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11120-037</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">&#956;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Clinisciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">80826</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts

Cholangiozyten, die Epithelzellen, die die Gallengänge in der Leber aneinanderreihen, bewachen die Gallenbildung und -modifikation. In den letzten zwanzig Jahren sind im Zusammenhang mit Lebererkrankungen dreidimensionale (3D) Modelle entstanden, die auf Cholangiozyten basieren, wie Zysten, Sphäroide oder röhrenartige Strukturen, um Gewebetopologie für Organogenese, Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening-Studien nachzuahmen. Diese Strukturen wurden hauptsächlich durch Einbettung von Cholangiozyten in ein Hydrogel gewonnen. Der Hauptzweck bestand darin, die Selbstorganisation zu untersuchen, indem epitheliale Polarität, funktionelle und morphologische Eigenschaften angegangen wurden. Jedoch, nur sehr wenige Studien konzentrieren sich auf Zystenbildung Effizienz. Wenn dies der Fall ist, wird die Effizienz oft anhand von Bildern einer einzelnen Ebene quantifiziert. Funktionelle Assays und Strukturanalysen werden durchgeführt, ohne die potenzielle Heterogenität der Zystenverteilung darzustellen, die sich aus Hydrogelpolymerisationsheterogenitäten und Nebenwirkungen ergibt. Daher kann die quantitative Analyse, wenn sie durchgeführt wird, nicht für den Vergleich von einem Artikel zum anderen verwendet werden. Darüber hinaus erlaubt diese Methode keine Vergleiche des 3D-Wachstumspotenzials verschiedener Matrizen und Zelltypen. Darüber hinaus wird die experimentelle Fehlerbehebung für immunstainierende Zysten nicht erwähnt. In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige und universelle Methode, um zu zeigen, dass die anfängliche Zellverteilung mit der heterogenen vertikalen Verteilung der Zystenbildung zusammenhängt. Cholangiozytenzellen, die in Hydrogel eingebettet sind, werden mit Z-Stacks-Analysen entlang der Hydrogeltiefe im Laufe von 10 Tagen verfolgt. Mit dieser Methode wird eine robuste Kinetik der Zystenbildung Effizienz und Wachstum erhalten. Wir präsentieren auch Methoden zur Bewertung der Zystenpolarität und der Sekretorialfunktion. Schließlich werden zusätzliche Tipps zur Optimierung von Immunstaining-Protokollen zur Verfügung gestellt, um den Zystenkollaps für die Bildgebung zu begrenzen. Dieser Ansatz kann auf andere 3D-Zellkulturstudien angewendet werden, wodurch die Möglichkeiten eröffnet werden, ein System mit einem anderen zu vergleichen.

Bildung und Charakterisierung von Zysten 3D-Zellkultursysteme sind ein wichtiges Werkzeug, um Organogenese und Krankheitsmodellierung zu studieren25. Leider sind die meisten dieser Methoden qualitativ oder verwenden interne Quantifizierung auf einer einzigen Ebene durch den Vergleich der Anzahl der Zysten im Vergleich zu Nicht-Zysten, in variablen und oft nicht spezifizierten Volumen, verhindert jeden Vergleich in Bezug auf Zystenbildung Effizienz zwischen den verschiedenen Stu...

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Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Dreidimensionale (3D) zelluläre Systeme sind relevante Modelle zur Untersuchung der Organogenese. Eine hydrogelbasierte Methode für die Produktion von Gallenzysten und deren Charakterisierung wird vorgeschlagen. Dieses Protokoll entschlüsselt die Barrieren der 3D-Charakterisierung, mit einer einfachen und zuverlässigen Methode, um die Effizienz der Zystenbildung und ihre Funktionalität zu bewerten.

Generierung und quantitative Charakterisierung funktioneller und polarisierter Gallenepithelzysten

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Dies ist das erste Protokoll zur Erzeugung von Gallenzysten, die eine systematische Analyse bietet, die die Bewertung der Zystenbildung, Effizienz und Größe im Laufe der Zeit ermöglicht. Diese Methode ermöglicht die quantitative Beurteilung der Epithelzystenbildung und ermöglicht es, diesen Prozess als Funktion der Art der Epithelzellen oder des Hydrogels zu bewerten. Da die therapeutischen Möglichkeiten für Gallenerkrankungen begrenzt sind, öffnet dieses Protokoll die Tür für die Standardisierung von Arzneimittelstudien, die Identifizierung normaler therapeutischer Ziele und das Verständnis von Krankheitsmechanismen.Die einfache Methode ermöglicht es, wichtige Fragen über die Mechanismen neuer Informationen im Bereich Bioengineering von Röhrenstrukturen anzugehen. Vor Beginn eines Experiments eine geeignete Hydrogellösung bei vier Grad Celsius auftauen und Pipettespitzen und eine acht Brunnenkammerrutsche bei minus 20 Grad Celsius über Nacht vorkühlen. Am nächsten Morgen das Hydrogel und eine acht Brunnenkammerrutsche auf Eis legen und das entsprechende Hydrogelvolumen dem kalten normalen Rattencholangiozyten-Gesamtmedium hinzufügen, um 500 Mikroliter 40%Hydrogellösung zu erhalten.Dann verwenden Sie die kalten Pipettenspitzen, um 50 Mikroliter Hydrogellösung in die Mitte jedes Bohrbrunnens der Kammerrutsche hinzuzufügen und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um die Lösung über die gesamte Oberfläche des Brunnenbodens so gleichmäßig wie möglich ohne Blasen zu verteilen. Um die Zellen auf das Experiment vorzubereiten, während das Hydrogel polymerisiert, waschen Sie die Zellen aus einer 70%konfluenten normalen Rattencholangiozytenkultur mit vorgewärmten PBS und inkubieren Sie die Zellen mit fünf Millilitern frischer vorgewärmter PBS für 20 Minuten im Zellkultur-Inkubator. Ersetzen Sie am Ende der Inkubation die PBS durch einen Milliliter vorgewärmter Trypsin-EDTA und geben Sie den Kolben für fünf bis zehn Minuten an den Zellkultur-Inkubator zurück.Wenn sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Reaktion mit vier Millilitern vorgewärmter vollständiger normaler Rattencholangiozytenmedium und übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein 15-Milliliter-Rohr. Dann das Pellet in fünf Millilitervorwärmmedium wieder aufhängen und die Zellen durch ein 40-Mikron-Sieb in ein 50-Milliliter-Rohr filtern, um zu zählen. Um Zysten zu erzeugen, fügen Sie das entsprechende Volumen von Hydrogel zu kalten vollständigen normalen Ratte Cholangiozyten Medium, um 1, 600 Mikroliter einer 80%Hydrogel-Lösung auf Eis zu erhalten und verdünnen Sie die Zellen auf eine fünf mal 10 bis die fünfte Zelle pro Milliliter der kalten vollständigen normalen Rattencholangiozyten mittlere Konzentration in 1, 600 Mikroliter Medium.Mischen Sie sofort die Zell- und Hydrogelzelllösungen und fügen Sie 400 Mikroliter Zellen zu jedem Brunnen des hydrogelbeschichteten Kammerschlittens hinzu, wobei darauf geachtet wird, Blasen zu vermeiden. Um die Erfassung reproduzierbarer und signifikanter Ergebnisse zu gewährleisten, achten Sie darauf, das Hydrogel sorgfältig zu handhaben und die ursprüngliche Zellwasserstofflösung gründlich zu mischen, um eine homogene Lösung zu erhalten. Wenn alle Zellen gesät wurden, platzieren Sie die Folie im Zellkultur-Inkubator.Nach zwei Tagen in der Kultur, entfernen Sie 250 Mikroliter des Mediums aus einer Ecke jedes Brunnens, achten Sie darauf, das Hydrogel nicht auszuspülen, und ersetzen Sie langsam den ausrangierten Überstand durch 250 Mikroliter frisches Kulturmedium. Für die Zystenbildgebung wählen Sie am entsprechenden Kulturtag das 10-X-Objektiv auf einem Phasenkontrastmikroskop aus, das mit Bildaufnahmesoftware ausgestattet ist, schalten Sie die weiße Lampe ein und wählen Sie die Hellfeld-Bildgebungsoption. Wählen Sie Spiel, um die Kamera einzuschalten und sich auf ein Zystenfeld zu konzentrieren.Legen Sie die Belichtungszeit fest, und öffnen Sie das Fenster für den automatischen Erfassungsordner, um das automatische Speichern der Bilder zu ermöglichen. Öffnen Sie das Capture-Fenster der Z-Serie, setzen Sie die Standardposition zurück und verwenden Sie die Z-Schraube, um die obere und untere Ebene des Z-Stacks zu definieren, indem Sie den Z-Schritt abhängig vom Objektiv und der Auflösungshöhe anpassen. Klicken Sie dann auf Jetzt ausführen, um die Erfassung zu starten.Öffnen Sie nach der Bildgebung den Z-Stack auf Fidschi. Um den Stapel zu duplizieren, klicken Sie auf Bild, Duplikat und doppelten Stapel. Um eine minimale Intensitätsprojektion aus dem duplizierten Stapel zu erstellen, wählen Sie unter dem Bildmenü Stapel und Z-Projekt aus.Wählen Sie die minimale Intensität für den Projektionstyp aus, und klicken Sie auf "OKAY". Um den Hintergrund von der Projektion zu subtrahieren, wählen Sie unter dem Prozessmenü Hintergrund und 500 Pixel rollenden Kugelradius und Lichthintergrund aus, um die Zysten kontrastreicher als der Hintergrund zu rendern. Um den ungefähren Zystendurchmesser zu messen, zoomen Sie auf die Zielzyste, wählen Sie das gerade Werkzeug aus und drücken Sie die T-Taste auf der Tastatur.Zeichnen Sie eine Linie über den Durchmesser jeder Zyste auf der Endprojektion. Die nächste Region von Interesse für jede Zyste erstellt wird, um die Region von Interesse Manager hinzugefügt werden. Wenn alle Zysten gezählt wurden, klicken Sie auf das Z-Stack-Fenster, um es auszuwählen, und klicken Sie auf Alle anzeigen, um die gezählten Zysten anzuzeigen.Bewegen Sie den Cursor entlang des Z-Stacks, um zu überprüfen, ob alle Zysten in jedem Bild gezählt wurden, und fügen Sie dem Bereichsmanager bei Bedarf neue Zysten hinzu. Wenn alle Zysten gezählt wurden, wählen Sie den festgelegten Interessenbereich aus, klicken Sie auf mehr und speichern Sie, um die Daten zu speichern. Um die Größe jeder Zyste zu bestimmen, wobei die Interessenbereiche noch ausgewählt sind, klicken Sie auf Maß.Ein Fenster mit jeder Zyste und ihrer geschätzten Größe wird angezeigt. Speichern Sie dann die Daten im CSV-Format. Wie gezeigt, ermöglicht die Aufzeichnung der Anzahl der Zysten und ihrer jeweiligen Größen im Laufe der Zeit die Analyse der Evolution der Zystenbildung und des Wachstums.Die Lebensfähigkeit der Ausgangszellpopulation und der 10 Tage alten Zysten kann durch lebende/tote Färbung bewertet werden. Tote Zellen stellen weniger als 3% der Zellpopulation an Tag 10 dar und befinden sich meist außerhalb der Zyste als isolierte Zellen oder als Teil kleiner Aggregate, obwohl einige nekrotische Zellablagerungen in einigen großen Zysten beobachtet werden. Die Inkubation mit Fluorescein-Diacetat und Hoechst ermöglicht die Beurteilung der Bildung und Sekretion von Fluorescein vom Basal bis zum apikalen Luminalraum.Insbesondere wird die Sekretion von Fluorescein durch Vorbehandlung mit einem multiresistenten Inhibitor gehemmt, was darauf hindeutet, dass die fluoreszierende Fluorescein-Akkumulation innerhalb des Lumens auf die Sekretion durch den multiresistenten Transporter zurückzuführen ist und nicht aus dem interzellulären Raum austritt. Die Färbung der E-Cadherin-Expression zeigt, dass die normalen Rattencholangiozyten ihren epitheliale Phänotyp im Hydrogel mindestens 10 Tage lang beibehalten. Bei der Vorbereitung der Zysten für die Immunfluoreszenzbewertung ist es der Schlüssel zur Aufrechterhaltung der Zystenintegrität, wenn das Rinderserumalbumin während der Sättigung bei 0,1% oder weniger bleibt, da höhere Konzentrationen zu Zystenrückzieher und Lumenkollaps führen.Über Nacht hydrogel-, Tautau-, Pipettenspitzen- und Kammerschiebeaufnahmen, Aufe arbeiten und das homogene Zellhydrogelgemisch gleichmäßig auf die kultivierte Kammerrutsche verteilen, sind entscheidend für den experimentellen Erfolg. Diese Methode kann verwendet werden, um Zysten aus anderen Epithelzellen oder Hydrogelen zu erzeugen, was Vergleiche für ein besseres Verständnis der epitheliaalen Polarisation ermöglicht. Diese quantitative Methode kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Medikamenten oder genetischen Mutationen auf die Gallenfunktion und Organogenese zu testen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Forschung

Biotechnik

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Konstruktion und Charakterisierung eines neuartigen Bioreaktor Stimmlippen

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Herstellung und Charakterisierung eines Conformal-Haut-like Electronic System for Quantitative, kutane Wundmanagement

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Doppelemulsion Erstellung Mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Co-Axial Flow Fokus Geräte-

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Die Verbesserung der 2D- und 3D-Haut<em&gt; In Vitro</em&gt; Modellen mithilfe von Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Die Erzeugung von ESC-derived Maus Airway epithelialen Zellen unter Verwendung von Dezellularisierte Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Erzeugung dynamischer Umgebungsbedingungen mit einem hochdurchsatzstarken mikrofluidischen Gerät

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...