Name: generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

אנו מודים לד"ר ניקולס לרוסו (מאיו קליניק, רוצ'סטר, מינסוטה, ארצות הברית), אשר סיפק בחביבות את קו התא NRC.
עבודה זו זכתה לתמיכה כספית הן בתוכנית iLite RHU (להעניק ANR-16-RHUS-0005) והן של DHU Hepatinov.
אנו מודים לאיזבל גארסין ורוסו ד'אימליירי צלולייר פריז סקלי על תמיכתם בהדמיה.

1. דור ציסטות
הערה: פרוטוקול זה יכול להתבצע עם כל סוג של הידרוג'ל, אם הג'לציה מאפשרת הטבעה של תאים.
<ol><li>ציפוי הידרוג'ל הערה: ציפוי הידרוג'ל נכון של השקופית התא הוא צעד קריטי כדי למנוע היווצרות של שכבות תא 2D בתחתית הבאר, זה עלול להפריע הדמיה ציסטה עוקבות ולפגוע בחישוב של יעילו?...

<ol>
	<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Mart&#237;n-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis.">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cells+in+Three-Dimensional+Collagen+Matrix.">Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix.</a> Current Procotols in Cell Biology. , (2010).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).</li><li>Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hepatocyte+spheroids+immobilization+technique+using+alternative+encapsulation+method.">Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).</li><li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+plant+isoflavonoid+that+causes+biliary+atresia.">Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia.</a> Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).</li><li>Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+GAG-matrices+to+promote+mammary+epithelial+morphogenesis+in+vitro.">Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 112, 20-30 (2017).</li><li>Miroshnikova, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Strategies+to+Recapitulate+Epithelial+Morphogenesis+Within+Synthetic+Three-Dimensional+Extracellular+Matrix+With+Tunable+Mechanical+Properties.">Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties.</a> Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).</li><li>Ozdemir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Hydrogel+Properties+to+Promote+the+Assembly+of+Salivary+Gland+Spheroids+in+3D.">Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).</li><li>Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+3D+culture+in+Matrigel+microbeads+to+analyze+clonal+acinar+development.">Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development.</a> Biomaterials. 52, 347-357 (2015).</li><li>Laperrousaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transfection+of+clonal+organoids+in+Matrigel+microbeads:+a+promising+approach+toward+organoid-based+genetic+screens.">Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).</li><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiopathies+-+Towards+a+molecular+understanding.">Cholangiopathies - Towards a molecular understanding.</a> EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).</li><li>Loarca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+cholangioids+from+normal+and+diseased+human+cholangiocytes+as+an+in+vitro+model+to+study+primary+sclerosing+cholangitis.">Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis.</a> Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).</li><li>De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+and+the+biliary+tree.">Regenerative medicine and the biliary tree.</a> Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).</li><li>Dianat, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+cholangiocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+and+HepaRG+cells.">Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells.</a> Hepatology. 60, 700-714 (2014).</li><li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+autophagy+contributes+to+hepatic+cystogenesis+in+polycystic+liver+disease+and+represents+a+potential+therapeutic+target.">Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target.</a> Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile.">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li><li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds.">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions.">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Organoids+from+Mouse+Extrahepatic+Bile+Ducts.">Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).</li><li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides.">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment.">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Annexin+V/Propidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death.">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).</li><li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Cholangiocytes.">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li><li>Spirl&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarity+of+Na+/H++and+Cl-/HCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line.">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li></ol>

על מנת ללמוד organogenesis ותחזוקה של מבנים תאיים 3D, רקמות שונות כבר מודל, באמצעות מקורות תאיים שונים, אבל גם סוגים שונים של מטריצות חוץ תאי כוללהידרוג'לים סינתטיים 8,9,10,21. עם זאת, בשל היעדר ניתוח כמותי תלת-מידי המאפשר השוואות ב?...

בשלושת העשורים האחרונים, תחום המחקר במבחנה התקדם לעבר מערכות תרבות תלת-מית-מיו. מספר פרוטוקולים צצו עבור תאים culturing ב3D כמו spheroids או אגרגטים בנוכחות או היעדר פיגומים / מטריצה, בטיפה, בעצבנות, בהתקנים מיקרופלואידים, אוצף 1. השימוש בשיטות תרבות תלת-ממדיות הוכיח את יתרונותיו על פני תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), במיוחד עבור תאי אפיתל, אשר הוכחו כארגון עצמי במבנים תלת-ממדיים, הנקראים ציסטות או אצ'יני. במקרה זה, התאים יוצרים שכבת מונו-שכבתית המקיפה לומן, שבו תאים לרכוש פנוטיפ אפיתל המלא שלהם עם פונקציות פיזיולוגיות ספציפיות משופרות2.
מחקרים רבים תרמו לפיתוח שיטות לגבש אורגנואידים אפיתל אלה במטריות טבעיות. זה אפשר לסיכום באינטראקציות vivo תא תא ומיקרו-סביבה, כדי לקבל את הממסד ואת היציבות של פנוטיפ אפיתל3,4,5,6,7. לאחרונה, ובמיוחד במטרה לפתח אורגנואידים להשתלה ולפענח את הדרישה של microenvironment לתיאום תוכנית האפיתל, הידרוג'לים סינתטיים פותחו כדי לשפר את היווצרות של אפיתל acini8,9,10. למרבה הצער, מחקרים אלה מדווחים על נתונים איכותיים, או מציגים שיטות חישוב באמצעות הפניות פנימיות כגון היחס בין ציסטות על-פני ציסטות במטוס דו-מימד8,9,10. זה מונע כל השוואה בין מחקרים שונים במונחים של יעילות, יציבות, או אפיון מורפולוגי ופיזיולוגי של אורגנואידים אפיתל.
מיקרו-אנקסטלציה של תאי אפיתל בחרוזים באמצעות מכשירים מיקרו-נוזלים אפשרה תוצאות כמותיות והשוואתיות מציאותיות יותר. באמצעות טכנולוגיה זו, אורגנואידים מסוגי תאים שונים נוצרו והבדילו בהתבסס על מורפולוגיה בין מבנים תאיים תלת-מימדשונים 11,12. עם זאת, טכנולוגיה זו אינה קלה לעבודה ודורשת שימוש בחדרים נקיים כדי לייצר את המכשירים המיקרו-נוזלים. טכנולוגיה זו הוקמה עבור מספר סוגים של הידרוג'לים אך דורשת התאמה טכנית כדי להיות מיושמת על הידרוג'לים אחרים, הגבלת הרב-תכליתיות שלה. לכן, רוב המחקרים שנועדו לפתח אורגנואידים אפיתל להסתמך על הטבעה של תאים אפיתל בצובר הידרוג'ל. בשיטות אלה, הטרוגניות גבוהה של ג'ל structuration והפצה תא בתוך כל תרבות 3D מוזנח לעתים קרובות. לכן, רוב הניתוחים מתייחסים לתמונות 2D בודדות, המייצגות רק בערך את ההתפלגות של העצמים הסלולריים השונים בכל אמצעי האחסון התת-ממדי.
מחלות המשפיעות על תעלות מרה, כגון cholangiocarcinoma, אטרזיה המרה, cholangitis טרשת נפוצה העיקרית, בין היתר, הם הגורם העיקרי של תמותה ותחלואה. מלבד השתלת כבד, אין טיפולים יעילים עבור תנאים אלה13. המאמצים לחקור היווצרות צינור מרה, גורמים למחלות והתקדמות יאפשרו פיתוח של טיפולים חדשניים14.
מודלים organotypic מרה של ציסטות, spheroids או מבנים דמויי צינור באמצעות נורמלי או המטופל נגזר, מובדיל, או קווי תא cholangiocyte נגזר צוגנטור פותחו15 , 16,17,18,19,20. מחקרים שונים יש recapitulated קוטביות cholangiocyte, ביטוי של סמני cholangiocyte, נוכחות של סיליה, הפרשת cholangiocyte ויכולת ספיגה מחדש, היווצרות לומן וחסימה; כולם מייצגים מאפיינים חשובים של פנוטיפ צ'ולנגיוציט, מורפולוגיהופונקציה 15,17,19. אחרים דיווחו על תחזוקה של אורגנואידים מרים נגזר המטופל במשך פרקי זמן ארוכים20. לאחרונה, חקרנו את התפקיד של רמזים ביוכימיים וביופיזיים על ציסטות מרה organogenesis21. חשוב לציין, הפתוגנזה של אטרזיה מרה נחקרה ב spheroids מרה וצינורות7,22. יתר על כן, תכונות עיקריות של cholangitis טרשת נפוצה כגון סנסציה cholangiocyte, הפרשת ציטוקינות פרו דלקתיות, כמו גם גיוס מקרופאג נחקרו בהצלחה באמצעות spheroids מרה15,20. עם זאת, ניתן לשחזר במבחנה מודלים כמותיים 3D כי פיזיולוגי לווסת פנוטיפ cholangiocyte, פיזיולוגיה, ומיקרוסביבה שבו שאלות אלה ניתן לטפל עדיין נדרשים. יתר על כן, רק מעט פרסומים דיווחו על יעילות היווצרות ציסטה21,23. זוהי נקודה חשובה כדי לבסס, במיוחד בעת חקירת organogenesis, גורם למחלה, ומתאמת של תגובות סמים עם פונקציה cholangiocyte וקיטוב. בנוסף, עם הבדלים בפיגומים/מטריצה המשמשים מרוטוקול לפרוטוקול, קשה להשוות בין מערכות. כדי לפתור בעיות אלה, אנו מציעים שיטה כמותית, אמינה ואוניברסלית כדי ליצור ציסטות מרה מחקה היווצרות לומן, קיטוב cholangiocyte, ופונקציית הפרשת cholangiocyte. חשוב לציין, אנו מציגים ניתוח שיטתי המבוצע לאורך ציר ה-Z על-פני ג'ל תלת-ממדי בעת הערכה לאורך זמן, יעילות היווצרות ציסטה, גודל, כדאיות, קיטוב ופונקציונליות. יתר על כן, השתמשנו הידרוג'ל טבעי ו cholangiocytes חולדה נורמלי (NRC)s, כדוגמה לפרוטוקול, אבל הידרוג'לים טבעיים או סינתטיים אחרים, כמו גם תאים אפיתל יכול לשמש להיווצרות של מבנים סיסטיק 3D.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">10 &#181;l- Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000020</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">100 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1000 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1X PBS</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">14190-094</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">200 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">T5516</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetic acid</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">VWR</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20104-298</td>
			<td>0.02N final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 10 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707439</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 1000 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707404</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 200 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707430</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Antibiotic Antimicotic Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A5955</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">13028-014</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 30 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine serum albumin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A2153</td>
			<td style="width:261px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11905-031</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Collagen high concentration, rat tail</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">354249</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Dexamethasone</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">D4902</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.393 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">DMEM F12</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">21331-020</td>
			<td style="width:261px;">NRC complete medium final concentration = 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">PA5-32178</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:408px;">Eclipse TE300 inverted microscope</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Ethanolamine</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">E9508</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.32 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal calf serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">10270-106</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">F6057</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Formaldehyde 16% (W/V)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">28906</td>
			<td>4% (W/V)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Goat serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">16210-064</td>
			<td style="width:261px;">1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:408px;">Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td>
			<td style="width:180px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Hoechst 33258</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">B1155</td>
			<td style="width:261px;">5 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A32733</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">51300-044</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25030-024</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">356231</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">4:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements software version 4.50.00</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>image acquisition and display</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11140-035</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&#8734;/1.2 WD 15.2)</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Propidium Iodide (PI)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P4170</td>
			<td>20 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Rhodamine Phalloidin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">R415</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">16.2 nM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sir-Actin / Verapamil kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Spirochrome</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">SC001</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">10 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">17075-029</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile cell strainer 40 &#181;m (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811E</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811D</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11926955</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">7200886</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">553913</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sucrose</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">S0389</td>
			<td>5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="24" style="height:24px;width:408px;">Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">353108</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Triton X-100</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>5:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25300-054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Tween-20</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P1379</td>
			<td>5:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Vitamin (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11120-037</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">&#956;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Clinisciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">80826</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts

Cholangiocytes, תאי האפיתל כי בשורה את תעלות המרה בכבד, לפקח על היווצרות מרה ושינוי. בעשרים השנים האחרונות, בהקשר של מחלות כבד, מודלים תלת מימדיים (3D) המבוססים על cholangiocytes הופיעו כגון ציסטות, spheroids, או מבנים דמויי צינור לחקות טופולוגיה רקמות עבור organogenesis, מידול מחלות, מחקרי סינון סמים. מבנים אלה הושגו בעיקר על ידי הטבעת cholangiocytes בהידרוג'ל. המטרה העיקרית הייתה ללמוד ארגון עצמי על ידי טיפול בקוטביות אפיתל, פונקציונלי, ומאפיינים מורפולוגיים. עם זאת, מעט מאוד מחקרים מתמקדים ביעילות היווצרות ציסטה. כאשר זהו המקרה, היעילות מכמתת לעתים קרובות מתמונות של מטוס יחיד. בדיקות פונקציונליות וניתוח מבני מבוצעים מבלי לייצג את ההטרוגניות הפוטנציאלית של התפלגות ציסטה הנובעת הטרוגניזציה של פולימר הידרוג'ל ותופעות לוואי. לכן, אין אפשרות להשתמש בניתוח הכמותי, כאשר הוא נעשה, להשוואה ממאמר אחד לאחר. יתר על כן, מתודולוגיה זו אינה מאפשרת השוואות של פוטנציאל צמיחה תלת-מית-מיו של מטריצות וסוגי תאים שונים. בנוסף, אין אזכור של פתרון בעיות ניסיוני עבור ציסטות immunostaining. במאמר זה, אנו מספקים שיטה אמינה ואוניברסלית כדי להראות כי התפלגות התא הראשונית קשורה התפלגות אנכית הטרוגנית של היווצרות ציסטה. תאים Cholangiocyte מוטבע הידרוג'ל מלווה בניתוח Z-stacks לאורך עומק הידרוג'ל לאורך הזמן של 10 ימים. בשיטה זו, קינטיקה חזקה של יעילות היווצרות ציסטה וצמיחה מתקבלת. אנו גם מציגים שיטות להערכת קוטביות ציסטה ותפקוד הפרשה. לבסוף, טיפים נוספים למיטוב פרוטוקולי אימונוסטיין מסופקים כדי להגביל את קריסת ציסטה להדמיה. גישה זו יכולה להיות מיושמת על מחקרים אחרים של תרבות תאים תלת-מיוד, ובכך לפתוח את האפשרויות להשוות מערכת אחת לאחרת.

היווצרות ואפיון ציסטות מערכות תרבות תאים תלת-מימד הן כלי חשוב לחקר אורגנוגנזה ומידול מחלות25. למרבה הצער, רוב שיטות אלה הן איכותיות או להשתמש כימות פנימית המבוצעת על מישור יחיד על ידי השוואת מספר ציסטות לעומת ציסטות, בנפחים משתנים ולעתים קרובות לא מוגדרים, מניעת כל ?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

מערכות תאיות תלת מימדיות (תלת-ממדיות) הן מודלים רלוונטיים לחקירת אורגנוגנזה. שיטה מבוססת הידרוג'ל לייצור ציסטות מרה ואפיון שלהם מוצע. פרוטוקול זה חושף את המחסומים של אפיון תלת-מימד, עם שיטה פשוטה ואמינה להערכת יעילות היווצרות ציסטה, גדלים, ולבדוק את הפונקציונליות שלהם.

ייצור ואפיון כמותי של ציסטות אפיתל מרה פונקציונליות ומקוטבות

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

זהו הפרוטוקול הראשון ליצירת ציסטות מרה, המספק ניתוח שיטתי המאפשר הערכה של היווצרות ציסטה, יעילות וגודל לאורך זמן. שיטה זו מאפשרת הערכה כמותית של היווצרות ציסטה אפיתל, ומאפשרת להעריך תהליך זה כפונקציה של סוג תאי אפיתל או הידרוג'ל. מכיוון שהאפשרויות הטיפוליות להפרעות מרה מוגבלות, פרוטוקול זה פותח את הדלת לתקנון מחקרי תרופות, זיהוי מטרות טיפוליות תקינות והבנת מנגנוני מחלה.השיטה הפשוטה מאפשרת שאלות חשובות על המנגנונים של מידע חדש בתוך הנדסה ביולוגית של שדה מבנים צינוריים להיות מטופלים. לפני תחילת ניסוי, להפשיר פתרון הידרוג'ל מתאים בארבע מעלות צלזיוס וטיפים פיפטה מראש מגניב שקופית תא שמונה היטב במינוס 20 מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, מניחים את הידרוג'ל ושמונה שקופיות תא היטב על קרח ולהוסיף את הנפח המתאים של הידרוג'ל כדי קר נורמלי חולדה cholangiocyte להשלים מדיום כדי להשיג 500 microliters של 40% פתרון הידרוג'ל.לאחר מכן השתמשו בטיפים הקרים של פיפטה כדי להוסיף 50 מיקרוליטרים של פתרון הידרוג'ל למרכז כל באר של שקופית התא ולהשתמש בקצה פיפטה כדי להפיץ את הפתרון על פני השטח כולו של התחתית היטב באופן שווה ככל האפשר ללא בועות. כדי להכין את התאים לניסוי, בעוד הידרוג'ל הוא פילמור, לשטוף את התאים מ 70% תרבות cholangiocyte עכברוש נורמלי קונפלוסנט עם PBS מחומם מראש דגירה התאים עם חמישה מיליליטר של PBS מחומם מראש טרי במשך 20 דקות באינקובטור תרבות התא. בסוף הדגירה, להחליף את PBS עם מיליליטר אחד של טריפסין-EDTA מחומם מראש ולהחזיר את הבקבוק לחממה תרבות התא במשך חמש עד 10 דקות.כאשר התאים התנתקו, לנטרל את התגובה עם ארבעה מיליליטר של מראש מחומם נורמלי חולדה cholangiocyte מדיום ולהעביר את התאים לצינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. ואז להשעות מחדש את גלולה בחמישה מיליליטר של מדיום מחומם מראש ולסנן את התאים דרך מסננת 40 מיקרון לתוך צינור 50 מיליליטר לספירה. כדי ליצור ציסטות, להוסיף את הנפח המתאים של הידרוג'ל קר להשלים חולדה נורמלית cholangiocyte בינוני כדי להשיג 1, 600 microliters של 80% הידרוג'ל פתרון על קרח לדלל את התאים חמש פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר של קר להשלים ריכוז בינוני חולדה נורמלית ב 1, 600 microliters של מדיום.מיד לערבב את התא ואת פתרונות תא הידרוג'ל ולהוסיף 400 microliters של תאים לכל באר של שקופית תא מצופה הידרוג'ל, דואג להימנע בועות. כדי להבטיח רכישה של תוצאות ניתנות לשחזור ומשמעותיות, הקפד לטפל בהידרוגל בזהירות ולערבב ביסודיות את פתרון המימן הראשוני לתאים כדי להשיג פתרון הומוגני. כאשר כל התאים כבר זרעו, למקם את השקופית באינקובטור תרבות התא.לאחר יומיים בתרבות, להסיר 250 microliters של המדיום מפינה אחת של כל באר, דואג לא לשטוף את הידרוג'ל, ולאט לאט להחליף את supernatant מושלך עם 250 microliters של מדיום תרבות טרייה. להדמיית ציסטה, ביום המתאים לתרבות, בחר את המטרה 10 X במיקרוסקופ ניגוד פאזה המצויד בתוכנה לרכישת תמונה, הפעל את המנורה הלבנה ובחר באפשרות ההדמיה של שדה בהיר. בחר לשחק כדי להפעיל את המצלמה ולהתמקד בשדה של ציסטות.הגדר את זמן החשיפה ופתח את חלון תיקיית הלכידה האוטומטית כדי לאפשר שמירה אוטומטית של התמונות. פתח את חלון סדרת Z ללכידה, אפס את מיקום ברירת המחדל ולהשתמש ב- Z-בורג כדי להגדיר את המישורים העליונים והתחתונים של מחסנית Z, התאמת שלב Z בהתאם למטרה ואת רמת הרזולוציה. לאחר מכן לחץ על הפעל כעת כדי להפעיל את הרכישה.לאחר ההדמיה, פתח את מחסנית Z בפיג'י. כדי לשכפל את הערימה, לחץ על תמונה, כפול וערימה כפולה. ליצירת הקרנה בעצימות מינימלית מהערימה המשוכפלת, תחת תפריט תמונה, בחרו 'ערימות' ו'פרוייקט Z'.בחר בעוצמה מינימלית עבור סוג ההקרנה ולחץ על אישור. כדי להחסיר את הרקע מההקרנה, תחת תפריט התהליך, בחר חיסור רקע ובחר 500 פיקסלים של רדיוס כדור מתגלגל ורקע בהיר כדי להפוך את הציסטות לניגודיות יותר מהרקע. כדי למדוד את קוטר הציסטה המשוער, הגדל את הציסטה הממוקדת, בחר בכלי הקו הישר ולחץ על לחצן T במקלדת.צייר קו לאורך הקוטר של כל ציסטה בהקרנה הסופית. אזור העניין הבא שנוצר עבור כל ציסטה יתווסף לאזור מנהל העניין. לאחר ספירת כל הציסטות, לחץ על חלון מחסנית Z כדי לבחור אותו ולחץ על הצג הכל כדי לראות את הציסטות שנספרו.הזז את הסמן לאורך מחסנית Z כדי לבדוק שכל הציסטות נספרו בכל תמונה, תוך הוספת ציסטות חדשות לאזור מנהל העניין לפי הצורך. לאחר ספירת כל הציסטות, בחר את אזור קבוצת העניין ולחץ על עוד ושמור כדי לשמור את הנתונים. כדי לקבוע את הגודל של כל ציסטה, כאשר אזורי העניין עדיין נבחרו, לחץ על מידה.יופיע חלון המפרט כל ציסטה וגודלה המשוער. לאחר מכן שמור את הנתונים בתבנית CSV. כפי שהוכח, רישום מספר הציסטות והגדלים המתאימים להן לאורך זמן מאפשר ניתוח של האבולוציה של היווצרות ציסטה וצמיחה.הכדאיות של אוכלוסיית התאים ההתחלתיים וציסטות ישנות של 10 ימים ניתן להעריך על ידי כתמים חיים / מתים. תאים מתים מייצגים פחות מ -3% מאוכלוסיית התאים ביום 10 והם ממוקמים בעיקר מחוץ לציסטה כתאים מבודדים או כחלק מצטברות קטנות, אם כי כמה הצטברות פסולת תאים נמקית נצפית בתוך כמה ציסטות גדולות. הדגירה עם ניקוד פלואורסין והוישט מאפשרת הערכה של היווצרות הפרשת פלואורסין מהבסל לחלל הזוהר האפי.יש לציין, הפרשת פלואורסצין מעוכב על ידי טיפול מקדים עם מעכב עמידים לתרופות מרובות, המציין כי הצטברות פלואורסצין פלואורסצנטי בתוך לומן נובע הפרשה באמצעות טרנספורטר עמידים לתרופות מרובות ולא דליפה מהחלל הבין תאי. כתמים לביטוי E-cadherin מגלה כי cholangiocytes עכברוש נורמלי לשמור על פנוטיפ האפיתל שלהם הידרוג'ל לפחות 10 ימים. בעת הכנת הציסטות להערכת immunofluorescence, שמירה על אלבומין סרום בקר ב 0.1% או פחות במהלך הרוויה הוא המפתח לשמירה על שלמות ציסטה, כמו ריכוזים גבוהים יותר לגרום נסיגת ציסטה ולומן לקרוס.הידרוג'ל לילה, הפשרה, קצה פיפטה והקלטת מגלשה קאמרית, עבודה על קרח והפצת תערובת הידרוג'ל תא הומוגנית באופן אחיד על מגלשת התא התרבותית הם קריטיים להצלחה ניסיונית. שיטה זו יכולה לשמש כדי ליצור ציסטות מתאים אפיתל אחרים או הידרוג'לים, המאפשר השוואות להבנה טובה יותר של קיטוב אפיתל. שיטה כמותית זו יכולה לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של תרופות או מוטציות גנטיות על תפקוד המרה ו organogenesis.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

רגישות סמים של adenylyl cyclase: התייעלות Assay ומזעור למולקולה קטנה ויישומים הקרנת siRNA

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

בנייה ואפיון של Bioreactor פולד רומן וקאלי

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

ייצור ואפיון של מערכת אלקטרונית כמו-עור קונפורמי לניהול כמותי, עורית פצע

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

זוגי אמולסיה דור שימוש בהתקן זרימת פוקוס Co-הצירית polydimethylsiloxane (PDMS)

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

דור של אפיתל דרכי נשימת עכבר נגזרות ESC תאי שימוש decellularized פיגומי ריאות

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

יצירת תנאי סביבה דינמיים באמצעות מכשיר מיקרופלואידי בעל תפוקה גבוהה

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...