Name: generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Agradecemos ao Dr. Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Estados Unidos), que gentilmente forneceu a linha celular NRC.
Este trabalho recebeu o apoio financeiro tanto do programa iLite RHU (conceder ANR-16-RHUS-0005) quanto do DHU Hepatinov.
Agradecemos a Isabelle Garcin e Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay pelo apoio à imagem.

1. Geração de cistos
NOTA: Este protocolo pode ser realizado com qualquer tipo de hidrogel, se a gelação permitir a incorporação de células.
<ol><li>Revestimento de hidrogel NOTA: O revestimento adequado do hidrogel do escorregador da câmara é um passo crítico para evitar a formação de camadas de células 2D na parte inferior do poço, que podem interferir com a imagem subsequente do cisto e prejudicar o cálculo da eficiência da formação de cisto.<ol>
<li>Para garantir a h...

<ol>
	<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Mart&#237;n-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis.">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cells+in+Three-Dimensional+Collagen+Matrix.">Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix.</a> Current Procotols in Cell Biology. , (2010).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).</li><li>Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hepatocyte+spheroids+immobilization+technique+using+alternative+encapsulation+method.">Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).</li><li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+plant+isoflavonoid+that+causes+biliary+atresia.">Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia.</a> Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).</li><li>Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Strategies+to+Recapitulate+Epithelial+Morphogenesis+Within+Synthetic+Three-Dimensional+Extracellular+Matrix+With+Tunable+Mechanical+Properties.">Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties.</a> Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).</li><li>Ozdemir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Hydrogel+Properties+to+Promote+the+Assembly+of+Salivary+Gland+Spheroids+in+3D.">Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).</li><li>Dolega, M. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+autophagy+contributes+to+hepatic+cystogenesis+in+polycystic+liver+disease+and+represents+a+potential+therapeutic+target.">Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target.</a> Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile.">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li><li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds.">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions.">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Organoids+from+Mouse+Extrahepatic+Bile+Ducts.">Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).</li><li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides.">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment.">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Annexin+V/Propidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death.">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).</li><li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Cholangiocytes.">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li><li>Spirl&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarity+of+Na+/H++and+Cl-/HCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line.">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li></ol>

Para estudar a organogênese e a manutenção de estruturas celulares 3D, vários tecidos foram modelados, utilizando diferentes origens celulares, mas também diferentes tipos de matrizes extracelulares, incluindo hidrogéis sintéticos8,9,10,21. No entanto, devido à falta de análise quantitativa 3D que permita comparações entre métodos em termos de formação ou funcionalidade organoides...

Nas últimas três décadas, o campo da pesquisa in vitro avançou em direção aos sistemas de cultura 3D. Uma série de protocolos surgiram para a cultura de células em 3D como esferoides ou agregados na presença ou ausência de um andaime/matriz, em uma gota, em agitação, em dispositivos microfluidos, ou flutuante1. O uso de métodos de cultura 3D provou suas vantagens sobre culturas bidimensionais (2D), particularmente para células epiteliais, que foram demonstradas para auto-organizar em estruturas 3D, chamadas cistos ou acini. Neste caso, as células formam uma monocamada circundando um lúmen, onde as células adquirem seu fenótipo epitelial completo com funções específicas fisiológicas melhoradas2.
Inúmeros estudos têm contribuído para o desenvolvimento de métodos para a formação desses organoides epiteliais em matrizes naturais. Isso permitiu recapitular interações in vivo célula-célula e microambiente celular, para obter o estabelecimento e a estabilidade do fenótipo epitelial3,4,5,6,7. Recentemente, e em particular com o objetivo de desenvolver organoides transplantáveis e decifrar a exigência do microambiente para orquestrar o programa epitelial, hidrogéis sintéticos foram desenvolvidos para melhorar a formação de acini epitelial8,9,10. Infelizmente, esses estudos relatam dados qualitativos, ou apresentam métodos de cálculo utilizando referências internas, como a razão de cistos sobre não cistos em um plano 2D8,9,10. Isso exclui qualquer comparação entre diferentes estudos em termos de eficiência, estabilidade ou caracterização morfológica e fisiológica dos organoides epiteliais.
A microencapsulação de células epiteliais em contas usando dispositivos microfluidos permitiu resultados quantitativos e comparativos mais realistas. Utilizando essa tecnologia, organoides de vários tipos celulares foram formados e diferenciados com base na morfologia entre diferentes estruturas celulares 3D11,12. No entanto, essa tecnologia não é fácil de trabalhar e requer o uso de salas limpas para produzir os dispositivos microfluidos. Esta tecnologia foi estabelecida para alguns tipos de hidrogéis, mas requer adaptação técnica para ser aplicada a outros hidrogéis, restringindo sua versatilidade. Portanto, a maioria dos estudos destinados a desenvolver organoides epiteliais dependem da incorporação de células epiteliais em um granel de hidrogel. Nesses métodos, a alta heterogeneidade da estruturação em gel e distribuição celular dentro de toda a cultura 3D é muitas vezes negligenciada. Portanto, a maioria das análises diz respeito a imagens 2D únicas, que representam apenas muito aproximadamente a distribuição dos vários objetos celulares em todo o volume 3D.
Doenças que afetam os ductos biliares, como o colangiocarcinoma, atresia biliar, cholangite esclerosante primária, entre outras, são uma das principais causas de mortalidade e morbidade. Com exceção do transplante de fígado, não há tratamentos eficazes para essas condições13. Os esforços para investigar a formação de dutos biliares, as causas da doença e a progressão permitirão o desenvolvimento de novas terapias14.
Foram desenvolvidos modelos organotipicos biliares de cistos, esferoides ou estruturas semelhantes a tubos utilizando linhas celulares de cholangiocitos normais ou derivadas do paciente, diferenciadas ou progenitoras,15,16,17,18,19,20. Vários estudos têm polarização de colangiocito recapitulado, expressão de marcadores de cholangiocito, presença de cílios, collangiocitos secretos e capacidade reabsortiva, e formação e obstrução de lúmen; todas elas representam características importantes do fenótipo de colangiocito, morfologia e função15,17,19. Outros relataram a manutenção de organoides biliar derivados do paciente por longos períodos detempo 20. Recentemente, investigamos o papel das pistas bioquímicas e biofísicas sobre cistos biliares organogênese21. Importante ressaltar que a patogênese da atresia biliar foi estudada em esferoides biliares e tubos7,22. Além disso, características-chave da colangite esclerosante primária, como senescência de colangiocito, secreção de citocinas pró-inflamatórias, bem como o recrutamento de macrófagos foram estudados com sucesso usando esferoides biliares15,20. No entanto, modelos quantitativos in vitro in vitro 3D que modulam fisiologicamente fenótipo de collangiocito, fisiologia e microambiente onde essas questões podem ser abordadas ainda são necessários. Além disso, apenas poucas publicações relataram eficiência de formação de cisto21,23. Este é um ponto importante a se estabelecer, particularmente ao investigar organogênese, causa da doença e correlação de respostas medicamentosas com função de cholangiocito e polarização. Além disso, com diferenças no andaime/matriz utilizadas do protocolo ao protocolo, é difícil comparar entre sistemas. Para resolver essas questões, propomos um método quantitativo, confiável e universal para gerar cistos biliares imitando a formação de lúmen, a polarização do cholangiocyte e a função secreta do cholangiocito. É importante ressaltar que apresentamos uma análise sistemática realizada ao longo do eixo Z ao longo do gel 3D ao avaliar ao longo do tempo, eficiência de formação de cisto, tamanho, viabilidade, polarização e funcionalidade. Além disso, utilizamos um hidrogel natural e collangiocitos normais de ratos (NRC)s, como exemplo para o protocolo, mas outros hidrogéis naturais ou sintéticos, bem como células epiteliais poderiam ser usados para a formação de estruturas císticas 3D.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">10 &#181;l- Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000020</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">100 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1000 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1X PBS</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">14190-094</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">200 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">T5516</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetic acid</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">VWR</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20104-298</td>
			<td>0.02N final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 10 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707439</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 1000 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707404</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 200 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707430</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Antibiotic Antimicotic Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A5955</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">13028-014</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 30 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine serum albumin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A2153</td>
			<td style="width:261px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11905-031</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Collagen high concentration, rat tail</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">354249</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Dexamethasone</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">D4902</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.393 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">DMEM F12</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">21331-020</td>
			<td style="width:261px;">NRC complete medium final concentration = 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">PA5-32178</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:408px;">Eclipse TE300 inverted microscope</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Ethanolamine</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">E9508</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.32 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal calf serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">10270-106</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">F6057</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Formaldehyde 16% (W/V)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">28906</td>
			<td>4% (W/V)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Goat serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">16210-064</td>
			<td style="width:261px;">1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:408px;">Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td>
			<td style="width:180px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Hoechst 33258</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">B1155</td>
			<td style="width:261px;">5 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A32733</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">51300-044</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25030-024</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">356231</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">4:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements software version 4.50.00</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>image acquisition and display</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11140-035</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&#8734;/1.2 WD 15.2)</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Propidium Iodide (PI)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P4170</td>
			<td>20 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Rhodamine Phalloidin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">R415</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">16.2 nM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sir-Actin / Verapamil kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Spirochrome</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">SC001</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">10 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">17075-029</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile cell strainer 40 &#181;m (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811E</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811D</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11926955</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">7200886</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">553913</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sucrose</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">S0389</td>
			<td>5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="24" style="height:24px;width:408px;">Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">353108</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Triton X-100</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>5:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25300-054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Tween-20</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P1379</td>
			<td>5:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Vitamin (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11120-037</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">&#956;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Clinisciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">80826</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts

Cholangiocytes, as células epiteliais que alinham os dutos biliares no fígado, supervisionam a formação e modificação da bile. Nos últimos vinte anos, no contexto das doenças hepáticas, surgiram modelos tridimensionais (3D) baseados em cholangiocitos, como cistos, esferoides ou estruturas semelhantes a tubos para imitar topologia tecidual para organogênese, modelagem de doenças e estudos de rastreamento de medicamentos. Essas estruturas foram obtidas principalmente pela incorporação de cholangiocitos em um hidrogel. O objetivo principal foi estudar a auto-organização abordando a polaridade epitelial, propriedades funcionais e morfológicas. No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na eficiência da formação de cistos. Quando este é o caso, a eficiência é muitas vezes quantificada a partir de imagens de um único plano. Ensaios funcionais e análises estruturais são realizados sem representar a potencial heterogeneidade da distribuição de cisto surgida de heterogeneidades de polimerização de hidrogel e efeitos colaterais. Portanto, a análise quantitativa, quando feita, não pode ser utilizada para comparação de um artigo com outro. Além disso, essa metodologia não permite comparações do potencial de crescimento 3D de diferentes matrizes e tipos de células. Além disso, não há menção à solução experimental de problemas para cistos imunossínetos. Neste artigo, fornecemos um método confiável e universal para mostrar que a distribuição celular inicial está relacionada à distribuição vertical heterogênea da formação de cisto. As células de colangiocitos embutidas em hidrogel são seguidas com a análise de pilhas de Z ao longo da profundidade do hidrogel ao longo do tempo de 10 dias. Com este método, obtém-se uma cinética robusta da eficiência e crescimento da formação de cistos. Também apresentamos métodos para avaliar a polaridade do cisto e a função secreta. Finalmente, dicas adicionais para otimizar protocolos de imunossuagem são fornecidas a fim de limitar o colapso do cisto para imagens. Essa abordagem pode ser aplicada a outros estudos de cultura celular 3D, abrindo assim as possibilidades de comparar um sistema com outro.

Formação e caracterização de cistos Os sistemas de cultura celular 3D são uma importante ferramenta para estudar organogênese e modelagem de doenças25. Infelizmente, a maioria desses métodos são qualitativos ou utilizam quantificação interna realizada em um único plano, comparando o número de cistos versus não cistos, em volumes variáveis e muitas vezes não especificados, impedindo qualquer comparação em termos de eficiência de formação de cisto entre os di...

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Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Sistemas celulares tridimensionais (3D) são modelos relevantes para investigar organogênese. Propõe-se um método à base de hidrogel para a produção de cistos biliares e sua caracterização. Este protocolo desvenda as barreiras da caracterização 3D, com um método simples e confiável para avaliar a eficiência, tamanhos e testar sua funcionalidade.

Geração e Caracterização Quantitativa de Cistos Epiteliais Biliar funcionais e polarizados

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Este é o primeiro protocolo para geração de cistos biliares, fornecendo uma análise sistemática que permite a avaliação da formação de cisto, eficiência e tamanho ao longo do tempo. Este método permite a avaliação quantitativa da formação de cisto epitelial, e permite avaliar esse processo em função do tipo de células epiteliais ou hidrogel. Uma vez que as opções terapêuticas para distúrbios biliares são limitadas, este protocolo abre as portas para a padronização de estudos medicamentosos, identificação de alvos terapêuticos normais e compreensão de mecanismos de doença.O método simples permite que questões importantes sobre os mecanismos de novas informações dentro do campo de bioengenharia de estruturas tubulares sejam abordadas. Antes de iniciar um experimento, descongele uma solução de hidrogel apropriada a quatro graus Celsius e pontas de pipeta pré-frias e um deslizamento de câmara de oito poços a menos 20 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, coloque o hidrogel e um escorregador de oito câmaras de poços no gelo e adicione o volume apropriado de hidrogel ao frio normal de cholangiocito de rato completo para obter 500 microliters de solução de 40% de hidrogel.Em seguida, use as pontas de pipeta fria para adicionar 50 microliters de solução de hidrogel ao centro de cada poço do escorregador da câmara e use uma ponta de pipeta para espalhar a solução sobre toda a superfície do fundo do poço o mais uniformemente possível sem bolhas. Para preparar as células para o experimento, enquanto o hidrogel está polimerizando, lave as células de uma cultura de collangiocito de rato normal 70% confluente com PBS pré-aquecido e incuba as células com cinco mililitros de PBS pré-aquecidos frescos por 20 minutos na incubadora de cultura celular. No final da incubação, substitua o PBS por um mililitro de Trypsin-EDTA pré-aquecido e devolva o frasco à incubadora de cultura celular por cinco a 10 minutos.Quando as células se separarem, neutralize a reação com quatro mililitros de meio de colangiocito de rato normal pré-aquecido e transfira as células para um tubo de 15 mililitros para centrifugação. Em seguida, suspenda novamente a pelota em cinco mililitros de meio pré-aquecido e filtre as células através de um coador de 40 mícrons em um tubo de 50 mililitros para contar. Para gerar cistos, adicione o volume adequado de hidrogel ao meio de collangiocyte normal completo a frio para obter 1.600 microliters de uma solução de 80% de hidrogel no gelo e diluir as células a cinco vezes 10 a 5 células por mililitro de concentração média de collangiocito de rato normal frio em 1.600 microlitras de médio.Misture imediatamente as soluções celulares e células hidrogel e adicione 400 microliters de células a cada poço do slide de câmara revestido de hidrogel, tomando cuidado para evitar bolhas. Para garantir a aquisição de resultados reprodutíveis e significativos, certifique-se de manusear o hidrogel cuidadosamente e misturar completamente a solução inicial de hidrogênio celular para obter uma solução homogênea. Quando todas as células tiverem sido semeadas, coloque o slide na incubadora de cultura celular.Após dois dias na cultura, remova 250 microliters do meio de um canto de cada poço, tomando cuidado para não limpar o hidrogel, e substituir lentamente o supernanato descartado por 250 microliters de meio de cultura fresca. Para imagens de cisto, no dia apropriado da cultura, selecione o objetivo de 10 X em um microscópio de contraste de fase equipado com software de aquisição de imagem, ligue a lâmpada branca e selecione a opção de imagem brightfield. Selecione play para ligar a câmera e foque em um campo de cistos.Defina o tempo de exposição e abra a janela da pasta de captura automática para permitir a salvação automática das imagens. Abra a janela da série Z de captura, reinicie a posição padrão e use o parafuso Z para definir as planícies superior e inferior da pilha Z, ajustando a etapa Z dependendo do objetivo e do nível de resolução. Em seguida, clique em executar agora para iniciar a aquisição.Depois de imagens, abra a pilha Z em Fiji. Para duplicar a pilha, clique na imagem, duplicada e duplicada pilha. Para criar uma projeção de intensidade mínima a partir da pilha duplicada, sob o menu de imagem, selecione pilhas e projeto Z.Selecione a intensidade mínima para o tipo de projeção e clique bem. Para subtrair o fundo da projeção, sob o menu do processo, selecione o fundo subtraído e selecione 500 pixels de raio de bola rolando e fundo de luz para tornar os cistos mais contrastados do que o fundo. Para medir o diâmetro aproximado do cisto, amplie o cisto direcionado, selecione a ferramenta de linha reta e pressione o botão T no teclado.Desenhe uma linha através do diâmetro de cada cisto na projeção final. A próxima região de interesse criada para cada cisto será adicionada ao gestor da região de interesse. Quando todos os cistos tiverem sido contados, clique na janela Z-stack para selecioná-lo e clique em mostrar tudo para ver os cistos contados.Mova o cursor ao longo da pilha Z para verificar se todos os cistos foram contados em cada imagem, adicionando novos cistos à região do gerente de interesse, conforme necessário. Quando todos os cistos tiverem sido contados, selecione a região de interesse definida e clique mais e salve para salvar os dados. Para determinar o tamanho de cada cisto, com as regiões de interesses ainda selecionadas, clique em medir.Uma janela listando cada cisto e seu tamanho estimado aparecerá. Em seguida, salve os dados no formato CSV. Como demonstrado, o registro do número de cistos e seus respectivos tamanhos ao longo do tempo permite a análise da evolução da formação e crescimento de cistos.A viabilidade da população celular inicial e dos cistos de 10 dias de idade podem ser avaliadas por coloração viva/morta. As células mortas representam menos de 3% da população celular no dia 10 e estão localizadas principalmente fora do cisto como células isoladas ou como parte de pequenos agregados, embora alguns detritos celulares necrosados sejam observados dentro de alguns cistos grandes. A incubação com diacetato fluoresceína e Hoechst permite a avaliação da formação e secreção de Fluoresceína do basal ao espaço luminal apical.Notavelmente, a secreção de Fluoresceína é inibida pelo pré-tratamento com um inibidor resistente a vários medicamentos, indicando que o acúmulo de fluoresceína fluorescente dentro do lúmen é devido à secreção através do transportador resistente a vários medicamentos e não ao vazamento do espaço intercelular. A coloração para a expressão de E-cadherin revela que os cholangiocitos de ratos normais mantêm seu fenótipo epitelial no hidrogel por pelo menos 10 dias. Ao preparar os cistos para avaliação da imunofluorescência, manter a albumina de soro bovino em 0,1% ou menos durante a saturação é fundamental para manter a integridade do cisto, pois concentrações mais elevadas resultam em retração de cisto e colapso do lúmen.Hidrogel durante a noite, descongelamento, ponta de pipeta e gravação de slides de câmara, trabalhando no gelo e espalhando a mistura de hidrogel celular homogêneo uniformemente no escorregador de câmara cultivado são todos fundamentais para o sucesso experimental. Este método pode ser usado para gerar cistos de outras células epiteliais ou hidrogéis, permitindo comparações para melhor compreensão da polarização epitelial. Este método quantitativo pode ser usado para testar os efeitos de drogas ou mutações genéticas na função biliar e organogênese.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Geração de Alinhados tecido funcional do miocárdio através de impressão microcontact

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Bioengenharia

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Induzida por drogas Sensibilização de adenililciclase: Racionalização Ensaio e miniaturização para pequenas moléculas e siRNA Triagem Applications

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Construção e Caracterização de um biorreator Fold Novel Vocal

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Fabricação e caracterização de um Sistema Eletrônico Conformal-pele como para a gestão quantitativa, Ferida Cutânea

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

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Melhorar 2D e 3D Pele<em&gt; In Vitro</em&gt; Models Usando Macromolecular Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

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Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Geração escalável de organoides cerebelares maduros de células-tronco pluripotentes humanas e caracterização por imunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Geração de Condições Ambientais Dinâmicas usando um dispositivo microfluido de alto rendimento

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...