Name: generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts
Uploaded: 2020-05-16T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Biz Dr Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, Amerika Birleşik Devletleri), kim nazilikle NRC hücre hattı sağlanan teşekkür ederiz.
Bu çalışma hem iLite RHU programı (grant ANR-16-RHUS-0005) hem de DHU Hepatinov'un mali desteğini almıştır.
Isabelle Garcin ve Réseau d'Imagerie Cellulaire Paris Saclay'e görüntüleme konusundaki desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

1. Kistlerin üretimi
NOT: Jelleşme hücrelerin katıştırılmasına izin veriyorsa, bu protokol her türlü hidrojel ile yapılabilir.
<ol><li>Hidrojel kaplama NOT: Hazne saklıdoğru hidrojel kaplama kuyunun alt kısmında 2D hücre tabakaları oluşumunu önlemek için kritik bir adımdır, sonraki kist görüntüleme müdahale ve kist oluşumu verimliliği hesaplama sını bozabilir.<ol>
<li>Jel çözeltisinin homojenliğini sağlamak için hidrojeli bir gecede 4 °C'de (O/N) eritin...

<ol>
	<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Cell+Culture+Systems+and+Their+Applications+in+Drug+Discovery+and+Cell-Based+Biosensors.">Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors.</a> ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li><li>Mart&#237;n-Belmonte, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-polarity+dynamics+controls+the+mechanism+of+lumen+formation+in+epithelial+morphogenesis.">Cell-polarity dynamics controls the mechanism of lumen formation in epithelial morphogenesis.</a> Current Biology. 18, 507-513 (2008).</li><li>Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphogenesis+and+oncogenesis+of+MCF-10A+mammary+epithelial+acini+grown+in+three-dimensional+basement+membrane+cultures.">Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures.</a> Methods. 30 (3), 256-268 (2003).</li><li>Artym, V. V., Matsumoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Cells+in+Three-Dimensional+Collagen+Matrix.">Imaging Cells in Three-Dimensional Collagen Matrix.</a> Current Procotols in Cell Biology. , (2010).</li><li>Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bisell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+with+basement+membrane+serves+to+rapidly+distinguish+growth+and+differentiation+pattern+of+normal+and+malignant+human+breast+epithelial+cells.">Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 9064-9068 (1992).</li><li>Kim, S. P., Lee, D. H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hepatocyte+spheroids+immobilization+technique+using+alternative+encapsulation+method.">Development of hepatocyte spheroids immobilization technique using alternative encapsulation method.</a> Biotechnology and Bioprocess Engineering. 3, 96-102 (1998).</li><li>Lorent, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+plant+isoflavonoid+that+causes+biliary+atresia.">Identification of a plant isoflavonoid that causes biliary atresia.</a> Science Translational Medicine. 7 (286), 67 (2015).</li><li>Nowak, M., Freudenberga, U., Tsurkana, M. V., Wernera, C., Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+GAG-matrices+to+promote+mammary+epithelial+morphogenesis+in+vitro.">Modular GAG-matrices to promote mammary epithelial morphogenesis in vitro.</a> Biomaterials. 112, 20-30 (2017).</li><li>Miroshnikova, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+Strategies+to+Recapitulate+Epithelial+Morphogenesis+Within+Synthetic+Three-Dimensional+Extracellular+Matrix+With+Tunable+Mechanical+Properties.">Engineering Strategies to Recapitulate Epithelial Morphogenesis Within Synthetic Three-Dimensional Extracellular Matrix With Tunable Mechanical Properties.</a> Physical Biology. 8 (2), 026013 (2011).</li><li>Ozdemir, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+Hydrogel+Properties+to+Promote+the+Assembly+of+Salivary+Gland+Spheroids+in+3D.">Tuning Hydrogel Properties to Promote the Assembly of Salivary Gland Spheroids in 3D.</a> ACS Biomaterials Science &amp; Engineering. 2 (12), 2217-2230 (2016).</li><li>Dolega, M. E., Abeille, F., Picollet-D'hahan, N., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+3D+culture+in+Matrigel+microbeads+to+analyze+clonal+acinar+development.">Controlled 3D culture in Matrigel microbeads to analyze clonal acinar development.</a> Biomaterials. 52, 347-357 (2015).</li><li>Laperrousaz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+transfection+of+clonal+organoids+in+Matrigel+microbeads:+a+promising+approach+toward+organoid-based+genetic+screens.">Direct transfection of clonal organoids in Matrigel microbeads: a promising approach toward organoid-based genetic screens.</a> Nucleic Acids Research. 46 (12), 70 (2018).</li><li>Lazaridis, K. N., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholangiopathies.">The Cholangiopathies.</a> Mayo Clinic Proceedings. 90 (6), 791-800 (2015).</li><li>Tam, P. K., Yiua, R. S., Lendahl, U., Andersson, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiopathies+-+Towards+a+molecular+understanding.">Cholangiopathies - Towards a molecular understanding.</a> EBioMedicine. 35, 381-393 (2018).</li><li>Loarca, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+cholangioids+from+normal+and+diseased+human+cholangiocytes+as+an+in+vitro+model+to+study+primary+sclerosing+cholangitis.">Development and characterization of cholangioids from normal and diseased human cholangiocytes as an in vitro model to study primary sclerosing cholangitis.</a> Laboratory Investigation. 97, 1385-1396 (2017).</li><li>De Assuncao, T. M., Jalan-Sakrikar, N., Huebert, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+medicine+and+the+biliary+tree.">Regenerative medicine and the biliary tree.</a> Seminars in Liver Disease. 37, 17-27 (2017).</li><li>Dianat, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+cholangiocyte-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+and+HepaRG+cells.">Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells.</a> Hepatology. 60, 700-714 (2014).</li><li>Masyuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocyte+autophagy+contributes+to+hepatic+cystogenesis+in+polycystic+liver+disease+and+represents+a+potential+therapeutic+target.">Cholangiocyte autophagy contributes to hepatic cystogenesis in polycystic liver disease and represents a potential therapeutic target.</a> Hepatology. 67 (3), 1088-1108 (2018).</li><li>Sampaziotis, F., Cardoso, M., Madrigal, P., Bertero, A., Saeb-Parsy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholangiocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+drug+validation.">Cholangiocytes derived from human induced pluripotent stem cells for disease modeling and drug validation.</a> Nature Biotechnology. 33 (8), 845-852 (2015).</li><li>Soroka, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile-Derived+Organoids+From+Patients+With+Primary+Sclerosing+Cholangitis+Recapitulate+Their+Inflammatory+Immune+Profile.">Bile-Derived Organoids From Patients With Primary Sclerosing Cholangitis Recapitulate Their Inflammatory Immune Profile.</a> Hepatology. 70 (3), 871-882 (2019).</li><li>Funfak, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+Control+of+Bile+Duct+Epithelial+Morphogenesis+in+Natural+and+Synthetic+Scaffolds.">Biophysical Control of Bile Duct Epithelial Morphogenesis in Natural and Synthetic Scaffolds.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7 (417), 417 (2019).</li><li>Du, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+Duct-on-a-Chip+With+Organ-Level+Functions.">Bile Duct-on-a-Chip With Organ-Level Functions.</a> Hepatology. , (2019).</li><li>Shiota, J. M., Mohamad Zaki, N. H., Merchant, J. L., Samuelson, L. C., Razumilava, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Organoids+from+Mouse+Extrahepatic+Bile+Ducts.">Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts.</a> Journal of Visualized Experiments. (146), e59544 (2019).</li><li>Bircsak, K. M., Richardson, J. R., Aleksunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Human+MDR1+and+BCRP+Transporter+ATPase+Activity+by+Organochlorine+and+Pyrethroid+Insecticides.">Inhibition of Human MDR1 and BCRP Transporter ATPase Activity by Organochlorine and Pyrethroid Insecticides.</a> Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 27 (2), 157-164 (2013).</li><li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., Blitterswijk, C., Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Kanade, S., Nataraj, G., Ubale, M., Mehta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescein+Diacetate+Vital+Staining+for+Detecting+Viability+of+Acid-Fast+Bacilli+in+Patients+on+Antituberculosis+Treatment.">Fluorescein Diacetate Vital Staining for Detecting Viability of Acid-Fast Bacilli in Patients on Antituberculosis Treatment.</a> International Journal of Mycobacteriology. 5 (3), 294-298 (2016).</li><li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Annexin+V/Propidium+Iodide+Apoptosis+Assay+For+Accurate+Assessment+of+Cell+Death.">Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), e2597 (2011).</li><li>Tabibian, J. H., Masyuk, A., Masyuk, T. V., O'Hara, S. P., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+of+Cholangiocytes.">Physiology of Cholangiocytes.</a> Comprehensive Physiology. 3 (1), (2013).</li><li>Spirl&#236;, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+polarity+of+Na+/H++and+Cl-/HCO3-+exchangers+in+a+rat+cholangiocyte+cell+line.">Functional polarity of Na+/H+ and Cl-/HCO3- exchangers in a rat cholangiocyte cell line.</a> American Journal Physiology. 275, 1236-1245 (1998).</li></ol>

Organogenez ve 3D hücresel yapıların bakım çalışması için, çeşitli dokular modellenmiştir, farklı hücresel kökenleri kullanarak ama aynı zamanda sentetik hidrojeller de dahil olmak üzere ekstra-hücresel matrisfarklı türleri8,9,10,21. Ancak, organoidoluşumu veya işlevselliği açısından yöntemler arasında karşılaştırmalar sağlar 3D kantitatif analiz eksikliği nede...

Son otuz yılda, in vitro araştırma alanı 3D kültür sistemlerine doğru ilerlemiştir. Bir iskele/matrisin varlığında veya yokluğunda, bir damla, ajitasyonda, mikroakışkan cihazlarda veya yüzen 1'de, 3Boyutlu olarak hücreleri küresel olarak veyaagrega olarak bir dizi şekilde kültüre alma için bir dizi protokol ortaya çıkmıştır. 3D kültür yöntemlerinin kullanımı, özellikle kistler veya acini adı verilen 3Boyutlu yapılarda kendi kendini organize ettiği gösterilen epitel hücreleri başta olmak üzere 2 boyutlu (2D) kültürlere göre avantajlarını kanıtlamıştır. Bu durumda, hücreler bir lümen çevreleyen bir monolayer oluşturur, hücrelerin geliştirilmiş fizyolojik özel fonksiyonları ile tam epitel fenotip eldenerede 2.
Doğal matrislerde bu epitel organoidlerin oluşturulması için yöntemlerin geliştirilmesine çok sayıda çalışma katkıda bulunmuştur. Bu vivo hücre-hücre ve hücre-mikroçevre etkileşimleri recapitulate izin verdi, kurulması ve epitel fenotip istikrar elde etmekiçin 3,4,5,6,7. Son zamanlarda, ve özellikle nakledilebilir organoidler geliştirmek ve epitel programı düzenlemek için mikroortamın gereksinimini deşifre amacı ile, sentetik hidrojeller epitel acini oluşumunu artırmak için geliştirilmiştir8,9,10. Ne yazık ki, bu çalışmalar nitel veri raporu, ya da 2D düzlemde olmayan kistler üzerinde kistlerin oranı gibi iç referanslar kullanarak mevcut hesaplama yöntemleri8,9,10. Bu, epitel organoidlerinin verimlilik, stabilite veya morfolojik ve fizyolojik karakterizasyonu açısından farklı çalışmalar arasında herhangi bir karşılaştırma yıkmaktadır.
Mikroakışkan cihazlar kullanarak boncuklarda epitel hücrelerinin mikrokapsülasyonu daha gerçekçi nicel ve karşılaştırmalı sonuçlar almıştır. Bu teknoloji kullanılarak, çeşitli hücre tiplerinden organoidler oluşmuş ve farklı 3D hücresel yapılar arasında morfolojiye dayalı farklılaşmış11,12. Ancak, bu teknoloji ile çalışmak kolay değildir ve mikroakışkan cihazlar üretmek için temiz oda kullanımını gerektirir. Bu teknoloji hidrojeller birkaç tür için kurulmuştur ama teknik adaptasyon diğer hidrojeller için uygulanacak gerektirir, onun çok yönlülük kısıtlayan. Bu nedenle, epitel organoidler geliştirmek için amaçlanan çoğu çalışma bir hidrojel toplu epitel hücrelerinin katıştırma güveniyor. Bu yöntemlerde, tüm 3D kültür içinde jel strüktürasyonu ve hücre dağılımı yüksek heterojenlik genellikle ihmal edilir. Bu nedenle, analizlerin çoğu tek 2B görüntülerle ilgilidir, bu da yalnızca kabaca tüm 3B hacimdeki çeşitli hücresel nesnelerin dağılımını temsil eder.
Kolanjiokarsinom, safra atrezisi, primer sklerozan kolanjit gibi safra kanallarını etkileyen hastalıklar mortalite ve morbiditenin başlıca nedenidir. Karaciğer nakli dışında bu durumlar için etkili bir tedavi yoktur13. Safra yolu oluşumunu, hastalık nedenlerini ve ilerlemesini araştırma çabaları yeni tedavilerin geliştirilmesine olanak sağlayacaktır14.
Normal veya hasta kaynaklı, diferansiye veya ata türevi kolanjiyosit hücre hatları kullanan kist, küresel oidler veya tüp benzeri yapıların biliyer organotipik modelleri geliştirilmiştir15,16,17,18,19,20. Çeşitli çalışmalar da kolanjiyofit polaritere, kolanjisit belirteçlerinin ekspresyonu, silya varlığı, kolanjiyosit salgıve reabsorptif yetenek, ve lümen oluşumu ve obstrüksiyonu; bunların hepsi kolanjiyosit fenotip, morfoloji ve fonksiyon15,17,19önemli özelliklerini temsil eder. Diğerleri uzun süre hasta kaynaklı safra organoidleri bakım bildirdin20. Son zamanlarda, biz biliyer kistler organogenez biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları rolünüaraştırdı21. Daha da önemlisi, biliyer atrezisi patogenezi safra spheroidleri ve tüpler7,22çalışıldı. Ayrıca, kolanjiyosit senescence, pro-inflamatuar sitokinlerin salgılanması gibi birincil sklerozan kolanjitin temel özellikleri, yanı sıra makrofaj işe başarıyla safra spheroids kullanılarak çalışılmıştır15,20. Ancak, bu soruların ele alınabileceği kolanjiyosit fenotip, fizyoloji ve mikroçevreyi fizyolojik olarak modüle eden in vitro 3D kantitatif modellere hala ihtiyaç duyulmaktadır. Ayrıca, sadece birkaç yayın kist oluşumu verimliliği21,23 bildirdin. Bu, özellikle organogenez, hastalık nedeni ve kolanjiyosit fonksiyonu ve polarizasyon ile ilaç yanıtlarının korelasyonunu araştırırken, saptanması gereken önemli bir noktadır. Buna ek olarak, protokolden protokole kadar kullanılan iskele/matris farklılıkları ile sistemler arasında karşılaştırmak zordur. Bu sorunları çözmek için lümen oluşumunu, kolanjisit polarizasyonunu ve kolanjiyit salgı işlevini taklit eden biliyer kistler oluşturmak için nicel, güvenilir ve evrensel bir yöntem öneriyoruz. Daha da önemlisi, zaman içinde değerlendirilirken 3D jel boyunca Z-ekseni boyunca yapılan sistematik bir analiz, kist oluşumu verimliliği, boyut, canlılık, polarizasyon ve işlevsellik sayılmaktadır. Ayrıca, doğal bir hidrojel ve normal sıçan kolanjiyositler (NRC) s, protokol için bir örnek olarak kullanılan, ancak diğer doğal veya sentetik hidrojeller, yanı sıra epitel hücreleri 3D kistik yapıların oluşumu için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1005px;" width="1005">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">10 &#181;l- Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000020</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">100 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1000 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">1X PBS</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">14190-094</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">200 &#181;l - Pipette Eppendorf Research Plus</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">3120000054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">3,3&#8242;,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">T5516</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 3.4 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Acetic acid</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">VWR</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">20104-298</td>
			<td>0.02N final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 10 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707439</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 1000 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707404</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Aerosol barrier pipettes tips 200 &#181;l (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">2707430</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Antibiotic Antimicotic Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A5955</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine pituitary extract</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">13028-014</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 30 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Bovine serum albumin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A2153</td>
			<td style="width:261px;">1:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Chemically Defined Lipid Concentrate (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11905-031</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Collagen high concentration, rat tail</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">354249</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">50 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Dexamethasone</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">D4902</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.393 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">DMEM F12</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">21331-020</td>
			<td style="width:261px;">NRC complete medium final concentration = 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">E-cadherin Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">PA5-32178</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:400 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:408px;">Eclipse TE300 inverted microscope</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Ethanolamine</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">E9508</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 0.32 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fetal calf serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">10270-106</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Fluoroshield with DAPI (Mounting medium)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">F6057</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Formaldehyde 16% (W/V)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">28906</td>
			<td>4% (W/V)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Goat serum</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">16210-064</td>
			<td style="width:261px;">1:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:408px;">Hamamatsu camera (Digital camera C11440 ORCA - flash 4.OLT)</td>
			<td style="width:180px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Hoechst 33258</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">B1155</td>
			<td style="width:261px;">5 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td dir="LTR" height="42" style="height:42px;width:408px;">IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Goat anti-Rabbit, Alexa Fluor Plus 647</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">A32733</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Open source image processing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Insulin-Transferrin-Selenium (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">51300-044</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">L-Glutamine (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25030-024</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Matrigel GFR (stock concentration 9.7 mg/mL)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">356231</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">4:10 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NIS Elements software version 4.50.00</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>image acquisition and display</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Non-Essential-Amino-Acids-Solution (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11140-035</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:408px;">Objective Plan Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&#8734;/1.2 WD 15.2)</td>
			<td style="width:180px;">Nikon</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Propidium Iodide (PI)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P4170</td>
			<td>20 &#181;g/mL final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Rhodamine Phalloidin</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">R415</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">16.2 nM final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sir-Actin / Verapamil kit</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Spirochrome</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">SC001</td>
			<td dir="LTR" style="width:261px;">10 &#181;M final concentration</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">17075-029</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile cell strainer 40 &#181;m (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">22363547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 10 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811E</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile pipettes 5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">1367811D</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 1.5 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11926955</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 15 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">7200886</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sterile tubes 50 mL (Fisherbrand)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">553913</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Sucrose</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">S0389</td>
			<td>5:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td dir="LTR" height="24" style="height:24px;width:408px;">Tissue culture treated flask 25cm2 (Falcon)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">353108</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Triton X-100</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td>5:1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Trypsin-EDTA (0.05%) phenol red</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">25300-054</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Tween-20</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">P1379</td>
			<td>5:10000 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">Vitamin (100X)</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">11120-037</td>
			<td>NRC complete medium final concentration = 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td dir="LTR" height="21" style="height:21px;width:408px;">&#956;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi</td>
			<td dir="LTR" style="width:180px;">Clinisciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:156px;">80826</td>
			<td style="width:261px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative characterization of functional and polarized biliary epithelial cysts

Kolanjiyositler, karaciğerdeki safra kanallarını oluşturan epitel hücreleri, safra oluşumunu ve modifikasyonu denetler. Son yirmi yılda, karaciğer hastalıkları bağlamında, kolanjiyositlere dayalı 3 boyutlu (3D) modeller, organogenez, hastalık modellemesi ve ilaç tarama çalışmaları için doku topolojisini taklit etmek için kistler, küreseloidler veya tüp benzeri yapılar gibi ortaya çıkmıştır. Bu yapılar esas olarak bir hidrojel kolanjiyositkitler katıştırma ile elde edilmiştir. Temel amaç epitelyal polarite, fonksiyonel ve morfolojik özellikleri ele alarak kendi kendini örgütleme çalışması oldu. Ancak, çok az çalışma kist oluşumu verimliliği üzerinde duruluyor. Bu durumda, verimlilik genellikle tek bir düzlemin görüntülerinden ölçülür. Hidrojel polimerizasyon heterojenitelerinden ve yan etkilerinden kaynaklanan kist dağılımının potansiyel heterojenliğini temsil etmeden fonksiyonel tahliller ve yapısal analizler yapılmaktadır. Bu nedenle, nicel çözümleme yapıldığında, bir makaleden diğerine karşılaştırma için kullanılamaz. Ayrıca, bu metodoloji farklı matrisler ve hücre türlerinin 3D büyüme potansiyelinin karşılaştırmalarına izin vermez. Ayrıca, immünboyama kistler için deneysel sorun giderme söz yoktur. Bu makalede, ilk hücre dağılımının kist oluşumunun heterojen dikey dağılımı ile ilişkili olduğunu göstermek için güvenilir ve evrensel bir yöntem sayılmiyoruz. Hidrojel gömülü kolanjiyosit hücreleri 10 gün boyunca hidrojel derinliği boyunca Z-yığınları analizi ile takip edilir. Bu yöntemle kist oluşumunda verimlilik ve büyüme sağlam bir kinetik elde edilir. Ayrıca kist polaritesini ve salgı fonksiyonunu değerlendirmek için yöntemler saklıyız. Son olarak, görüntüleme için kist çöküşünü sınırlamak için immünboyama protokollerini optimize etmek için ek ipuçları sağlanmıştır. Bu yaklaşım diğer 3D hücre kültürü çalışmalarına uygulanabilir, böylece bir sistemi diğer sistemle karşılaştırma olanakları açılabilir.

Kistlerin oluşumu ve karakterizasyonu 3D hücre kültür sistemleri organogenez ve hastalık modelleme25çalışma için önemli bir araçtır. Ne yazık ki, bu yöntemlerin çoğu nitel veya çeşitli çalışmalar arasında kist oluşumu verimliliği açısından herhangi bir karşılaştırma önleme, değişken ve genellikle belirtilmemiş hacimlerde, kistler ve non-kistler karşı kistlerin sayısı karşılaştırarak tek bir düzlemde yapılan iç nicelleştirme kullan?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts at JoVE.com

Generation and Quantitative Characterization of Functional and Polarized Biliary Epithelial Cysts

Üç boyutlu (3D) hücresel sistemler organogenezin araştırılması için uygun modellerdir. Safra kist üretimi ve karakterizasyonu için hidrojel bazlı bir yöntem önerilmektedir. Bu protokol, kist oluşumu verimliliğini, boyutlarını değerlendirmek ve işlevselliklerini test etmek için basit ve güvenilir bir yöntemle 3B karakterizasyonunun engellerini ortadan kaldırmaktadır.

Fonksiyonel ve Polarize Safra Epitel Kistlerinin Oluşumu ve Kantitatif Karakterizasyonu

Cholangiocytes, the epithelial cells that line up the bile ducts in the liver, oversee bile formation and modification. In the last twenty years, in the ...

Bu safra kistleri üreten ilk protokol, kist oluşumu, verimlilik ve zaman içinde boyut değerlendirilmesi sağlayan sistematik bir analiz sağlayan. Bu yöntem epitel kist oluşumunun kantitatif değerlendirmesini sağlar ve epitel hücreleri veya hidrojel tipinin bir fonksiyonu olarak bu sürecin değerlendirilmesini mümkün kılar. Safra bozuklukları için tedavi seçenekleri sınırlı olduğundan, bu protokol ilaç çalışmalarının standartlaştırılması, normal terapötik hedeflerin belirlenmesi ve hastalık mekanizmalarının anlaşılması için kapı açmaktadır.Basit yöntem, tübüler yapıların biyomühendisliği alanındaki yeni bilgi mekanizmaları ile ilgili önemli soruların ele alınmasını sağlar. Bir deneye başlamadan önce, uygun bir hidrojel çözeltisi dört santigrat derece ve önceden soğutulmuş pipet uçları ve eksi 20 santigrat derece bir gecede sekiz kuyu odası slayt eritin. Ertesi sabah, buz üzerinde hidrojel ve sekiz iyi oda slayt yerleştirin ve% 40 hidrojel çözeltisi 500 mikrolitre elde etmek için soğuk normal sıçan kolanjiyosit tam orta hidrojel uygun hacmi ekleyin.Daha sonra oda kaydırağının her kuyunun ortasına 50 mikrolitre hidrojel çözeltisi eklemek için soğuk pipet uçlarını kullanın ve çözeltiyi kabarcıklar olmadan mümkün olduğunca iyi alt yüzeyine yaymak için bir pipet ucu kullanın. Deney için hücreleri hazırlamak için, hidrojel polimerize iken, önceden ısıtılmış PBS ile% 70 konfluent normal sıçan kolanjiyosit kültüründen hücreleri yıkayın ve hücre kültürü kuluçka 20 dakika boyunca taze önceden ısıtılmış PBS beş mililitre ile hücreleri kuluçka. Kuluçka sonunda, PBS'yi önceden ısıtılmış bir mililitre Trypsin-EDTA ile değiştirin ve şişeyi 5 ila 10 dakika hücre kültürü kuluçka makinesine geri verin.Hücreler ayrıldığında, önceden ısıtılmış tam normal sıçan kolanjiyosit orta dört mililitre ile reaksiyon nötralize ve santrifüj için 15 mililitrelik tüp hücreleri transfer. Daha sonra peleti beş mililitre önceden ısıtılmış ortamda yeniden askıya alın ve hücreleri 40 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir tüpe sintin. Kistler oluşturmak için, 1 elde etmek için soğuk tam normal sıçan kolanjiyosit orta uygun hacim ekleyin, buz üzerinde% 80 hidrojel çözeltisi 600 mikrolitre ve beş kez hücreleri seyreltmek 1, orta 1, orta soğuk tam normal sıçan cholangiocyte orta konsantrasyonu mililitre başına beş kez 10 hücreleri.Hemen hücre ve hidrojel hücre çözeltileri karıştırın ve kabarcıklar önlemek için özen, hidrojel kaplı oda slayt her kuyuya hücrelerin 400 mikrolitre ekleyin. Tekrarlanabilir ve önemli sonuçlar elde sağlamak için, hidrojeli dikkatlice işletmeyi ve homojen bir çözüm elde etmek için ilk hücre hidrojen çözeltisini iyice karıştırdığından emin olun. Tüm hücreler tohumlanmış zaman, hücre kültürü kuluçka slayt yerleştirin.Kültürde iki gün sonra, her kuyunun bir köşesinden orta 250 mikrolitre çıkarın, hidrojel dışarı floş değil dikkat, ve yavaş yavaş taze kültür orta 250 mikrolitre ile atılan supernatant değiştirin. Kist görüntüleme için, kültürün uygun gününde, görüntü edinme yazılımı ile donatılmış faz kontrast mikroskobundaki 10 X hedefini seçin, beyaz lambayı açın ve brightfield görüntüleme seçeneğini seçin. Kamerayı açmak ve kistler in bir alana odaklanmak için oynat'ı seçin.Pozlama süresini ayarlayın ve görüntülerin otomatik olarak kaydedilmesine izin vermek için otomatik yakalama klasörü penceresini açın. Yakalama Z serisi penceresini açın, varsayılan konumu sıfırlayın ve Z-yığınının üst ve alt düzlüklerini tanımlamak için Z vidasını kullanın, hedefe ve çözünürlük düzeyine bağlı olarak Z adımını ayarlayın. Sonra satın alma başlatmak için şimdi çalıştır'ı tıklatın.Görüntülemeden sonra Fiji'deki Z-yığınını açın. Yığını çoğaltmak için, görüntüyü, yinelenen yığını tıklatın ve yinelenen yığını tıklatın. Yinelenen yığından, görüntü menüsünün altında en az yoğunluklu projeksiyon oluşturmak için yığınlar ve Z projesini seçin.Projeksiyon türü için minimum yoğunluğu seçin ve tamam'ı tıklatın. Projeksiyondan arka planı çıkarmak için, işlem menüsünün altında arka planı çıkarın ve kistleri arka plandan daha zıt hale getirmek için 500 piksel yuvarlanan top yarıçapı ve ışık arka planı seçin. Yaklaşık kist çapını ölçmek için, hedeflenen kisti yakınlaştırın, düz çizgi aracını seçin ve klavyedeki T düğmesine basın.Son projeksiyon üzerinde her kistçapı boyunca bir çizgi çizin. Her kist için oluşturulan bir sonraki ilgi bölgesi, ilgi yöneticisi nin bulunduğu bölgeye eklenecektir. Tüm kistler sayıldığında, z-yığın penceresine tıklayın ve sayılan kistleri görmek için tümünü göster'i tıklatın.İmleci Z-yığını boyunca hareket ettirerek, tüm kistlerin her görüntüde sayılandı ve gerektiğinde ilgi çekici yönetici bölgesine yeni kistler ekleyerek kontrol edin. Tüm kistler sayıldığında, ilgi alanı kümesi bölgesini seçin ve daha fazla tıklatın ve verileri kaydetmek için kaydedin. Her kistin boyutunu belirlemek için, ilgi alanları hala seçiliyken, ölçü'ye tıklayın.Her kist ve tahmini boyutunu listeleyen bir pencere görüntülenir. Ardından verileri CSV formatında kaydedin. Gösterildiği gibi, zaman içinde kistlerin sayısının ve ilgili boyutlarının kaydedilmesi, kist oluşumu ve büyümesinin evriminin analizini sağlar.Başlangıç hücre popülasyonunun ve 10 günlük kistlerin canlı/ölü boyama ile canlılığı değerlendirilebilir. Ölü hücreler 10. Floresan diasetat ve Hoechst ile kuluçka bazal dan apikal luminal alana Floresan oluşumu ve salgılanması nın değerlendirilmesi sağlar.Özellikle, Floresan salgılanması çok ilaca dirençli inhibitör ile ön tedavi ile inhibe edilir, lümen içinde floresan Floresan birikimi çok ilaca dirençli taşıyıcı yoluyla salgı nedeniyle olduğunu gösteren ve hücreler arası uzaydan sızıntı değil. E-kadherin ekspresyonu için boyama normal sıçan kolanjiyositlerinin hidrojelde epitel fenotiplerini en az 10 gün süreyle koruduklarını ortaya koymaktadır. İmmünofluoresans değerlendirme için kistler hazırlanırken, doygunluk sırasında sığır serum albumin %0.1 veya daha az tutulması kist bütünlüğünün korunmasında anahtardır, çünkü yüksek konsantrasyonlar kist geri çekilmesi ve lümen çökmesine neden olur.Bir gecede hidrojel, erime, pipet ucu ve hazne slayt kaydı, buz üzerinde çalışma ve homojen hücreli hidrojel karışımının kültür odası slaytına eşit olarak yayılması deneysel başarı için çok önemlidir. Bu yöntem, epitel polarizasyon daha iyi anlaşılması için karşılaştırmalar sağlayan, diğer epitel hücreleri veya hidrojeller kistler oluşturmak için kullanılabilir. Bu kantitatif yöntem, ilaçların veya genetik mutasyonların safra fonksiyonu ve organogenez üzerindeki etkilerini test etmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of Aligned Functional Myocardial Tissue Through Microcontact Printing

Mikrokontak baskı sayesinde Bağlantısızlar Fonksiyonel Miyokard Doku Üretimi

Advanced heart failure represents a major unmet clinical challenge,  arising from the loss of viable and/or fully functional cardiac muscle  cells. ...

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Adenilat siklaz uyuşturucu kaynaklı Sensitizasyonu: Küçük Molekül ve siRNA Tarama Uygulamaları için Deney düzene ve minyatür

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

Bir Roman Vokal Fold Bioreactor İnşaatı ve Karakterizasyonu

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Fabrication and Characterization of a Conformal Skin-like Electronic System for Quantitative, Cutaneous Wound Management

Kantitatif, Deri Yara Yönetimi için bir konformal Cilt benzeri elektronik Sistemi İmalat ve Karakterizasyonu

Recent advances in the development of electronic technologies and biomedical devices offer opportunities for non-invasive, quantitative assessment of ...

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane (PDMS) Co-axial Flow Focus Device

Double Emulsion Generation Using a Polydimethylsiloxane PDMS Co-axial Flow Focus Device

Bir Polidimetilsiloksan (PDMS) Koaksiyel Akış Odak Aygıtı Kullanma Çift Emülsiyon Üretimi

Double emulsions are useful in a number of biological and industrial applications in which it is important to have an aqueous carrier fluid. This paper ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Geliştirilmesi 2D ve 3D Cilt<em&gt; İn Vitro</emMakromoleküler Dışlamasını Kullanma&gt; Modeller

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds

Decellularized Akciğer Yapı iskeleleri kullanarak ESC türetilmiş Fare Havayolu Epitel Hücreleri Üretimi

Lung lineage differentiation requires integration of complex environmental cues that include growth factor signaling, cell-cell interactions and ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nano-formülasyonları endotoksin tespiti Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) deneyleri kullanarak

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmünboyama ile Karakterizasyonu

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Yüksek Verimli Mikroakışkan Cihaz Kullanarak Dinamik ÇevreSel Koşulların Üretilmesi

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...