Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

وقد تم دعم هذا البحث من قبل التعاونية الإيكولوجية الميكروبية بتمويل من جائزة NSF #EPS-1655726.

1. مختبر مقاعد البدلاء وإعداد أداة لتحميل لوحة 96-جيدا
<ol><li>واضح أعلى مقاعد البدلاء عن طريق الضباب مع 70٪ الإيثانول. مسح والسماح للهواء الجاف قبل رش أعلى مقاعد البدلاء مع 10٪ التبييض. امسح أعلى مقاعد البدلاء الجافة.</li>
	<li>تعقيم ملعقة صغيرة، ملعقة، ومقص الجراحية (منحني) عن طريق غمس في 95٪ الإيثان...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

هذه الطريقة يقلل من فرص جيدا إلى جيد عبر التلوث أثناء تحميل عالية الإنتاجية عينات استخراج لوحات ويوفر وسيلة أكثر رقابة لتحميل 96-آبار لوحات وراء القائمة لوحات تحميل الاستراتيجيات9,10. التلوث بين الآبار يمكن أن يكون أكثر انتشارا في استخراج 96 جيدا لوحة من في عم?...

إن التقدم الذي تحقق مؤخراً في التسلسل عالي الإنتاجية للمجتمعات الميكروبية يوفر عمق تسلسل لا مثيل له، وبالتالي، لمحة غير مسبوقة عن أداء وتنوع ميكروبيوم الأرض1. كما يزيد القدرة على تعدد العينات أكثر وأكثر على مسار تسلسل واحد، استخراج الحمض النووي أنبوب واحد لديه القدرة على أن تصبح خطوة تحد من معدل في توليد البيانات البيئية. ومع ذلك ، طرق جديدة في استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية عقد الوعد لمعالجة كميات كبيرة من العينات البيئية مع كفاءة أكبر مما كان ممكنا في السابق2. وغالباً ما تنطوي هذه الطرق على استخدام 96 بئراً بدلاً من أنابيب واحدة، مما يزيد من العدد المحتمل من عمليات الاستخراج التي يمكن أن تحدث في وقت واحد. على هذا النحو، فإن التطبيق العملي والكفاءة من أساليب استخراج عالية الإنتاجية واضحة وقد تم تنفيذها لمعالجة العينات البيئية تتراوح بين التربة3،,4 والأنسجة النباتية3،,5 إلى البراز الإنسان2.
وفي حين أن هذه الطرق يمكن أن تسرع بشكل كبير على طول معالجة العينات واستخراج الحمض النووي، فإن الخطوة الأولية لتحميل التربة وعينات إيكولوجية أخرى في ألواح 96 بئراً معرضة للتلوث عبر العينات. يمكن أن يحدث هذا النوع من التلوث الجيد أثناء عمليات استخراج الحمض النووي,6و7و8، والآبار معرضة بشكل خاص في هذه الخطوة الأولى قبل تعليق العينات في محلول عازل. McPherson وآخرون9 شرح طريقة لتحميل التربة rhizosphere في 96-آبار لوحات باستخدام القمع و8-آبار PCR يغطي الشريط، ولكن في حين أن طريقتهم هو نهج أكثر رقابة على لوحات التحميل، فإنه لا يزال يوفر فرصة واسعة لتلوث الآبار المجاورة عند تحميل كل عينة. بالإضافة إلى ذلك، تسمح الآبار المفتوحة بفرصة للباحث المشتت لوضع عينة في البئر غير الصحيح أو إضافة عينة إلى بئر تم تحميله بالفعل. وبالإضافة إلى ذلك، مجموعة متنوعة من أنواع العينات يثبت أن غير مناسب للتحميل مع هذا الأسلوب; العينات الرطبة في كثير من الأحيان عصا إلى القمع والعينات الجافة "القفز" بين الآبار بسبب الكهرباء الساكنة.
للحد من فرص التلوث بين الآبار في الخطوة الأولى من استخراج الحمض النووي عالي الإنتاجية ، طورنا نهجًا جديدًا لتحميل عينات التربة في 96 بئرًا. لدينا أساليب حماية الآبار من التعرض البيئي ومنعنا من تحميل عينات متعددة بطريق الخطأ في بئر واحد (التحميل المزدوج). ونحن نعتقد أن الطريقة المذكورة أدناه تقدم وعدا للحد من احتمال التلوث وعلى هذا النحو يوفر وسيلة أكثر رقابة لتحميل 96 آبار للاستخلاص الحمض النووي اللاحقة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

وقد ساهمت تقنيات تسلسل الحمض النووي عالية الإنتاجية بشكل كبير في التقدم في فهمنا للعلاقات بين المجتمعات الميكروبية، وخصائص المضيف، ووظائف النظام الإيكولوجي الأوسع. مع هذه الزيادة السريعة في اتساع وعمق قدرات التسلسل قد حان أساليب لاستخراج وتضخيم وتحليل وتفسير الحمض النووي البيئي بنجاح مع أقصى قدر من الكفاءة. لسوء الحظ، يمكن أن يأتي إجراء عمليات استخراج الحمض النووي بسرعة على حساب زيادة خطر التلوث بين العينات. وعلى وجه الخصوص، فإن عمليات الاستخراج العالية الإنتاجية التي تستند إلى عينات موجودة في لوحة من 96 بئراً توفر طريقة سريعة نسبياً، مقارنة باستخراجات أحادية الأنبوب، ولكنها تزيد أيضاً من فرص التلوث العابر من البئر إلى الجيد. لتقليل خطر التلوث المتبادل بين العينات، مع الاحتفاظ بفوائد تقنيات الاستخراج عالية الإنتاجية، طورنا طريقة جديدة لتحميل العينات البيئية في ألواح 96 بئر. استخدمنا ختم PCR قابل للخرق لأفلام لتغطية كل لوحة أثناء تحميل العينات وأضاف عينات أولاً إلى أنابيب PCR قبل نقلها إلى الآبار؛ وهذه الممارسات معاً تقلل من خطر الانجراف العينة والتحميل المزدوج غير المقصود للآبار. وتوفر الطريقة المبينة في هذه الورقة للباحثين نهجاً لتحقيق أقصى قدر من تقنيات الاستخراج العالية الإنتاجية المتاحة مع الحد من خطر التلوث المتبادل الملازم للوحات 96 بئراً. نحن نقدم خطوة مفصلة من الخطوط العريضة لكيفية الانتقال من جمع العينات إلى استخراج الحمض النووي مع التقليل من خطر التلوث المتبادل غير المرغوب فيه.

تم استخدام هذه الطريقة الجديدة بنجاح لتحميل 96-جيدا لوحات استخراج الحمض النووي. وأظهرت المقارنة بين طرق تحميل الألواح أن لدينا طريقة أن يكون أدنى تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة. وكان تركيز الحمض النووي في الآبار الفارغة أقل بكثير من الطريقة المقترحة My McPherson et al.9 (p < 0.05)، ع?...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination at JoVE.com

Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

يمكن أن تكون الطرق الحالية لتحميل 96-صحون البئر لاستخراج الحمض النووي عرضة للتلوث. نحن تفاصيل طريقة جديدة لتحميل 96-آبار لوحات أن يقلل من خطر التلوث المتبادل بين الآبار. ستساعد طريقتنا الباحثين الآخرين على الاستفادة من كفاءة تقنيات استخراج الحمض النووي عالية الإنتاجية وتقليل خطر التلوث.

أساليب معدلة لتحميل عالية الإنتاجية ألواح استخراج الحمض النووي يقلل من احتمال التلوث

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

يوفر هذا البروتوكول تقنية لزيادة كفاءة 96-جيدا تحميل لوحة استخراج الحمض النووي dna بينما في الوقت نفسه خفض خطر التلوث عبر العينة. هذه التقنية يقلل من فرص التلوث خلال الخطوة الأولى الحرجة من استخراج الحمض النووي من خلال إضافة عينات فردية إلى كل بئر في لوحة 96 جيدا. ويمكن تطبيق هذه المنهجية على أي من المجالات المتنوعة للبحوث الميكروبيوم.قبل البدء في تجربة، ضباب أعلى مقاعد البدلاء مع 70٪الإيثانول. بعد المسح، والسماح لمقاعد البدلاء الهواء الجافة قبل رش مقاعد البدلاء مع 10٪التبييض. بعد المسح وتجفيف الهواء، تراجع المقص الجراحي المجهري، بصق، ومنحني في 95٪ الإيثانول وفضح الأدوات لهب.ثم تراجع كل أداة في 10٪ التبييض والسماح للأدوات لتجف الهواء. قبل أخذ العينات الفرعية، يعقم الإيثانول القفازات ويتجانس تمامًا عينات التربة. قم بعد ذلك بتعيين معرف عينة مع موقع جيد لكل أنبوب.ملء 95 وصفت اثنين من أنابيب أجهزة الطرد المركزي ملليلتر مع عينة واحدة لكل أنبوب، حتى كل أنبوب هو نصف كامل تقريبا. ينبغي استخدام الأنبوب 96 كفراغ الاستخراج. ضع أنابيب العينة الفرعية على الجليد، وتسمية 96 معقم 200 ميكرولتر أنابيب PCR مسطحة مسطحة وفقا لتسميات جيدا لطبقة 96-جيدا، ثم ضع التسمية 200 أنابيب ميكرولتر في النظام في رف 96 جيدا.لإعداد لوحة 96-well للتجربة، وإزالة الغطاء من لوحة ووضع الغطاء في كيس من البلاستيك العقيمة. ختم كيس لمنع التلوث وتغطية لوحة مع قطعة قبل قطع من ختم فيلم. ثم استخدام الأسطوانة المطاطية لتمسك بحزم الختم إلى لوحة وتخزين لوحة في أربع درجات مئوية.لنقل العينات الفرعية إلى اللوحة، ضع 24 من أنابيب العينة الفرعية المليلتر في كتلة ثلج للتخزين البارد، واستخدم اسم العينة وورقة موقع البئر لتحديد الأنابيب المناسبة المناسبة البالغة 200 ميكرولتر مسطحة. دوامة العينات الفرعية واحدة في كل مرة، لمدة خمس ثوان لكل عينة لضمان التجانس وتحميل ما يقرب من 200 ميكرولترات من كل عينة في أنبوب PCR المناسب. عندما تم تحميل جميع العينات 24، استخدم مسح الورق المنقوع المبيض لتنظيف خارج أنبوب PCR واحد، وعكس والاستفادة من أنبوب على مقاعد البدلاء لنقل العينة إلى أعلى الأنبوب.باستخدام الشعلة معقم ومبيض مقص مقطع الجزء السفلي من أنبوب PCR لإنشاء فتحة للعينة، وتمرير أنبوب على لوحة مع نهاية قطع التي تواجه حتى تم التوصل إلى البئر المناسبة. إمالة لوحة قليلا، لتسهيل ثقب فيلم ختم قبل قطع، ومع أنبوب مباشرة فوق البئر الصحيح، بسرعة ولكن عكس بعناية لوحة بحيث تلميح قطع يناسب في البئر. استخدام أداة تعقيم للاستفادة من الجزء العلوي من الأنبوب حتى كل من التربة قد سقطت من أنبوب في البئر.وترك الأنبوب في البئر مع الرصاص مغلقة. عندما تم تحميل جميع العينات بنفس الطريقة، وإزالة واحدة 200 ميكرولتر مسطحة توج أنبوب PCR وإضافة 750 ميكرولترات من محلول حبة للعينة جيدا. وضع 200 ميكرولتر مسطحة توج PCR أنبوب مرة أخرى إلى البئر دفع كل الطريق إلى أسفل إلى البئر.واستخدم شاربي لوضع علامة على الجزء العلوي من الأنبوب للإشارة إلى أنه تم تحميل البئر. عندما تم تحميل جميع الآبار مع الخرز إعادة الأنابيب عينة 24 إلى تخزين 20 درجة مئوية وإضافة 24 أنابيب جديدة دون عينة إلى كتلة الجليد، للسماح المجموعة التالية من العينات ليتم تحميلها في لوحة 96 جيدا كما أظهرت للتو. عندما تم تحميل جميع 95 من الآبار مع عينة والخرزة الحل، إضافة حل حبة فقط إلى البئر 96.إزالة جميع الأنابيب، وتمرير لهم أكثر من الآبار المغطاة فقط وإزالة بعناية الفيلم قابلة للثقب من لوحة. ثم نقل بعناية غطاء لوحة من كيس من البلاستيك إلى لوحة ووضع لوحة في 20 درجة مئوية حتى استخراج المخطط لها. وتبين مقارنة طرق تحميل الألواح أن الطريقة المُثبتة تؤدي إلى أدنى تركيز للحمض النووي داخل الآبار الفارغة.وباستخدام هذه الطريقة، كان تركيز الحمض النووي أقل بكثير عند استخدام الطريقة المقترحة من قبل ماكفرسون وآخرون. على الرغم من تركيز الحمض النووي بهذه الطريقة لم تكن مختلفة إحصائيا عن الطريقة الافتراضية qiagen. جميع الأساليب الثلاث، تنتج تركيزات الحمض النووي يعني تحت اثنين من نانوغرام لكل ميكرولتر.على الرغم من أن هذه الطريقة الجديدة فقط تنتج الآبار مع عدم وجود تركيز الحمض النووي قابل للقياس. لتقليل احتمال تسرب، والحفاظ على أنبوب 200 ميكرولتر تستقيم عند تحريكه على لوحة، إمالة لوحة وإدراج أنبوب في البئر الصحيح.

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

الايس كاب : منهج في تزايد Arabidopsis الطماطم والنباتات في لوحات 96 - جيدا لالرفيع المناولة التنميط الجيني

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

جيل من جودة عالية لونين القالب الحمض النووي مناعي لتسلسل عالية الإنتاجية (رقاقة وما يليها)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

التعافي من اسماك الزرد الكبار قلوب للتطبيقات عالية الإنتاجية

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

الإنتاجية العالية للكشف عن المغيرون الكيميائية من الجينات المشاركة ما بعد transcriptionally الخاضعة للرقابة

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

الإنتاجية العالية كريسبر ناقل البناء وتوصيف التعديلات الحمض النووي عن طريق توليد جذور الطماطم مشعر

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci

طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em

Bacterial symbionts form an intimate relationship with their hosts and confer advantages to the hosts in most cases. Genomic information is critical to ...

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

طريقة موحدة للتعقيم الفائق من بذور نبات

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

متوازي عالية الإنتاجية واحد جزيء واحد اختبار حركي لشق الحمض النووي الموقع محددة

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

High-Throughput Metabolic Profiling for Model Refinements of Microalgae

التنميط الأيضي عالي الإنتاجية لتحسينات نموذج الطحالب الدقيقة

Metabolic models are reconstructed based on an organism&#39;s available genome annotation and provide predictive tools to study metabolic processes at a ...