Name: modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination
Uploaded: 2020-06-03T14:45:00
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这项研究得到了微生物生态合作组织的支持，NSF奖资助#EPS-1655726。

1. 用于装载 96 井板的实验室台和工具准备
<ol><li>用 70% 乙醇雾化工作，清除台面。在用 10% 漂白剂喷洒工作台顶之前，请擦拭并让空气干燥。擦干工作台顶。</li>
	<li>通过浸入95%乙醇，然后暴露在火焰中，对微铲、铲子和手术剪刀（弯曲）进行灭菌。将每个浸在 10% 漂白剂中，并在使用前晾干。 注：每个样品之间应对工具进行灭菌。</li>
</ol>2. 子取样和样品制备
<ol><li>在亚采...

<ol>
	<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+communal+catalogue+reveals+Earth's+multiscale+microbial+diversity.">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. 551 (7681), 457-463 (2017).</li><li>Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+yield+and+accuracy+for+DNA+extraction+in+microbiome+studies+with+variation+in+microbial+biomass.">Improved yield and accuracy for DNA extraction in microbiome studies with variation in microbial biomass.</a> BioTechniques. 66 (6), 285-289 (2019).</li><li>Marotz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triplicate+PCR+reactions+for+16S+rRNA+gene+amplicon+sequencing+are+unnecessary.">Triplicate PCR reactions for 16S rRNA gene amplicon sequencing are unnecessary.</a> BioTechniques. 67 (1), 29-32 (2019).</li><li>Romdhane, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cover+crop+management+practices+rather+than+composition+of+cover+crop+mixtures+affect+bacterial+communities+in+no-till+agroecosystems.">Cover crop management practices rather than composition of cover crop mixtures affect bacterial communities in no-till agroecosystems.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1618 (2019).</li><li>Rochefort, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+environment+and+host+plant+genotype+on+the+structure+and+diversity+of+the+Brassica+napus+seed+microbiota.">Influence of environment and host plant genotype on the structure and diversity of the Brassica napus seed microbiota.</a> Phytobiomes Journal. 3 (4), 326-336 (2019).</li><li>Minich, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+and+understanding+well-to-well+contamination+in+microbiome+research.">Quantifying and understanding well-to-well contamination in microbiome research.</a> mSystems. 4 (4), 00186 (2019).</li><li>Walker, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lot+on+your+plate?+Well-to-well+contamination+as+an+additional+confounder+in+microbiome+sequence+analyses.">A lot on your plate? Well-to-well contamination as an additional confounder in microbiome sequence analyses.</a> mSystems. 4 (4), 00362 (2019).</li><li>Eisenhofer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contamination+in+low+microbial+biomass+microbiome+studies:+issues+and+recommendations.">Contamination in low microbial biomass microbiome studies: issues and recommendations.</a> Trends in Microbiology. 27 (2), 105-117 (2019).</li><li>McPherson, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+microbial+communities+in+soil,+rhizosphere,+and+roots+in+perennial+grass+Experiments.">Isolation and analysis of microbial communities in soil, rhizosphere, and roots in perennial grass Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (137), e57932 (2018).</li><li>Qiagen, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> easy PowerSoil HTP 96 Kit Handbook. , (2019).</li></ol>

这种方法减少了在装载高通量样品提取板时实现井对井交叉污染的机会，并提供了一种更可控的方法，可以装载超过现有板装量策略9、10的96,孔板。在96孔板提取中，井间污染比单管萃取更普遍，尤其是在自动6、7,7时，尽管没有在任何方法中进行过专门测试，但当提取板的油井在板装过程中保持打开状态时，...

微生物群落高通量测序的最新进展提供了无与伦比的测序深度，因此，对地球微生物群1的功能和多样性有着前所未有的一瞥。随着将越来越多的样品多能复用到单个测序通道上的能力增加，单管DNA提取有可能成为生成生态数据中速率限制的步骤。然而，高通量DNA提取中的新方法有望以比之前更高的效率处理大量环境样品。这些方法通常涉及使用96孔板而不是单管，从而增加可能同时发生的萃取量。因此，高通量萃取方法的实用性和效率明显，已用于处理从土壤3、4,和植物组织,3、5到人类粪便2等环境样品。4
虽然这些方法可以显著加快样品处理和DNA提取的速度，但将土壤和其他生态样品装入96孔板的初始步骤容易受到交叉样品污染。这种类型的井井污染可能发生在DNA提取6，7，8，,8和井特别脆弱，在这第一步样品悬浮在缓冲溶液之前。6,McPherson等人演示了一种使用漏斗和8孔PCR带盖将土壤装入96孔板的方法，但是，虽然它们的方法是一种更可控的装载板的方法，但它仍然为装载每个样品时邻近井的污染提供了充足的机会。此外，开放式井允许分心的研究人员将样品放入不正确的井中，或将样本添加到已加载的井中。此外，各种样品类型证明不适合用这种方法加载;由于静电，湿样品通常粘在漏斗和干样品之间"跳跃"。
为了在高通量DNA提取的第一步减少油井污染的机会，我们开发了一种将土壤样品装入96孔板的新方法。我们的方法既保护油井免受环境暴露，又可防止我们意外地将多个样品装进一个油井（双装）。我们相信，下面报告的方法有望减少污染的可能性，因此提供了一种更可控的方法，用于加载96孔板，以便随后提取DNA。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 oz WhirlPak</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>B01065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well PowerSoil DNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>12955-4</td>
			<td>We used a soil extraction kit but any 96-well format kit would work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 2 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 2 mL tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice block for 200 &#181;L micro-PCR tubes</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any ice block made for 200 &#181;L tubes will work</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scoopula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precut Pierceable Sealing Film</td>
			<td>Excel Scientific</td>
			<td>XPS25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Any</td>
			<td>Any</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified methods for loading of high-throughput dna extraction plates reduce potential for contamination

高通量DNA测序技术极大地促进了我们对微生物群落之间的关系、宿主特性和更广泛的生态系统功能的理解。随着测序能力的广度和深度的迅速提高，人们以最高效率成功提取、放大、分析和解释环境DNA的方法。不幸的是，快速进行DNA提取可能会增加样品污染风险。特别是，与单管萃取相比，基于 96 井板中所含样品的高通量萃取提供了相对快速的方法，但也增加了井中交叉污染的机会。为了最大限度地降低样品交叉污染的风险，同时保留高通量萃取技术的好处，我们开发了一种将环境样品装入 96 孔板的新方法。我们使用可穿透的PCR密封膜覆盖每个板，同时加载样品，并首先将样品添加到PCR管，然后再将它们移动到井中;这些做法共同降低了样品漂移和意外双载井的风险。本文概述的方法为研究人员提供了一种方法，以最大限度地提高可用的高通量提取技术，同时降低96孔板固有的交叉污染风险。我们提供了如何从样品收集到DNA提取的详细分步概述，同时最大限度地降低不必要的交叉污染风险。

这种新方法成功地用于装载96孔DNA提取板。对板载荷方法的比较表明，该方法在空白井中DNA浓度最低。空白井中的DNA浓度明显低于我提出的McPherson 等人9（p<0.05）的方法，尽管我们方法中的DNA浓度与Qiagen默认方法（图2）没有统计学上的不同。所有三种方法产生的DNA均在2纳克/μL以下，尽管只有我们新方法生产出没有可测量DNA浓度的井。
<p class="jove_content" f...

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Modified Methods for Loading of High-Throughput DNA Extraction Plates Reduce Potential for Contamination

目前装载 96 孔板进行 DNA 提取的方法容易受到污染。我们详细介绍了一种装载96孔板的新方法，该方法可降低井中交叉污染的风险。我们的方法将帮助其他研究人员利用高通量DNA提取技术的效率，并最大限度地降低污染风险。

改进的高通量DNA提取板加载方法，降低污染的可能性

High-throughput DNA sequencing techniques have contributed substantially to advances in our understanding of relationships among microbial communities, ...

该协议为提高96井DNA提取板加载效率提供了一种技术，同时降低了样品交叉污染的风险。该技术通过向 96 井板中的每一个井单独添加样品，在 DNA 提取的关键第一步中减少污染的机会。这种方法可应用于微生物群研究的任何不同领域。在开始实验之前，用70%乙醇雾化工作台顶。擦拭后，让长凳风干，然后用10%的漂白剂喷洒工作台。擦拭和空气干燥后，将微镜、铲子和弯曲的手术剪刀浸入 95% 乙醇中，将工具暴露在火焰中。然后将每个工具浸入 10% 漂白剂中，让工具风干。在进行亚采样之前，乙醇对手套进行消毒，使土壤样品完全均质化。接下来为每个管分配一个具有井位置的示例 ID。将 95 标有两毫升离心管，每管一个样品，直到每个管大约半满。第 96 管应用作提取空白。将亚样品管放在冰上，根据 96 井板的井标标签，将 96 个无菌 200 微升平盖 PCR 管贴上标签，然后将标签 200 微升管按顺序放在 96 井机架中。要为实验准备 96 孔板，请从板上取下盖子，将盖放入无菌塑料袋中。密封袋子以防止污染，用预切的可刺穿密封膜盖住板。然后使用橡胶辊将密封件牢牢地固定在板上，并在四摄氏度下存放板。要将亚样品转移到板材中，请将两毫升亚样品管中的 24 个放入冰块中进行冷库，并使用样品名称和井位表选择相应的 200 微升平顶管。一次一次对子样品进行涡流，每个样品5秒钟，以确保均质化，将每个样品的约200微升加载到相应的PCR管中。当所有 24 个样品都已加载后，使用漂白浸泡的纸擦拭来清洁一个 PCR 管的外端，然后反转并敲击工作台上的管子，将样品移动到管的顶部。使用火焰灭菌和漂白剪刀夹住 PCR 管的底部，为样品创建开口，并在切割端朝上，直到到达适当的孔之前将管子穿过板。稍微倾斜板，便于刺穿预切割的可刺穿密封膜，并用管直接上方正确的井，快速但小心地反转板，使切割尖端适合井。使用消毒工具敲击管的顶部，直到所有土壤从管子掉入井中。将管子留在井中，将铅闭合。当所有样品均以相同方式加载时，拆下一个 200 微升平盖 PCR 管，并将 750 微升珠溶液添加到样品井中。将 200 微升平盖 PCR 管放回井中，一直向下推入井中。并使用夏皮标记管的顶部，以指示井已加载。当所有井都装有珠子后，将 24 个样品管返回 20 摄氏度的存储，并在冰块中添加 24 个新的亚样品管，以便像刚才所示，将下一组样品装入 96 孔板中。当所有 95 口油井都装有样品和珠子溶液时，仅向第 96 口油井添加珠子溶液。拆下所有管子，仅将其穿过覆盖的孔，并小心地从板中取下可刺穿的薄膜。然后小心地将板盖从塑料袋转移到板上，将板在 20 摄氏度处放置，直到按计划提取。对板载荷方法的比较表明，所演示的方法在空白井中产生最低的DNA浓度。使用这种方法，DNA浓度明显低于使用麦克弗森等人提出的方法。虽然该方法的DNA浓度与齐根默认方法在统计学上没有差异。这三种方法，产生平均DNA浓度低于两纳米每微升。虽然只有这种新方法产生没有可测量DNA浓度的井。为了尽量减少溢出的可能性，在将 200 微升管在板上移动时保持直立，倾斜板并将其插入正确的井中。

Research

JoVE Journal

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